堆肥提取液诱导草莓对黄萎病抗性及抑菌机理研究.pdf

342294-302 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期 2017-11-16 基金项目 山西省科技攻关项目（ 20150313003-5） ；山西省农业科学院攻关项目（ ygg1512） ；山西省农业科学院博士研究基金（ YBSJJ1411） 作者简介 李欣欣，助理研究员， E-mail lixinxin_； *通信作者，博士，教授， E-mail 。 DOI 10.16409/ki.2095-039x.2018.02.018 堆肥提取液诱导草莓对黄萎病抗性及抑菌机理研究 李欣欣1,2，王秀红2，史向远2，籍增顺2，李志强2，张生万1*（ 1. 山西大学生命科学学院，太原 030006； 2. 山西省农业科学院现代农业研究中心，太原 030031） 摘要 为了明确菌糠堆肥提取液的生物防治效果，进一步探讨其抑菌防病机理，以便于有针对性地利用堆肥提取液达到防病、治病的效果。采用体内和体外 2 种试验方法，以草莓黄萎病菌为靶标病原菌，研究了堆肥提取液原液、高温灭菌液和过滤除菌液对大丽轮枝菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用，通过温室盆栽试验验证其对草莓黄萎病的防病促生效果，并测定根施堆肥提取液对草莓叶片内防御酶系的影响。研究表明，堆肥提取液对病原菌菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用，抑制率分别为 92.43和82.94，经高温灭菌和过滤除菌后抑制效果显著降低。盆栽试验结果表明，预先用堆肥提取液灌根处理对草莓黄萎病的防治效果高达 42.23，且能诱导草莓叶片内防御酶活性显著增强，接病原菌后第 6 d 该处理下的 POD 和 PPO 活性分别比施清水对照提高了 45.45和 39.47，而 MDA 含量则下降了 14.83。说明微生物对病原菌的直接抑制作用以及诱导系统抗性是菌糠堆肥提取液发挥抑菌防病功效的主要因素。 关 键 词 菌糠堆肥提取液；草莓黄萎病；诱导抗性；作用机理 中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 1005-9261201802-0294-09 Induced Resistance in Strawberry against Verticillium Wilt by Compost Tea and Its Inhibition Mechanism LI Xinxin1,2, WANG Xiuhong2, SHI Xiangyuan2, JI Zengshun2, LI Zhiqiang2, ZHANG Shengwan1*1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Research Center of Modern Agriculture, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China Abstract We investigated the biocontrol potential of the tea produce from spent mushroom substrate compost for the control of strawberry Verticillium wilt caused by Verticillium dahliae, which is in order to make target use of compost tea to the achievement of disease prevention and treatment. In vitro and in vivo experiments were carried out to determine the mechanisms involved in suppression of V. dahliae. Non-sterilized, heat-sterilized and filter-sterilized compost teas were tested on the inhibition of mycelial growth and conidial germination of V. dahliae. Glasshouse trials were conducted to uate the control efficiency of compost tea against strawberry Verticillium wilt and plant growth-promoting effect, and to test for the ability of the compost tea to induce the production of defense-related enzymes. The highest percentage of inhibition in mycelial growth and conidial germination was obtained by the non-sterilized compost tea with values of 92.43 and 82.94, respectively. The inhibitory efficacy was reduced significantly when the tea was heat-sterilized or filter-sterilized. Pot tests indicated that the control effect of Verticillium wilt was 42.23 when strawberry plants were pre-treated with compost tea. There was a significant increase in defense enzymes when the pre-treated strawberry plants were challenged with V. dahliae. The activities of POD and PPO were increased by 45.45 and 39.47 respectively as compared with the control, while the content of MDA decreased by 14.83 on the sixth day after inoculation. It was therefore suggested that the SMS compost tea suppress pathogen through direct inhibition of microorganisms and primed systemic resistance. 第 2 期 李欣欣等堆肥提取液诱导草莓对黄萎病抗性及抑菌机理研究 295 Key words compost tea of spent mushroom substrate SMS; strawberry Verticillium wilt; induced systemic resistance; action mechanism 草莓黄萎病是由大丽轮枝菌 Verticillium dahliae 引起的土传性植物维管束萎蔫病害，几乎遍及全球各主要草莓产区。该病原菌侵染力强，寄主范围广，传播途径复杂，受感染植株生长发育受阻，产量和品质严重下降，已成为制约草莓产业发展的瓶颈。因缺乏有效的抗病种质资源，生产中常使用溴甲烷等化学药剂防治草莓黄萎病，但存在农药残留、抗药性和环境污染等问题，已被世界大多数国家禁止使用；轮作倒茬等农艺措施虽有一定的效果，但难以适应中国集约化的农业种植模式。因此，研究探索新的防治途径与方法已成为草莓产业亟需解决的问题。 20 世纪 60 年代以来，国内外有关利用农业废弃物来源的有机改良剂来防病促生的研究方兴未艾。其中堆肥提取液是在腐熟堆肥的基础上用不同方法制备出的水性提取物，不仅能改善土壤微生物环境，提高农作物产量和品质， 而且对多种土传病原真菌有明显的抑制作用， 因此可作为有机液肥推广使用[1,2]。马利平等[3,4]的研究发现马、牛和猪粪沤肥浸提液能显著减少黄瓜霜霉病、白粉病以及青椒枯萎病的发生。 Diánez 等[5]通过离体试验观察到好气葡萄渣堆肥提取液对寄生疫霉 Phytophthora parasitica、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum、大丽轮枝菌 Verticillium dahliae 等多种植物病原菌有显著的抑制效果。 Naidu 等[6]的研究发现，添加酵母提取物和腐殖酸能使油棕果实废弃物堆肥提取液对二孢白粉菌 Golovinomyces cichoracearum 孢子萌发的抑制率提高到 85，且对甜瓜白粉病的防治效果等同于杀真菌菌剂。但是目前尚未见有关利用堆肥提取液来防治草莓土传病害的相关研究报道。 受堆肥自身原料来源、腐熟程度以及提取方式的不同，应用堆肥提取液来防治植物病害的效果仍存在争议，且提取液中含有的抑菌活性物质成分和功能微生物组成尚不清楚。本研究以菌糠堆肥（ compost of spent mushroom substrate， SMS）为原料，研究其液态提取物对草莓黄萎病的生物防治效果，并进一步探讨其抑菌机理，以期为高效、安全的功能性液体有机肥料的开发和应用提供理论依据和技术支持。 1 材料与方法 1.1 供试材料 堆肥由白灵菇菌糠和牛粪腐熟而成，质量比为 101。有机质（ OM） 45.83；全氮（ TN） 1.87；全磷（ TP） 1.24；全钾（ TK） 0.96。 病原菌草莓黄萎病菌 Verticillium dahliae 购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。 草莓品种为“波特拉”，由山西好乐农业开发有限公司提供。 1.2 堆肥提取液的制备 原液取匀质化的堆肥和自来水（使用前通气 10 h，以去除水中的氯酸根）按照 14（ w/v）的比例放入聚乙烯塑料桶中，充分混匀后持续通气，使提取液的溶解氧（ DO）含量不低于 62.00， 25 ℃下暗培养3 d 后用双层纱布过滤收集滤液，即为菌糠堆肥提取液。 无菌处理液 1）高温灭菌液，堆肥提取液在 121 ℃下灭菌 20 min； 2）过滤除菌液，堆肥提取液先后用 0.45 和 0.22 μm PES 材质的滤膜过滤除菌。 1.3 对草莓黄萎病菌菌丝生长的抑制作用 菌饼的制备挑取在试管斜面上保存的大丽轮枝菌转接至 PDA 平板上， 25 ℃恒温培养 7 d，用直径为 5 mm 的打孔器沿菌落边缘打孔取菌饼备用。 抑菌试验采用打孔粘贴法。取预先融化并保温至 45～ 50 ℃的 PDA 培养基 20 mL，加入 2 mL 原液或无菌处理液，充分混匀后倒平板。待凝固后在平板中央接种草莓黄萎病菌菌饼（ Ф＝ 5 mm），菌丝面朝上，置于 25 ℃恒温培养箱培养。对照用等量无菌水代替，其余操作均相同。当对照组病原菌菌丝长满整个培养平板时试验即停止，测量不同处理下病原真菌的菌落直径，每处理设 3 个重复。菌丝生长抑制率（ ）＝（对照菌落直径－处理菌落直径） /对照菌落直径 100。 296 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 1.4 对大丽轮枝菌分生孢子萌发的影响 分生孢子悬液的制备用 10 mL 无菌水冲洗并刮取培养 15 d 的黄萎病菌菌落， 4 层无菌纱布过滤除去菌丝，取滤液在 4000 r/min 下离心 10 min，弃上清液，将分生孢子重悬于无菌水中[7]，重复该步骤两次，并调节孢子浓度至 1 105cfu/mL。 取原液和无菌处理液分别在 4 ℃、 2000 r/min 下离心 20 min，收集上清液备用。吸取 40 μL 上清液和10 μL 分生孢子悬液加入灭过菌的有凹圆载玻片上，将载玻片放在培养皿内，皿底铺无菌湿润的滤纸保湿，置于 25 ℃恒温黑暗培养。每处理设 3 个重复，对照用等量无菌水代替。之后每隔 6 h 于 40 倍显微镜下观察各处理分生孢子的萌发情况，即在每个视野中随机检查 100 个分生孢子，以芽管长度超过孢子直径长度一半作为萌发标准[8]。萌发率（ ）＝（萌发孢子数 /总孢子数） 100；孢子萌发抑制率（ ）＝（对照孢子萌发率－处理孢子萌发率） /对照孢子萌发率 100。 1.5 对盆栽草莓的防病促生效果研究 在山西省农业科学院日光温室内进行。选取 2 叶 1 心的健康草莓幼苗，移栽入装有 500 g（ 121 ℃灭菌 1 h） 进口泥炭土的盆钵中， 缓苗 14 d 后以伤根灌注法接种大丽轮枝菌孢子悬液 （浓度为 1 107cfu/mL） ，接种量为 50 mL/株。试验共设 5 个处理（ 1） T1，接病原菌 3 d 前施堆肥提取液；（ 2） T2，接病原菌当天施堆肥提取液；（ 3） T3，接病原菌 3 d 后施堆肥提取液；（ 4） T4，待病情爆发后施堆肥提取液；（ 5）CK，施等量清水为对照。施用量为 200 mL/株，之后每隔 7 d 灌根 1 次，共处理 13 次。每处理 3 次重复，每重复种植 10 盆，试验盆钵采用完全随机排列。 1.5.1 温室病情调查和统计 处理 90 d 后，调查病叶发生情况，对植株进行病情分级。 0 级健株，叶片无病状； 1 级不超过 25叶片表现病状，颜色为黄色或有不规则形的黄色病斑； 2 级 26～ 50叶片显病状，颜色变为黄色或黄褐色，叶片边略有卷枯； 3 级 51～ 75叶片表现病状，少数叶片凋落； 4 级76以上叶片发病，严重时甚至整株枯死。病情指数＝Σ（各级病株数相应病级） /（总株数最高病级） 100；防治效果（ ）＝（对照病情指数－处理病情指数） /对照病情指数 100。 1.5.2 草莓植株生物学性状测定 每处理随机挖取 10 株草莓苗，调查株高，茎粗，中心展开叶往外数第 3叶的叶柄长、叶柄粗、叶面积、叶绿素相对含量，以及茎叶干重和根干重。 1.6 对草莓植株抗氧化系统的影响 选取 4 叶期，长势一致、健壮的草莓幼苗进行移栽。试验共设 4 个处理 1）施清水对照（ CK）； 2）单施堆肥提取液（ T）； 3）施清水 72 h 后接种草莓黄萎病菌（ V）； 4）施堆肥提取液 72 h 后接种草莓黄萎病菌（ T＋ V）。每个处理重复 3 次，每个重复 10 株幼苗。黄萎病菌孢子悬液的接种量为 20 mL/株，孢子浓度为 1 107 cfu/mL。处理后第 0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14 d 随机取相同部位的草莓叶片，用去离子水冲洗干净后以滤纸吸干表面水分，每个重复精确称取 0.5 g，用液氮快速冷冻后置于- 80 ℃超低温冰箱中保存备用。 过氧化物酶（ POD）活性测定采用愈创木酚法，以每分钟 470 nm 处 OD 值变化 0.01 为 1 个酶活性单位（ U）[9]；多酚氧化酶（ PPO）活性测定采用邻苯二酚法，以每分钟 420 nm 处 OD 值变化 0.01 为 1 个酶活性单位（ U）[10]；丙二醛（ MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[11]。 1.7 数据统计与分析 采用 Excel 2010 对试验数据进行统计分析，计算平均值和标准差。以 SPSS 21.0 统计分析软件进行方差分析，并用 Duncan’s 多重比较法进行差异显著性检验。 2 结果与分析 2.1 堆肥提取液对草莓黄萎病病原真菌的作用 2.1.1 对菌丝生长的抑制作用 大丽轮枝菌在含不同处理液的培养基上的生长状况如表 1 所示，菌丝在含原液培养平板上的生长速度显著低于对照处理，且随培养时间的延长抑制作用持续增强，到 15 d 时的菌丝生长抑制率达到了 92.43； 121 ℃高温灭菌后，其对大丽轮枝菌的抑制作用减弱，相比原液处理下降了约84.42～ 88.03，但仍显著高于过滤除菌后的抑制率；堆肥提取液用 0.22 μm 的滤膜过滤后，基本丧失了 第 2 期 李欣欣等堆肥提取液诱导草莓对黄萎病抗性及抑菌机理研究 297 表 1 堆肥提取液对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of compost tea on mycelial growth of V. dahliae in vitro 菌落直径 Colony diameter mm 抑制率 Inhibition rate 处理 Treatment 5 d 10 d 15 d 5 d 10 d 15 d 对照 Sterilized water control 29.07± 0.32 53.80± 0.20 70.93± 1.21 - - - 原液 Non-sterilized compost tea 5.10± 0.10 5.33± 0.42 5.37± 0.38 82.46± 0.34 a 90.09± 0.77 a 92.43± 0.53 a 高温灭菌液 Heat-sterilized compost tea 25.33± 0.23 48.00± 0.50 62.57± 0.75 12.85± 0.79 b 10.78± 0.93 b 11.79± 1.06 b 过滤除菌液 Filter-sterilized compost tea 27.97± 0.31 51.90± 0.36 69.13± 1.03 3.80± 1.05 c 3.53± 0.67 c 2.53± 1.45 c 注表中数据为平均值±标准差，同列带不同字母的数据表示在 0.05 水平下差异显著。下同。 Note Data were mean± SD, within a column, data with different lowercase letters were significantly different according to Duncan’s multiple range test at 0.05 level. The same below. 对病原菌菌丝生长的抑制作用，抑制率介于 2.53～ 3.80。 经培养后在含原液的培养平板上布满了不同类型的微生物菌落，其中不乏芽胞杆菌 Bacillus spp.、木霉菌 Trichoderma spp.、假单胞菌 Pseudomonas spp.和链霉菌 Streptomyces spp.等种类，它们通过竞争、拮抗、寄生和诱导植物抗性等作用能对病原菌起到很强的抑制作用；用微孔滤膜过滤除菌后，不仅微生物菌体被去除，发酵过程中产生的抗生素、细胞壁水解酶、腐殖酸等大分子量的化合物也会被截留出来，故对病原真菌菌丝生长起不到抑制作用；经高温灭菌处理后，虽然微生物菌体被破坏，但液体中仍保留了某些大分子量、热稳定的微生物次级代谢产物或抑菌活性物质，能破坏大丽轮枝菌生长点，引起菌丝消解（图 1）。同时在镜检时发现，在无菌水对照中，分生孢子呈椭圆形且无色透明，可由细胞两端正常分化形成菌丝状的芽管（图 2A）。在原液和高温灭菌液处理下，分生孢子和芽管多呈不规则畸形。分生孢子细胞肿胀变形（图 2B）；芽管萌发受阻，在基部、中间及顶部发生局部膨大并扭曲变形，或在一端分化形成多个分支（图 2C）。 ABCDA无菌水对照 Sterilized water control； B原液 Non-sterilized compost tea； C高温灭菌液 Heat-sterilized compost tea； D过滤除菌液 Filter- sterilized compost tea 图 1 不同处理对大丽轮枝菌菌丝生长的影响 Fig. 1 Inhibitory effect of different treatments on mycelial growth of V. dahliae ABCA无菌水对照 Sterilized water control； B原液 Non-sterilized compost tea； C高温灭菌液 Heat-sterilized compost tea 图 2 不同处理下大丽轮枝菌分生孢子及芽管形态 Fig. 2 Germinated conidia with germ tubes magnification 1000 2.1.2 对分生孢子萌发的影响 大丽轮枝菌分生孢子的萌发率随时间的延长不断增加，并趋于稳定。在无菌水对照中， 18 h 时的萌发率已达 95.67（图 3）。加入原液和无菌处理液后，芽管的萌发和伸长受到了不同程度的抑制，其中用原液处理后的抑制率显著高于其他处理， 12 h 时的抑制率为 82.94；其次为高温298 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 灭菌处理，抑制率 39.98～ 55.40；过滤除菌液对孢子萌发的抑制作用最弱， 24 h 时约有 87.00的分生孢子已萌发，抑制率为 12.71（图 4）。 aaaaddddbbbbcccc01020304050607080901000 6 12 18 24培养时间 Incubation time h萌发率Germination rate 对照 Sterilized water control原液 Non-sterilized compost tea过滤除菌液 Filter-sterilized compost tea高温灭菌液 Heat-sterilized compost tea图 3 堆肥提取液对大丽轮枝菌分生孢子萌发的影响 Fig. 3 Influence of compost tea on conidial germination of V. dahliae 抑制率Inhibition rate 图 4 堆肥提取液对大丽轮枝菌分生孢子萌发的抑制效果 Fig. 4 Effect of compost tea on inhibition of conidial germination of V. dahliae 2.2 堆肥提取液对盆栽草莓的防病促生效果 2.2.1 对草莓黄萎病的防治效果 施堆肥提取液与施清水对照相比，草莓黄萎病病情指数显著降低，其中以对照组的病情指数最高，处理 90 d 后达 75.00。不同施用时间对草莓黄萎病的防控效果存在显著差异，预先用堆肥提取液灌根处理下的病情指数最低为 43.33，其防治效果高达 42.23；其次为接菌当天及接菌3 d 后施堆肥提取液处理，防效分别为 34.44和 30.00；接菌 20 d 时草莓外围叶缘表现出发黄、卷曲、萎蔫等病症，此时施堆肥提取液对黄萎病的防控效果最差，仅为 18.89。由此可知，用堆肥提取液灌根能有效防治草莓黄萎病，且这种作用是预防性而非治疗性的（表 2）。 表 2 不同处理对草莓黄萎病的防治效果 Table 2 Disease index and control effect of different treatments on strawberry Verticillium wilt under greenhouse condition 处理 Treatment 病情指数 Disease index 防治效果 Control effect 对照 Water control 75.00± 4.33 a - 接病原菌 3 d 前施堆肥提取液 Compost tea applied 3 d prior to inoculation 43.33± 1.44 d 42.23± 1.92 a 接病原菌当天施堆肥提取液 Compost tea applied simultaneously with inoculation 49.17± 2.89 c 34.44± 3.85 b 接病原菌 3 d 后施堆肥提取液 Compost tea applied 3 d after inoculation 52.50± 2.50 c 30.00± 3.33 b 病情爆发后施堆肥提取液 Compost tea applied after disease outbreak 60.83± 2.89 b 18.89± 3.85 c 2.2.2 对盆栽草莓生长状况的影响 不同处理下草莓植株生长状况存在显著差异，对照组植株在黄萎病菌的胁迫下，生长发育受阻、株型较小，株高和茎粗仅为 11.67、 1.43 cm。经堆肥提取液处理过的植株，其生长状况显著优于对照，以 T1 处理的促生作用最为明显，其株高、茎粗、叶柄长、叶柄粗、叶面积、叶绿素相对含量分别比对照增加了 41.65、 37.61、 44.73、 29.37、 48.39和 17.90。处理 90 d 时， T1处理的地上部和地下部干重相比对照提高了 57.14和 73.94；其次为 T2、 T3 处理，分别提高了 43.39、54.55和 33.07、 40.61；以 T4 处理的增重最少。综合以上分析，根施堆肥提取液能促进叶绿素的合成，有助于改善草莓植株的营养生长状况（表 3）。 2.3 堆肥提取液对草莓叶片内防御酶系的影响 2.3.1 对过氧化物酶活性的影响 本研究分别用堆肥提取液、黄萎病菌孢子悬液以及清水刺激草莓根部，并检测草莓叶片内防御酶活性的变化。大量研究已证明大丽轮枝菌侵染植株后会引起防御酶活性的提高[12]。草 第 2 期 李欣欣等堆肥提取液诱导草莓对黄萎病抗性及抑菌机理研究 299 表 3 不同处理对盆栽草莓植株的促生作用 Table 3 Growth promoting effect of different treatments on strawberry plant by pot experiment 处理 Treatment 测定指标 Plant characteristic CK T1 T2 T3 T4 株高 Plant height cm 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 11.67± 0.82 e - 16.53± 0.96 a 41.65 15.23± 0.97 b 30.50 14.09± 0.88 c 20.74 13.11± 0.81 d 12.34 茎粗 Stem diameter mm 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 14.33± 0.62 e - 19.72± 0.78 a 37.61 18.74± 0.95 b 30.77 17.61± 0.88 c 22.89 16.50± 0.85 d 15.14 叶柄长 Petiole length cm 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 6.93± 0.96 e - 10.03± 0.55 a 44.73 9.41± 0.58 b 35.79 8.80± 0.55 c 26.98 7.89± 0.59 d 13.85 叶柄粗 Petiole diameter mm 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 2.69± 0.34 d - 3.48± 0.12 a 29.37 3.25± 0.17 b 20.82 3.15± 0.21 bc 17.10 2.97± 0.17 c 10.41 叶面积 leaf area cm2 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 21.43± 3.21 d - 31.80± 1.93 a 48.39 28.30± 1.79 b 32.06 27.82± 2.53 b 29.82 25.45± 2.46 c 18.76 叶绿素相对含量 SPAD 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 53.53± 1.20 e - 63.11± 1.68 a 17.90 61.07± 1.85 b 14.09 59.49± 1.72 c 11.13 57.16± 1.84 d 6.78 茎叶干重 Steam and leaf dry weight g 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 3.78± 0.20 e - 5.94± 0.33 a 57.14 5.42± 0.24 b 43.39 5.03± 0.37 c 33.07 4.47± 0.38 d 18.25 根干重 Root dry weight g 测定值 Measured value 增率 Growth rate CK 1.65± 0.10 e - 2.87± 0.19 a 73.94 2.55± 0.20 b 54.55 2.32± 0.29 c 40.61 1.93± 0.25 d 16.97 注 CK，清水对照； T1，接病原菌 3 d 前施堆肥提取液； T2，接病原菌当天施堆肥提取液； T3，接病原菌 3 d 后施堆肥提取液； T4，病情爆发后施堆肥提取液。增率 CK（ ）为处理相比对照提高的百分率。同行带不同字母的数据表示在 P＜ 0.05 水平下差异显著。 Note CK, water control; T1, compost tea applied 3 d prior to inoculation; T2, compost tea applied simultaneously with inoculation; T3, compost tea applied 3 d after inoculation; T4, compost tea applied after disease outbreak. Growth rate CK represented the percentage increase of the treatment compared with the control. Within a row, values with different letters are significantly different according to Duncan´s multiple range test at P＜ 0.05. 莓幼苗接种黄萎病菌后， POD 活性大小随时间变化呈先上升后下降的趋势，并在接病后第 6 d 达到峰值，为 806.67 U/（ g·min）（图 5）；受病原菌胁迫时，预先用堆肥提取液灌根处理能显著提高叶片的 POD 活性，在第 6 d 时升高至 1173.34 U/（ g·min），相比单施孢子悬液处理提高了 45.45；单施堆肥提取液处理下的 POD 活性变化呈缓慢下降趋势，且在初期（ 0～ 4 d）略高于施清水处理，分别是对照的 1.59、 1.32 和1.44 倍，在中后期（ 6～ 14 d）同对照相比差异不显著（图 5）。 2.3.2 对多酚氧化酶活性的影响 不接种病原菌时，单施堆肥提取液与施清水对照相比，草莓叶片内的PPO 活性变化趋势较为平缓且无显著差异，变化范围为 216.67～ 366.67 U/（ g·min）；受到病原菌侵染时，叶片内的 PPO 活性迅速升高，并在第 6 d 时达到最大值，为 1131.67 U/（ g·min），随后逐渐下降；自接入病原菌的第 2 d 起，预先用堆肥提取液灌根处理下的 PPO 活性显著高于其他组处理，相比单施黄萎病菌孢子悬液处理提高了约 36.50～ 81.57。综上所述，在未受到病原菌侵染时，单施堆肥提取液并不能激活植株自身防御反应； 挑战接种病原菌后， 预先用堆肥提取液灌根能显著提高植株体内防御相关酶系的表达，以阻止病原菌进一步侵染（图 5）。 2.3.3 对丙二醛含量的影响 在未受到病原菌胁迫时，单施堆肥提取液处理下草莓叶片内的 MDA 含量与清水对照相比差异不大，不超过 3.99 μmol/g，在进行伤根处理后 10 d 内 MDA 含量呈上升下降趋势，此后趋于稳定；黄萎病菌侵染导致草莓植株膜脂过氧化程度增高，叶片中 MDA 含量在接种后第 4 d 迅速升高至 6.48 μmol/g，是清水对照的 1.71 倍；预先用堆肥提取液灌根能减轻细胞受损伤程度，在接种后第 2、4、 6 d 时叶片 MDA 含量较单施病原菌处理分别降低了 17.02、 22.81和 14.83。说明施堆肥提取液有助于抑制植株体内细胞膜脂过氧化过程，减少细胞损伤从而减轻病情（图 5）。 3 讨论 许多研究结果表明，堆肥提取液作为一种有机改良剂，能有效地抑制某些叶传和土传病害，具有“肥药合一”的作用。但具体是何种功能物质成分或通过何种方式起到关键作用，目前尚无统一定论。一些研 300 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 cbcccccaaaaaaaaacbcccccababbbbba2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.502468101214接种后天数 Days after inoculation dCK V T T＋ Vcccccccabbbbbbbacccccccaaaaaaaaa0200400600800100012001400160018000 2 4 6 8 10 12 14接种后天数 Days after inoculation dcccccdccbbbbbbbccccccccbaaaaaaaa020040060080010001200140002468101214接种后天数 Days after inoculation d注 CK，施清水对照； T，单施堆肥提取液； V，施清水 72 h 后接种草莓黄萎病菌； T＋ V，施堆肥提取液 72 h 后接种草莓黄萎病菌。 Note CK, strawberry plants pre-treated with water; T, strawberry plants pre-treated with compost tea; V, strawberry plants pre-treated with water and challenged with V. dahliae; T＋ V, strawberry plants pre-treated with compost tea and challenged with V. dahliae. 图 5 不同处理对草莓叶片过氧化物酶（ POD）、多酚氧化酶（ PPO）活性和丙二醛（