文心兰RFNR的克隆、亚细胞定位及其与LFNR不同的胁迫响应机制研究.pdf

园艺学报， 2018， 45 11 2164– 2176. Acta Horticulturae Sinica 2164 doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0361； http //www. ahs. ac. cn 收稿日期 2018– 08– 01； 修回日期 2018– 11– 16 基金项目 福建省重大科技专项 （ 2015NZ0002-1） ； 闽江学者奖励计划项目 （ MJJZ13-003） ； 福建省高原学科建设经费项目 （ 102/71201801101） ；福建农林大学科技创新基金项目（ CXZX2017189） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail ； ） 文心兰 RFNR 的克隆、 亚细胞定位及其与 LFNR不同的胁迫响应机制研究 李 蓉1，吴晓佩1，王雪晶1，陈裕坤1，郭容芳1，林玉玲1，赖钟雄1,*，徐 涵1,2,*（1福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福州 350002；2法国图卢兹综合科学研究所（ IRIT-ARI） ，法国 31300） 摘 要 以‘小樱桃’文心兰为材料克隆了铁氧还蛋白氧化还原酶（ FNR）两种类型基因 RFNR（ Root-type Ferredoxin-NADP oxidoreductase）和 LFNR（ Leaf-type Ferredoxin-NADPoxidoreductase） 。生物信息学分析表明， RFNR 与 LFNR 都属于 FNR-like 超家族，具有黄素腺嘌呤二核苷酸（ flavin adenine dinucleotide， FAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide， NAD）功能结合域，在进化过程中比较保守； 两种类型的 FNR 在氨基酸组成、 蛋白结构和构型方面存在明显差异， RFNR 比 LFNR有更强的保守性。 FNR 蛋白亚细胞定位结果表明文心兰 FNR 蛋白都定位于叶绿体。实时荧光定量 PCR分析表明， LFNR 和 RFNR 具有器官表达特异性 LFNR 更多地在叶中表达 ， RFNR 更多地在根中表达；在软腐病胁迫下 LFNR 下调响应， RFNR 上调响应；两种类型的 FNR 在盐胁迫以及高温胁迫处理时上调响应，但 RFNR 响应较快且强度更大； LFNR 和 RFNR 在水杨酸（ salicylic acid， SA）处理时轻微波动，茉莉酸甲酯（ methyl jasmonate， MeJA）处理时呈现单峰反应。文心兰两种类型的 FNR 基因在不同类型的胁迫中显示相似的和有区别的表达特性，表明其具有不同的胁迫响应分子机理。 关键词 文心兰；铁氧还蛋白氧化还原酶；胁迫；亚细胞定位；基因表达 中图分类号 S 682.3 文献标志码 A 文章编号 0513-353X（ 2018） 11-2164-13 Cloning and Subcellular Localization of RFNR and the Mechanisms of Stress Induced Response of RFNR and LFNR in Oncidium LI Rong1， WU Xiaopei1， WANG Xuejing1， CHEN Yukun1， GUO Rongfang1， LIN Yuling1， LAI Zhongxiong1,*， and XUHAN Xu1,2,*（1Institute of Horticulture of Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China；2Institut de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse， Toulouse， 31300， France） Abstract Two types of FNR genes（ Root-type Ferredoxin-NADPoxidoreductase， RFNR and Leaf-type Ferredoxin-NADPoxidoreductase， LFNR） were cloned from‘ Little Cherry’ Oncidium. The bioinatics analysis showed that they both belonged to the FNR-like super-family with flavin adenine dinucleotide（ FAD） and nicotinamide adenine dinucleotide（ NAD） functional domains and they were 李 蓉，吴晓佩，王雪晶，陈裕坤，郭容芳，林玉玲，赖钟雄，徐 涵 . 文心兰 RFNR 的克隆、亚细胞定位及其与 LFNR 不同的胁迫响应机制研究 . 园艺学报， 2018， 45 11 2164– 2176. 2165 conservative in the evolution process， but exhibited significant differences in the composition of amino acids， protein structure and configurations. The RFNR was more conservative than LFNR. The results of FNR protein localization showed their encoded proteins were found mainly in the chloroplasts. The real-time fluorescence quantitative PCR expression analysis showed that LFNR and RFNR had organ-specific expression， i.e. LFNR was mainly in the leaf and RFNR in the root. The soft rot induced the down-regulation of LFNR gene and the up-regulation of RFNR gene. Both LFNR and RFNR showed up-regulation in response to the treatments of high salt concentration and high temperature and RFNR showed more quickly and higher levels of response， as well as both responded slightly to salicylic acid（ SA） treatment. When treated with methyl jasmonate（ MeJA） ， both LFNR and RFNR exhibited single-peak expression. There were similar and different expression characteristics under various stress conditions in two types of FNR in Oncidium， which implied different molecular mechanisms in responding to different stresses. Keywords Oncidium； FNR（ Ferredoxin-NADP oxidoreductase） ； stress； subcellular localization；gene expression 铁氧还蛋白氧化还原酶（ ferredoxin-NADPoxidoreductase， FNR）在藻类和高等植物的质体中广泛存在（杨超 等， 2014） ，第 1 个 FNR 基因是从豌豆类囊体中分离到的（耿丽华， 2004） 。 FNR有一个非共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸（ FAD）作为辅基，催化铁氧还蛋白（ Ferredoxin， Fd）和NAD（ P） H 之间的可逆电子转移 （ Mulo， 2011） 。 FNR 具有 FAD 结合域以及 NADP结合位点 （ Mulo，2011） 。 所有的高等植物有两种类型的 FNR（ Mulo， 2011） ， 分别为 LFNR（ Leaf-type Ferredoxin-NADPoxidoreductase）和 RFNR（ Root-type Ferredoxin-NADPoxidoreductase） 。在高等植物的叶绿体中，FNR 是线性电子传递链的最后一步从 Fd 接受电子传递给 NADP，为卡尔文循环提供 NADPH；除 叶绿体外， FNR 也存在于高等植物的其他质体中，在氮代谢中发挥重要作用（ Mulo， 2011） 。 拟南芥中 LFNR 和 RFNR 各有两个， LFNR1 和 LFNR2 都存在于叶绿体基质和类囊体膜中，LFNR1 在类囊体中更丰富，而 LFNR2 在叶绿体基质中更丰富， LFNR1 对铁氧还蛋白的亲和力略微高于 LFNR2；而 RFNR1 和 RFNR2 均定位于叶绿体上。拟南芥的相关研究表明 AtLFNR 功能的丧失会损害植物的自养能力以及光合能力，提示其在植物体内电子传递过程中发挥极其重要的作用；而AtRFNR2 对于根系吸收的亚硝酸盐的还原和解毒至关重要，从而避免亚硝酸盐的积累和由此产生的植物生长缺陷（ Hachiya et al.， 2016） 。对水稻中 FNR 基因的研究表明， LFNR 与 RFNR 在初级结构上有 49的同源性且 RFNR 与水稻抗稻瘟病的防卫反应密切相关（耿丽华， 2004） 。 文心兰（ Oncidium hybridum）是热带气生兰（ Ye et al.， 2014；吴晓佩 等， 2017） 。文心兰在苗期极易受到软腐病危害，在切花盛产期的 4 5 月及 9 11 月，高温高湿导致的软腐病带来严重的经济损失，提高植株的抗软腐病能力是育种与栽培的研究目标之一（杨学 等， 2017） 。吴晓佩（ 2017）对文心兰的研究表明 LFNR 对软腐病菌以及外源胁迫有显著响应，表明该基因可能在文心兰响应抗逆以及抗软腐病过程中具有重要作用。 但是文心兰中 RFNR 与 LFNR 功能有何差异仍需进一步研究。以文心兰‘小樱桃’为材料，利用 NCBI 数据库获得文心兰 LFNR 基因序列，并对 RFNR 进行克隆，运用 qPCR 技术对文心兰不同组织部位以及胁迫相关处理下 LFNR 与 RFNR 的表达进行相对定量分析，旨在为 FNR 基因功能的研究提供依据。 Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2166 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2164– 2176. 1 材料与方法 1.1 试验材料及处理 2017 年 11 月 20 日 2018 年 1 月 20 日进行试验。 以‘小樱桃’文心兰为材料（由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供）进行不同组织部位取样以及胁迫处理。分别用 0.5 mmol · L-1的 SA 和 0.2 mmol · L-1的 MeJA 喷洒文心兰叶片，于 0、1、 3、 6、 12、 24 和 48 h 取样；将文心兰原球茎分别置于 25 ℃（正常生长温度） 、 30 ℃、 35 ℃和40 ℃处理 24 h 后取样；用 250 mmol · L-1的 NaCl 浇灌文心兰植株，盐处理 0、 4、 8 和 16 h 后对叶片进行取样；取 20 μL 的 OD600为 0.6 左右的软腐病菌菌液注射生长一致的 1 年生文心兰假鳞茎，于 0、 4、 8 和 12 h 取样。均 3 次重复。 取上述处理的叶片、原球茎和假鳞茎迅速放入液氮速冻后于– 80 ℃冰箱保存备用。 1.2 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 参考 Trizol（ Invitroigen 公司）试剂盒的方法提取文心兰健康苗的总 RNA，并用 Thermo 超微量核酸检测仪测定 RNA 浓度并通过 1琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的纯度和浓度，然后运用GeneRacerTM试剂盒（ TaKaRa）逆转录为 cDNA 用于基因克隆，用 SYBR ExScriptTM（ TaKaRa）试剂盒逆转录成 cDNA 用于定量 PCR 分析。 1.3 FNR 基因的筛选与克隆 在兰花网站（ http //orchidstra2.abrc.sinica.edu.tw/orchidstra2/gridlist.phplibOG）搜索关键词ferredoxin-NADP，选取 root type，获得 OGTC008364，再以该序列为参考序列，运用 BioEdit 软件进行本地 BLAST，从文心兰转录组数据中获得相似度最高的 1 条序列。 根据筛选获得 cDNA 序列运用 DNAMAN6.0 软件设计扩增引物 RFNR-F 和 RFNR-R（表 1） ，以文心兰‘小樱桃’的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增获得 RFNR 的 cDNA 序列。 PCR 反应体系为 25 μL Dream TaqTM Green PCR Master Mix（ 2） 12.5 μL， ddH2O 9.5 μL，模板 cDNA 1 μL，上、下游引物各 1 μL。 PCR 扩增程序为 94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 45 s， 34 个循环； 最后 72 ℃延伸 5 min。 获得的目的片段采用 Gel/PCR Extraction Kit 回收，经 PMD 18-T 载体连接后转化 Trans-T1 感受态中进行 TA 克隆，并挑选阳性克隆子进行菌液 PCR，将有目的条带的菌液送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序。 文心兰 LFNR 序列（ KX461908.1）由本实验室克隆（吴晓佩， 2017） ，从 NCBI 数据库下载序列进行比对分析和后续试验。 1.4 生物信息学分析 通过 NCBI Conserved Domain Search（ http //www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）进行保守结构域预测；利用 DNAMAN 6.0 软件进行序列比对；通过 MEME（ Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitafion ）圣地亚哥超级计算机中心（ SDSC）开发的一套用来寻找一组相关的 DNA 序列或者蛋白质序列的基序（ motif）的程序在线分析基因的保守 motif，采用 TB tools 对获得的 motif 进行绘制；采用 MEGA 6.0 邻位归并法（ Neighbor joining， NJ）构建 FNR 基因系统进化树。 李 蓉，吴晓佩，王雪晶，陈裕坤，郭容芳，林玉玲，赖钟雄，徐 涵 . 文心兰 RFNR 的克隆、亚细胞定位及其与 LFNR 不同的胁迫响应机制研究 . 园艺学报， 2018， 45 11 2164– 2176. 2167 利用 ExPASy-ProtParam tool， TMHMM Server 分析蛋白基本理化性质、 跨膜结构域 ,； 利用 Signal P4.1Server， NetPhos， COILS， LocTree 3 进行信号肽，磷酸化位点、螺旋卷曲结构、蛋白亚细胞定位预测；采用 SOP-MA， SWISS-MODEL 预测蛋白二级结构以及三级结构。 1.5 蛋白亚细胞定位 将 RFNR 的 CDS 序列导入 DNAMAN 6.0 软件中进行酶切位点分析， 结果显示 CDS 区域不含有BglⅡ和 SpeⅠ这两个酶切位点。根据 Hieff CloneTMPlus One Step Cloning Kit 说明书合成RFNR-1302-F 和 RFNR-1302-R 引物（表 1） ，通过 PCR 扩增获得目的基因序列，进行琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带。同时，利用限制性内切酶 BglⅡ和 SpeⅠ对 pCAMBIA1302 载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收获得线性化的载体，然后参照 Hieff CloneTMPlus One Step Cloning Kit 说明书的体系进行重组反应。之后将重组产物转化大肠肝菌 Trans-T1，进行菌液 PCR，测序以及酶切鉴定后提取质粒，采用冻融法转化农杆菌 EHA 105。采用农杆菌介导法注射烟草和文心兰叶片进行异位以及原位的 RFNR 蛋白亚细胞定位。 1.6 FNR 基因表达特性分析 运用罗氏 LightCycler 480 仪器， 通过 qPCR 检测 FNR 基因在不同组织部位以及胁迫相关处理下的表达情况。根据荧光定量 PCR 引物设计原则，设计 FNR 基因的 qPCR 引物（表 1）以及内参基因Actin 的特异性引物 Actin-Q-F 和 Actin-Q-R（表 1） 。采用 SYBR premix Ex TaqTMkitⅡ（ TaKaRa）进行 qPCR 反应。反应体系为 20 μL，其中 2 SYBR 10 μL， cDNA 模版 1 μL，上、下引物各 0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。反应程序为 95 ℃预变性 30 s， 95 ℃变性 10 s， 60 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 15 s， 40次循环。数据分析采用 2-∆∆CT法获得 FNR 基因的相对表达量，采用 SPSS 19.0 对 LFNR 和 RFNR 的表达分别进行差异显著性分析， ORIGIN 8.5 进行绘图。 表 1 引物序列 Table 1 List of primers used 用途 Use 退火温度 /℃ Tm引物名称 Primer 引物序列 Sequence ORF 验证 ORF verification 55 RFNR-F GCTAAAGCCTCAAATCACCA RFNR-R CCTCTTTCAGTCCCTCAGCAC 亚细胞定位 Subcellular localization 55 RFNR-1302-F ACTCTTGACCATGGTAGATCTATGGCGCACTCGTCGGCTT RFNR-1302-R AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTATAAACCTCAACATGCCAT qPCR 60 RFNR-Q-F ACCAGGAGACAAGGTTCAGC RFNR-Q-R ATGTGAGTGGCGGTTGGA qPCR 60 Actin-Q-F GCAACATTGTTCTTAGCGGAGGCT Actin-Q-R TCTTCATGCTGCTTGGTGCAAGTG qPCR 60 LFNR-Q-F AGGGACAGTCAGTTGGTGTG LFNR-Q-R GGCGCACTCCTTTGACTAACT 2 结果与分析 2.1 文心兰 FNR 基因的克隆 以文心兰 ‘小樱桃’ 幼苗为材料， 提取 RNA 进行质量以及完整度检测后， 直接反转录获得 cDNA。以 RFNR 特异性引物 RFNR-F 和 RFNR-R 进行 PCR 扩增， PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2168 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2164– 2176. 图 1 文心兰 RFNR 基因 PCR 扩增结果 Fig. 1 PCR amplification result of RFNR in Oncidium 1 条与预期目的片段长度相符的条带（图 1） 。将目的条带胶回收后与载体 pMD18-T 连接后转化大肠杆菌感受态 Trans-T1，挑取阳性克隆子经菌液 PCR 鉴定后进行测序。 测序结果显示扩增获得 RFNR 的 cDNA 长度为 1 505 bp，具有 ATG 为起始密码子， TAG 为终止密码子的 1 140 bp 的编码区， 共编码 379 个氨基酸 （图 2） 。 文心兰 LFNR 序列（ KX461908.1）由本实验室克隆（吴晓佩， 2017） ，从 NCBI 数据库下载获得序列。 图 2 文心兰 RFNR 核酸序列以及编码氨基酸序列 Fig. 2 The nucleic acid and amino acid sequences of RFNR in Oncidium 2.2 文心兰 FNR 基因生物信息学分析 保守功能域的分析结果表明文心兰两种类型的 FNR 都属于 FNR-like 超家族，包含有 FAD 结合结构域和 NAD 结合结构域。将两种类型 FNR 基因编码的氨基酸序列进行比对，结果（图 3）显示，文心兰 LFNR 与 RFNR 编码氨基酸序列有 42.11的同源性。 李 蓉，吴晓佩，王雪晶，陈裕坤，郭容芳，林玉玲，赖钟雄，徐 涵 . 文心兰 RFNR 的克隆、亚细胞定位及其与 LFNR 不同的胁迫响应机制研究 . 园艺学报， 2018， 45 11 2164– 2176. 2169 图 3 文心兰 LFNR 与 RFNR 编码氨基酸序列的同源性分析 Fig. 3 Analysis of homology between LFNR and RFNR genes-encoded amino acid sequences in Oncidium 选取拟南芥、水稻、大豆、玉米、菠萝、香蕉、铁皮石斛以及蝴蝶兰等 8 个物种的 FNR 基因编码的氨基酸序列进行聚类分析，发现文心兰 FNR 基因与同为兰科的铁皮石斛 FNR 基因在进化上保持了较近的亲缘关系，其中 LFNR 基因与拟南芥 LFNR1 亲缘关系更近； RFNR 基因与蝴蝶兰同源性更强，与拟南芥 RFNR1 和 RFNR2 亲缘性无较大差异（图 4） 。 图 4 FNR 基因编码的氨基酸序列聚类分析 Fig. 4 Cluster analysis of FNR genes-encoded amino acid sequences in Oncidium 对两种类型的 FNR 蛋白质的保守 motif 进行分析， 结果 （图 5） 所示， 可知两种 FNR 都有 motif 2、motif 3、 motif 6、 motif 1、 motif 10、 motif 4、 motif 5 这 7 个保守基序；此外， RFNR 都有 motif 7、motif 13、 motif 11 这 3 个保守基序，表明 RFNR 较 LFNR 有更强的保守性。其中，文心兰中两种类型 FNR基因编码氨基酸之间的同源性明显低于与其他物种的同类型 FNR基因编码氨基酸的同源性。 Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2170 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2164– 2176. 图 5 FNR 蛋白 motif 分析 Fig. 5 Motif analysis of FNRs proteins 生物信息学分析结果表明， LFNR 和 RFNR 都属于碱性蛋白，不存在信号肽，因此都不属于分泌蛋白，都有两个从外到内的跨膜螺旋；但是 RFNR 属于不稳定蛋白，由内到外的跨膜螺旋只有两个，且在 350 400 之间可能形成卷曲螺旋结构， LFNR 有 3 个跨膜螺旋，但不会形成卷曲螺旋，磷酸化位点分析结果显示 LFNR（ 43）比 RFNR（ 26）有较多磷酸化位点。二级结构分析表明 LFNR由 25.07的 α 螺旋， 26.46的延伸链， 5.57 β 转角以及 42.90的无规则卷曲组成；而 RFNR 蛋白由 24.54的 α 螺旋， 24.80的延伸链， 4.22 β 转角以及 46.44的无规则卷曲组成； FNR 三级结构分析（图 6）可知两者三级结构都由两个亚基组成，但仍存在明显差异。 图 6 FNR 蛋白三级结构预测 Fig. 6 Predicted three-dimensional structure of FNR proteins 2.3 文心兰 RFNR 蛋白的亚细胞定位 采用 LocTree3 在线网站对文心兰 RFNR 蛋白亚细胞定位进行预测，该蛋白定位在叶绿体，与拟南芥中 RFNR 编码的蛋白亚细胞定位结果一致。 李 蓉，吴晓佩，王雪晶，陈裕坤，郭容芳，林玉玲，赖钟雄，徐 涵 . 文心兰 RFNR 的克隆、亚细胞定位及其与 LFNR 不同的胁迫响应机制研究 . 园艺学报， 2018， 45 11 2164– 2176. 2171 为验证其定位，将构建好的带有 RFNR 与 GFP 融合蛋白载体的农杆菌注射烟草叶片表皮细胞，观察 GFP 的表达情况。结果（图 7）显示，空载体中在整个细胞中都可以观察到 GFP 荧光，而RFNR-GFP 融合蛋白主要是在叶绿体中呈明显的绿色荧光，说明文心兰 RFNR 蛋白定位于叶绿体。 图 7 文心兰 RFNR 蛋白在烟草表皮中亚细胞定位观察结果 a、 e 为 GFP 蛋白的绿色荧光图像， b、 f 为紫外光下的叶绿体自发荧光图像， c、 g 为明场图像， d、 h 为荧光和明场叠加图像。 Fig. 7 Subcellular localization of RFNR in tobacco leaf tissue a and e Green fluorescence of GFP， b and f Chloroplast autofluorescence under UV radiation， c and g Bright field， d and h Merged field. 将 RFNR-GFP 融合蛋白采用农杆菌介导法注射至文心兰较嫩的叶片中，黑暗共培养 48 h 后取叶片下表皮用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，结果（图 8）显示，在 488 nm 激发光下，对照中观察到微弱而弥散的荧光， RFNR-GFP 在叶绿体中尤其是气孔保卫细胞中有较强荧光。 图 8 文心兰 RFNR 蛋白在文心兰表皮中亚细胞定位观察结果 a、 e 为 GFP 蛋白的绿色荧光图像， b、 f 为紫外光下的叶绿体自发荧光图像， c、 g 为明场图像， d、 h 为荧光和明场叠加图像。 Fig. 8 Subcellular localization of RFNR in Oncidium leaf tissue a and e Green fluorescence of GFP， b and f Chloroplast autofluorescence under UV radiation， c and g Bright field， d and h Merged field. Li Rong， Wu Xiaopei， Wang Xuejing， Chen Yukun， Guo Rongfang， Lin Yuling， Lai Zhongxiong， Xuhan Xu. Cloning and subcellular localization of RFNR and the mechanisms of stress induced response of RFNR and LFNR in Oncidium. 2172 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2164– 2176. 2.4 LFNR 和 RFNR 在文心兰不同组织部位中的表达分析 以 18Sr 和 Actin 为内参基因，分析两种类型 FNR 基因在文心兰根、茎、叶和花不同组织部位的基因表达情况，结果（图 9）显示。 LFNR 在根、茎、叶和花中均有表达，根和花中表达量极低，叶中最高，茎中次之。 RFNR 在根、茎、叶和花中都有相对较高的表达量，茎、叶和花中表达量无显著差异，根中表达量显著高于其他组织部位。 2.5 水杨酸和茉莉酸甲酯处理下文心兰LFNR 和 RFNR 的表达分析 在 0.5 mmol · L-1的水杨酸（ SA）诱导下LFNR 和 RFNR 并没有极为明显的响应，两者表达量都在本底表达附近轻微波动（图 10） 。 在 0.2 mmol · L-1的茉莉酸甲酯（ MeJA）诱导下 LFNR 和 RFNR 都呈现明显的单峰响应，两者都在 6 h 时显著上调，其余时间两者都在本底表达附近波动（图 11） 。 图 10 水杨酸处理下文心兰 LFNR 和 RFNR 的表达 Fig. 10 The expression of LFNR and RFNR gene after SA treatment 图 11 MeJA 处理下文心兰 LFNR 和 RFNR 的表达 Fig. 11 The expression of LFNR and RFNR gene after MeJA treatment 2.6 不同胁迫处理下文心兰 LFNR 和 RFNR 的表达分析 在高温胁迫处理下， LFNR 和 RFNR 表达整体下调， LFNR 在 40 ℃时显著下调， RFNR在 30 ℃时显著下调， RFNR 下调趋势较 LFNR明显（图 12） 。 在盐胁迫处理下， LFNR 和 RFNR 的表达呈现相似的趋势，两者在胁迫 8 h 内显著上调，而胁迫 12 h 时，表达量下调至接近未胁迫处理图 12 高温胁迫处理下文心兰 LFNR 和 RFNR 的表达 Fig. 12 The expression of LFNR and RFNR responding to high temperature stress 图 9 LFNR 和 RFNR 在文心兰不同组织中的表达 Fig. 9 The expression of LFNR and RFNR genes in different tissues of Oncidium 李 蓉，吴晓佩，王雪晶，陈裕坤，郭容芳，林玉玲，赖钟雄，徐 涵 . 文心兰 RFNR 的克隆、亚细胞定位及其与 LFNR 不同的胁迫响应机制研究 . 园艺学报， 2018， 45 11 2164– 2176. 2173 时（图 13） 。 感染软腐病后， LFNR 基因在感病 4 h 时明显下调，之后呈本底表达，而 RFNR 在感病 4 h 时显著上调，之后下调并轻微波动（图 14） 。 图 13 高盐浓度胁迫处理下文心兰 LFNR 和 RFNR 的表达 Fig. 13 The expression of LFNR and RFNR genes responding to salt stress 图 14 软腐病胁迫处理下文心兰 LFNR 和 RFNR 的表达 Fig. 14 The expression of LFNR and RFNR genes responding to soft rot treatment 3 讨论 3.1 文心兰 RFNR 比 LFNR 保守性更强 FNR 通过将 Fd 的电子转移给 NADP介导光合作用电子传递的最后一步， 产生的 NADPH 参与碳固定、 氮代谢、 脂质及叶绿素合成， 并且调控基质氧化还原等一系列的反应 （ Lintala et al.， 2010） 。PSⅠ系统电子受体能量的降低中， FNR 的激活是一个关键的节点，相关研究已经表明 FNR 基因的失活会引起 ROS 的积累（ Lintala et al.， 2012） 。植物中 FNR 蛋白根据其功能和定位分为两大类，一类是存在于光合组织尤其是植物叶片中的 LFNR，另一类是主要存在于非光合组织 RFNR（ Mulo，2011；杨超 等， 2014） 。功能结构域的预测分析表明文心兰中两种类型的 FNR 都隶属于 FNR-