拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用.pdf

中国农业大学学报 2025 30 8 38 49 Journal of China Agricultural University http 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用 石精涛 1 曹建敏 1 韩小斌 2 丁应福 3 刘建阳 3 李 喆 1 赵栋霖 1 张成省 1 林 伟 3 徐康文 1 1 中国农业科学院 烟草研究所 山东 青岛 266101 2 福建省烟草公司南平市公司 福建 南平 353000 3 贵州省烟草公司遵义市公司 贵州 遵义 563100 摘 要 为鉴定健康葡萄果实中筛选出对灰葡萄孢具有拮抗作用的木霉菌 探究其发挥抑制效果的关键化合物以 及对葡萄灰霉病的防治效果 利用平板对峙及对扣法筛选出目标木霉菌后 通过形态学观察和多基因系统发育分 析对目标菌株进行菌种鉴定 后采用扫描 SEM 和透射电镜 TEM 观察木霉菌产生的挥发性有机物 VOCs 对灰 葡萄孢菌丝形态的影响 并利用气相色谱 质谱联用法 GC MS 对木霉菌VOCs进行组分分析 最后通过熏蒸法 对鉴定出的VOCs进行抑菌活性评估 半抑制浓度测定以及对葡萄灰霉病的防效试验 结果表明 1 本研究筛选 得到的目标木霉菌GUI12菌株被鉴定为柠檬绿木霉 Trichoderma citrinoviride 2 与平板对峙相比 对扣培养时 GUI12对灰葡萄孢的抑制效果较好 抑制率可达89 63 3 SEM与TEM观察结果显示GUI12产生的VOCs会导 致灰葡萄孢菌丝变粗 褶皱 塌陷 并使包括细胞核 线粒体及液泡等在内的细胞器轮廓模糊 甚至溶解和消失 4 离体葡萄抗病测定结果显示 VOCs能够有效抑制葡萄果实病斑的扩展 对葡萄灰霉病斑扩展的抑制率为 53 56 5 GC MS分析结果显示GUI12产生乙酸异丁酯 2 3 丁二酮 苯乙醇等19种VOCs 它们在100 L L 的浓度下均能不同程度地抑制灰葡萄孢的菌丝生长 其中2 3 丁二酮 苯乙醇的抑制率均为100 6 2 3 丁二酮 在EC 50 14 97 L L 浓度下对葡萄灰霉病的防效为100 苯乙醇也能够在2 EC 50 95 38 L L 浓度下对葡萄 灰霉病的防效达到100 综上 本研究筛选得到的木霉菌GUI12产生的VOCs能够抑制灰葡萄孢菌丝生长 造成 细胞器损伤 有效抑制葡萄灰霉病斑的扩散 其中 2 3 丁二酮 苯乙醇对葡萄灰霉病的防治效果较好 具有进一 步研究与开发的潜力 关键词 柠檬绿木霉 灰葡萄孢 挥发性有机化合物 气相色谱 质谱联用法 生物防治 中图分类号 S476 文章编号 1007 4333 2025 08 0038 12 文献标志码 A Identification of Trichoderma antagonizing Botrytis cinerea and its disease prevention effect SHI Jingtao 1 CAO Jianmin 1 HAN Xiaobin 2 DING Yingfu 3 LIU Jianyang 3 LI Zhe 1 ZHAO Donglin 1 ZHANG Chengsheng 1 LIN Wei 3 XU Kangwen 1 1 Chinese Academy of Agricultural Sciences Tobacco Research Institute Qingdao 266101 China 2 Fujian Tobacco Company Nanping Company Nanping 35300 China 3 Guizhou Tobacco Company Zunyi Company Zunyi 563100 China 收稿日期 2024 11 28 基金项目 国家自然科学基金项目 32302448 山东省自然科学基金项目 ZR2024QC002 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 1610232023025 烟草常用生 物农药新型增效剂的研究及应用 NYK2025 02 03 中国烟草总公司重大科技项目 110202101057 LS 17 第一作者 石精涛 ORCID 0009 0003 6238 9728 硕士研究生 E mail sjthnsmx 163 com 通讯作者 林伟 ORCID 0009 0009 394 6526 主要从事挥发物鉴定与功能研究 E mail lw160718 163 com 徐康文 ORCID 0000 0003 0557 0590 主要从事生物防治研究 E mail xukangwen caas cn 石精涛 曹建敏 韩小斌 丁应福 刘建阳 李喆 赵栋霖 张成省 林伟 徐康文 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用 J 中国农业大学学报 2025 30 08 38 49 SHI Jingtao CAO Jianmin HAN Xiaobin DING Yingfu LIU Jianyang LI Zhe ZHAO Donglin ZHANG Chengsheng LIN Wei XU Kangwen Identification of Trichoderma antagonizing Botrytis cinerea and its disease prevention effect J Journal of China Agricultural University 2025 30 08 38 49 DOI 10 11841 j issn 1007 4333 2025 08 04 第 8 期 石精涛等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用 Abstract The aims of this study were to identify the Trichoderma strains with antagonistic action against Botrytis cinerea from healthy grape berries and explore the key compounds that exert inhibitory effects and the control effect on grape gray mold By plate confrontation and buckle method the target strain was identified by morphological observation and multi gene phylogenetic analysis The impact of volatile organic compounds VOCs emitted by Trichoderma spp on the morphological alterations of B cinerea mycelium was examined using scanning electron microscopy SEM and transmission electron microscopy TEM The components of Trichoderma VOCs were analyzed by gas chromatography mass spectrometry GC MS Finally the antibacterial activity evaluation semi inhibitory concentration determination and control effect test on grape gray mold of the identified VOCs were carried out using the fumigation method The results showed that 1 The target Trichoderma strain GUI12 screened in this study was identified as Trichoderma citrinoviride 2 Compared with the plate confrontation the inhibition effect of GUI12 on B cinerea was better in the buckle culture and the inhibition rate could reach 89 63 3 SEM and TEM observation results showed that the VOCs produced by GUI12 could cause the mycelium of B cinerea to become thicker wrinkled and collapsed and blur the outline of organelles including nucleus mitochondria and vacuoles even dissolve and disappear 4 The result of the in vitro grape disease resistance test showed that VOCs could effectively inhibit the expansion of grapefruit lesions and the inhibition rate of grape gray mold lesion expansion was 53 56 5 GC MS analysis showed that GUI12 produced 19 types VOCs such as isobutyl acetate 2 3 butanedione phenylethyl alcohol etc They could inhibit the mycelial growth of B cinerea in different degrees at the concentration of 100 L L and the inhibition rates of 2 3 butanedione and Phenylethyl alcohol were 100 6 The control effect of 2 3 butanedione on grape gray mold was 100 at EC 50 14 97 L L Phenethyl alcohol also achieved a 100 control effect on grape gray mold at 2 EC 50 95 38 L L In summary the VOCs produced by GUI12 can inhibit the growth of B cinerea hyphae cause organelle damage and effectively inhibit the spread of grape gray mold lesions Among them 2 3 butanedione and phenylethyl alcohol have better control effects on grape gray mold and have the potential for further research and development Keywords Trichoderma citrinoviride Botrytis cinerea VOCs GC MS biocontrol resources 灰霉病是由葡萄孢属 Botrytis spp 真菌引起 的一种重要的世界性病害 目前已知葡萄孢属真 菌包含30多个种属 1 其中灰葡萄孢的寄主范围十 分广泛 能侵染包括番茄 黄瓜 茄子 葡萄和烟草 等在内的200多种经济作物 除此之外 灰葡萄孢 在作物的储藏 运输期间也会造成巨大的产量和经 济损失 2 4 目前 由于缺乏有效的商业化抗病品 种 灰霉病的防治仍主要依赖喷施化学杀菌剂 化 学杀菌剂在使用过程中普遍存在过量喷施 容易造 成药物残留及环境污染等问题 5 7 利用有益微生物进行作物病害防治是绿色防 控的重要发展方向之一 8 研究表明 木霉菌 Trichoderma spp 酵母菌 Saccharomyces spp 芽孢杆菌 Bacillus spp 链霉菌 Streptomyces spp 等在抑制病原真菌和细菌上具有良好的效 果 9 10 生防菌株的作用机制主要包括抗生作用 定殖位点 营养或矿物质的竞争 寄生和噬菌体 其 中通过分泌抗真菌代谢物质 Antifungal Metabo lites AFMs 来发挥对病原真菌的抗生作用是最常 见的策略 目前研究较多的抗真菌代谢物质主要有 抗生素 酶和挥发物 11 挥发性有机化合物是一种 低分子量含碳化合物 易扩散到土壤孔隙 液体及 大气中 是一种理想的化学介质 目前已被应用于 植物病害防治 木霉菌作为研究最多 并且在商业 实践中应用最广泛的一种生防真菌 具有广谱性 高 适应性强和多机制等特点 且能够分泌大量具 有抗菌作用的次生代谢产物 12 在这些抗菌物质 中 挥发性有机化合物因其高效的抗菌活性和低环 境残留性成为研究热点 围绕木霉菌属产生挥发 物的抗菌活性已开展了广泛的研究 20世纪70年 代 Colins等 13 已开始研究木霉菌气体挥发物的成 分 近来又陆续有文献报道了木霉菌产生的挥发性 有机化合物在防治植物真菌病害中的应用 张铭 等 14 报道了森吉木霉 Trichoderma songyi M75产 生的VOCs可以有效抑制松球壳孢菌 Sphaeropsis sapinea 的生长 经过气相色谱 质谱联用法 GC 39 中 国 农 业 大 学 学 报 2025 年 第 30 卷 MS 分析 以及各挥发物纯品的体外菌丝生长抑制 试验结果显示 挥发性物质中的芳樟醇的抑菌效果 最好 其可以抑制金黄壳囊菌 Cytospora chryso sperma 栗疫菌 Cryphonectria parastica 和链格孢 Alternria sp 等多种病原真菌 前期研究在健康葡萄果实 青岛胶州采摘 中 分离得到一株对灰葡萄孢有较强拮抗作用的木霉 菌 命名为GUI12 其发挥抑菌作用的关键代谢产 物和对灰霉病的防治效果尚未明确 因此 本研究 拟以GUI12菌株为研究对象 采用形态学及分子生 物学对菌株进行鉴定 并研究其在不同时间产生的 VOCs对灰葡萄孢的抑制情况 以及VOCs对灰葡 萄孢形态和结构的影响及其对灰霉病害的防治效 果 分析GUI12产生的VOCs的组成成分以及对灰 葡萄孢的有效抑菌物质 并针对有效抑菌物质开展 药效试验 验证其实际应用效果 以期为该菌株应 用于灰霉病的防治提供依据 1 材料与方法 1 1 试验材料及主要仪器 试验于2023年11月 2024年9月完成于中国 农业科学院烟草研究所 供试病原真菌灰葡萄孢 菌株0201 生防真菌菌株GUI12均保藏于中国农业 科学院烟草研究所 所用PDA及PDB培养基 购 自北京索莱宝科技有限公司 中国 培养箱为上 海一恒LRH 250生化培养箱 振荡培养箱型号为上 海知楚ZQZY CF9 9振荡培养箱 中国 气相色谱 质谱仪型号为安捷伦7890B 5975C气相色谱质谱 仪 美国 1 2 试验方法 1 2 1 GUI12菌株和灰葡萄孢菌0201对扣培养 参照Kong等 12 的平板对扣方法并略加修改 选取活化状态良好的GUI12菌株以及0201菌株 利 用无菌打孔器 5 mm 在其菌丝边缘处打孔 分 别接种于预先制备好的2个PDA培养基 90 mm 15 mm的培养皿中加入15 mL的PDA 中央 随后 将这2个培养基去盖对扣 用 Parafilm 封口膜进行 密封 接种GUI12菌株的培养基置下 接种0201菌 株的培养基置上 以未接种GUI12菌饼的 PDA 培 养基对扣0201培养基作为对照 每个处理重复3 次 置于 25 恒温培养箱中黑暗培养 并在接种后 24 48 72 96 h时使用游标卡尺精确测量0201菌株 菌落的直径 mm 抑菌率计算公式如下 抑菌率 1 处理组菌落直径 5 对照组菌落直径 5 100 1 2 2 GUI12菌株的鉴定 GUI12菌株的形态学鉴定 用打孔器 5 mm 取菌饼倒置于PDA培养基将GUI菌株活化 后 28 培养3 d 待长出菌落后 用接种针挑取菌 丝置于载玻片上 在显微镜下观察菌丝形态特征 并对其进行初步鉴定 GUI12菌株的分子生物学鉴定 菌株GUI12 ITS1 ITS4基因扩增及测序采用CTAB法进行基因组总DNA 提取 PCR扩增体系为50 L 模板DNA 36 ng L 2 L 引物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 和ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 10 mol L 各2 L 10 Phanta Flash Mix Dye Plus 2 L 双蒸水19 L PCR扩增程序 95 5 min 95 15 s 56 15 s 72 2 min 34个循环 72 10 min 将PCR产物送交北京擎科生物技术有限公司进行测 序 测序结果查询GenBank数据库 采用BLAST在 线工具与数据库的序列进行同源性比较 利用MEGA X软件 使用邻接法构建系统发育树 1 2 3 扫描电镜 SEM 及透射电镜 TEM 观察 GUI12菌株和灰葡萄孢菌0201菌丝形态 影响 参照1 2 1的方法 将GUI12菌株与0201菌株 对扣培养3 d 以未接种GUI12菌饼的 PDA 培养基 对扣0201培养基作为对照 收集的菌丝体用 2 5 Gluta 固定液固定 4 C 送往青岛大学医学 部进行SEM和TEM观察 1 2 4 GUI12菌株挥发性物质在离体葡萄上的抑 制作用 灰葡萄孢分生孢子液制备 以0201菌株为材 料 在PDA平板上25 培养10 d 无菌水冲洗 使 用8层纱布过滤菌丝 吸取上清 用血球计数板在显 微镜下确定灰葡萄孢孢子液浓度 无菌水稀释成 1 10 5 个 mL孢子悬浮液 在组培瓶 600 mL 中加入100 mL PDA后灭菌 在处理组中放入GUI12菌饼 对照为空白PDA 将新 鲜葡萄果实 浸泡在 2 次氯酸钠溶液中2 min 用无 菌水冲洗 3次后晾干 采用无菌针头于果实上刺1个 伤口 3 mm 3 mm 然后将5 L灰葡萄孢孢子悬浮 液加入伤口 每个组培瓶放置5个接种后的果实 快 40 第 8 期 石精涛等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用 速盖上组培瓶盖 用Parafilm封口膜进行密封 在25 下培养3 d后 观察并测量病斑直径 mm 根据病斑 直径计算抑制率 每个处理设置3个重复 病斑生长 抑制率具体计算公式如下 病斑生长抑制率 对照病斑直径 处理病斑直径 对照病斑直径 3 100 1 2 5 GUI12菌株挥发性物质的收集和其组分 分析 挥发性物质的制备 将这2个活化状态良好的 GUI12菌饼 5 mm 放置于150 mL的PDA培 养瓶中 用 Parafilm 封口膜进行密封 在28 C条件 下培养3 d 以未接种菌块的PDA为对照 每个处理 设置3个重复 挥发性物质的吸附 将培养3 d后的培养瓶置 于40 水浴30 min 之后将SPME针插入培养瓶瓶 1 3 处 然后推出萃取头 顶空吸附 45 min 后样品 采集结束 挥发性物质的分析方法 色谱分析采用氦气作 为载气 流速设定为1 mL min SPME针在220 C 下解吸5 min 色谱柱为RTX 5MS柱 3 m长 内 径0 25 mm 膜厚0 25 mm 初始温度设定为 35 持续3 min后以10 min的速率升至180 再以4 min的速率升至240 并保持5 min 质 谱仪在电子电离模式下运行 能量设定为70 eV 温 度220 扫描范围50 500 m z 利用安捷伦 MassHunter B 05 02 软件进行色谱图的获取与分 析 挥发性物质的检测结果通过与安捷伦NIST 数 据库进行比对 结合Kovats保留指数的计算与匹 配 对解析出的VOC峰进行鉴定 当化合物的质 谱图与数据库中的匹配度超过800 且保留指数 retention index RI 的差值 5时 该化合物即被确 认为已鉴定 1 2 6 GC MS分析鉴定的挥发性化合物的抗菌 活性评估 购买通过GC MS分析鉴定的挥发性有机化合物 并采取熏蒸法评估其对0201菌株的抗菌活性 参照 1 2 1的方法接种0201菌株 之后在培养皿盖内部中 央贴上10 mm 10 mm灭菌滤纸 并在滤纸上滴加6 5 L的挥发性化合物 终浓度100 L L 快速盖上培 养皿盖 用Parafilm 封口膜进行密封 以不加挥发性化 合物的滤纸片作为对照 每个处理设置3个重复 置 于 25 恒温培养箱中黑暗培养3 d 使用游标卡尺精 确测量0201菌株菌落的直径 mm 通过计算 得到 抑菌率 1 2 7 挥发物2 3 butanedione 2 3 丁二酮 Phenylethyl Alcohol 苯乙醇 对灰葡萄孢0201 的有效抑制中浓度 EC 50 参照1 2 6的方法 接种0201菌株并在培养皿盖 上的滤纸上滴加0 325 0 650 0 975 1 300 1 625 L 的2 3 丁二酮将培养皿中空气中2 3 丁二酮的浓度 控制在 5 10 15 20 25 L L 在培养皿盖上的滤纸 上滴加0 650 1 625 3 250 4 875 6 500 L的苯乙 醇 将培养皿空气中的苯乙醇的终浓度控制在 10 25 50 75 100 L L 快速盖上培养皿盖 用Parafilm 封口 膜进行密封 以不加挥发性化合物的滤纸片作为对照 每个处理重复3次 置于 25 恒温培养箱中黑暗培 养3 d 使用游标卡尺精确测量0201菌株菌落的直径 mm 并分别计算不同浓度苯乙醇 2 3 丁二酮对0201 菌株的抑制率及EC 50 1 2 8 气体挥发物2 3 丁二酮和苯乙醇在离体葡萄 上的抑制作用 参照1 2 4的方法完成灰葡萄孢分生孢子液制备 及在葡萄果实上接种灰葡萄孢分生孢子液 在组培 瓶 600 mL 底部空白位置放置灭菌滤纸 并分别滴加 不同量的2 3 丁二酮 苯乙醇使组培瓶中的2 3 丁二 酮 苯乙醇浓度达到各自对于0201菌株的EC 50 及2 EC 50 每个组培瓶放置5个接种后的果实 快速盖上 组培瓶盖 用Parafilm封口膜进行密封 在25 下培 养3 d后 观察并测量病斑直径 mm 根据病斑直径 计算抑制率 每个处理设置3个重复 1 3 统计分析 使用Microsoft Office Excel 2019和SPSS 18 0进 行数据统计分析 使用GraphPad Prism 2020作图 2 结果与分析 2 1 GUI12产生的VOCs对灰葡萄孢生长的影响 本研究获得的GUI12菌株与灰葡萄孢对扣试验 以及对其菌丝抑制效果及抑制率分别见图1及图2 由图1可见 随着对扣培养时间的增长 与GUI12菌株 对扣的灰葡萄孢与正常培养的灰葡萄孢菌落直径差 距逐渐增大 由图2可见 对扣培养24 h 48 h 72 h 96 h时 与正常培养的灰葡萄孢相比 GUI12菌株对扣 对灰葡萄孢菌落扩展的抑制率分别为66 67 68 75 79 94 和89 63 结果表明GUI12菌株 产生的VOCs能够有效抑制灰葡萄孢菌丝的生长 41 中 国 农 业 大 学 学 报 2025 年 第 30 卷 2 2 GUI12菌株的鉴定 通过形态学及分子生物学鉴定GUI12菌株 结 果见图3 由图3 a 可见 GUI12菌株培养3 d时 呈现出清晰的透明菌落和典型的气生菌丝 菌饼周 围菌丝变绿 菌落直径为75 80 mm 由图3 b 可见GUI12菌株分生孢子梗从菌丝 伸出 部分形成分生孢子 分生孢子呈亚球形至球 形 由图3 c 可见将得到的GUI12菌株ITS测序 结果与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对 初 步鉴定为木霉菌 提取同源性较高的不同菌种的 序列与GUI12菌株序列 通过MEGA X采用邻接 法联合构建系统发育树 结果表明 GUI12与 Trichoderma citrinoviride 柠檬绿木霉 在同一分 支 结合形态学鉴定结果 GUI12鉴定为 T citrinoviride 2 3 GUI12菌株产生的VOCs对灰葡萄孢的细胞 形态及结构的影响 细胞形态和结构对于病原菌侵染植物至关重 不同小字母表示差异达显著水平 P 0 05 下同 Note Different lowercase letters indicate significant differences P 0 05 The same applies below 图 2 与GUI12菌株对扣培养对灰葡萄孢的抑制率随时间的变化 Fig 2 The changes in the inhibition rate of B cinerea by confrontation culture with the GUI12 strain over time GUI12为木霉菌 0201为灰葡萄孢菌 0201暴露的VOCs为对扣培养时GUI12菌株产生的VOCs 下同 GUI12 represents the strain of Trichoderma spp 0201 represents the strain of B cinerea the VOCs exposed to 0201 are the VOCs produced by the GUI12 strain during confrontation culture The same applies below 图 1 GUI12菌株分泌的VOCs在不同时间对灰葡萄孢的抑制情况 Fig 1 The inhibitory effects of VOCs produced by GUI12 strain on Botrytis cinerea at different time poin 42 第 8 期 石精涛等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用 要 形态的改变会导致菌体无法正常增殖 识别 以及结合 而结构的改变则会导致菌丝功能 丧失 将与GUI12菌株对扣培养及正常培养3 d的 灰葡萄孢分别在扫描电镜 SEM 和透射电镜 TEM 下观察菌体表面形态以及结构变化 结果 见图4 由图4 a 可见 正常培养的灰葡萄孢菌丝 形态正常 呈现出光滑且饱满圆润的状态 细胞结 构正常 细胞壁及细胞膜完整 细胞核 线粒体 液 泡均清晰可见 由图4 b 可见 与GUI12对扣培 养的灰葡萄孢菌丝呈现出变粗 褶皱 塌陷的现 象 其细胞核 线粒体及液泡等细胞器呈现出轮廓 模糊 甚至溶解和消失的现象 结果表明 GUI12 菌株产生的VOCs可能引起细胞器损伤 最终导 图 4 GUI菌株产VOCs对灰葡萄孢0201菌丝超微结构的影响 Fig 4 Effect of VOCs produced by GUI12 strain on the ultrastructure of B cinerea 0201 mycelium a 为PDA培养基上GUI12菌株菌落的正面形态 b 为GUI12菌株的分生孢子及分生孢子梗 c 为基于ITS基因序列采用 邻接法构建的GUI12菌株系统发育树 a shows the top view of the colony morphology of the GUI12 strain on PDA medium b shows the conidia and conidiophores of the GUI12 strain c is the phylogenetic tree of the GUI12 strain constructed using the neighbor joining method based on the ITS gene sequence 图 3 GUI12菌株鉴定 Fig 3 Identification of GUI12 strain 43 中 国 农 业 大 学 学 报 2025 年 第 30 卷 致菌体死亡 2 4 GUI12菌株产生的VOCs对葡萄灰霉病的防 效验证 GUI12菌株产生的VOCs对葡萄灰霉病的防治 效果见表1 可见 对照组病斑平均直径为17 80 mm 经GUI12菌株产生的VOCs处理后的葡萄果 实病斑平均直径为8 27 mm 病斑扩展相对缓慢 GUI12菌株产生的VOCs对葡萄灰霉病斑扩展具有 一定的抑制作用 抑制率为53 56 2 5 GUI12菌株产生的 VOCs成分鉴定及活性 筛选 利用GC MS技术对培养3 d的GUI12菌株产 生的VOCs进行成分分析 鉴定结果见表2 共鉴 定出19种VOCs 这些化合物包括酮类 醇类 烷烃 类 吡喃类 酯类 测定可购买到的GUI12菌株产生的12种 VOCs 乙酸异丁酯 2 3 丁二酮 丁酸乙酯 2 甲基 丁基乙酸酯 巴豆酸乙酯 2 甲基丁醇 异戊醇 惕各 酸乙酯 3 乙酰氧基丁酸乙酯 戊内酯 苯甲酸乙 酯 苯乙醇 对灰葡萄孢的抑制率结果见图5 a 可见 12种VOCs在100 L L的浓度下均能够不 同程度地抑制灰葡萄孢菌落扩展 其中2 3 丁二酮 及苯乙醇对灰葡萄孢的抑制效果较为显著 抑制率 均为100 不同浓度的2 3 丁二酮及苯乙醇对灰葡萄孢 抑制率结果见图5 b 及图5 c 由图5 b 可见2 3 丁二酮对灰葡萄孢的毒力回归方程为 y 4 84x 22 47 EC 50 为14 97 L L 由图5 c 可 见苯乙醇对灰葡萄孢的毒力回归方程为 y 0 97x 3 24 其EC 50 为48 21 L L 2 6 2 3 丁二酮及苯乙醇对葡萄灰霉病的防效 验证 2 3 丁二酮和苯乙醇对葡萄灰霉病的防治效果 见表3 可见 接菌培养3 d后 对照组葡萄的病斑 发病率为100 00 病斑直径为18 20 mm 与之 相比 2 3 丁二酮在EC 50 及2 EC 50 浓度下均未发 病 且无病斑出现 对葡萄灰霉病斑扩展的抑制率 为100 00 苯乙醇在EC 50 及2 EC 50 浓度下的发 病率分别为86 67 0 00 病斑直径分别为 4 73 mm 0 00 mm 对葡萄灰霉病斑扩展的抑制率 分别为74 00 100 00 3 讨 论 生防菌及其代谢产物等生物防治剂的开发和 应用 为植物病原真菌的生物防治提供了一种有前 途的替代方案 本研究发现柠檬绿木霉GUI12菌 株产生的VOCs能够有效抑制灰葡萄孢的菌丝生 长 抑制效果并未随着时间的延长而减弱 目前已 报道木霉菌属的一些物种产生的VOCs具有抗真菌 活性 如康宁木霉 T koningii T2 15 哈茨木霉 T harzianum 16 哈马图木霉 T hamatum 17 棘孢木霉 T asperellum T1 18 等产生的VOCs能 够抑制植物病原真菌菌丝的体外生长 孢子形成 导致病原菌菌丝畸形 顶端膨大 分支增多 细胞质 外渗等 Hu等 16 发现哈茨木霉VOCs处理会导致 马铃薯晚疫病菌 Phytophthora infestans 细胞壁和 细胞膜变形 塌陷以及细胞器的退化并导致细胞质 材料泄漏 本研究中GUI12菌株产生的VOCs能 够导致灰葡萄孢的菌丝呈现出变粗 褶皱 塌陷的 现象 并使包括细胞核 线粒体及液泡等在内的细 胞器呈现出模糊现象 且能够抑制葡萄果实上灰霉 病病斑的生长 对葡萄灰霉病斑扩展的抑制率为 53 56 具有生物活性的微生物VOCs由于不同的化学 基团被分为烯烃 醇类 酮类 苯类 吡嗪类 硫化物 和萜烯类等 19 Abdenaceur 等 20 研究发现粗糙木 霉 T asperellum 产生的主要VOCs异丁醇 3 戊 酮和 1 戊烯 3 醇对大丽轮枝菌 Verticillium dahliae 表现出明显的抑菌活性 Rao 21 等报道橘绿 木霉 T atroviride LZ42产生的2 庚酮 2 戊基呋 喃及 榄香烯能有效抑制尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 对GUI12菌株产生的VOCs进行分 析 共鉴定出包括酮类 醇类 烷烃类 吡喃类 酯类 在内的19种VOCs 与复杂的VOCs组分相比 纯 化合物具有清晰的结构特性 易于生产和合成 未 来可能具有实际应用价值 22 本研究依据GUI12 表1 GUI12菌株分泌的VOCs对葡萄灰霉病的防治效果 Table 1 Control effect of VOCs secreted by GUI12 strain on grape gray mold 处理 Treatment CK VOCs 病斑直径 mm Lesion diameter 17 80 8 27 发病率 Incidence 100 00 100 00 抑制率 Inhibition rate 53 56 44 第 8 期 石精涛等 拮抗灰葡萄孢木霉菌的鉴定及其防病作用 表2 气相色谱 质谱联用技术检测GUI12菌株产生的挥发性有机化合物 Table 2 Detection of VOCs produced by GUI12 strain by GC MS 峰编号 Peak number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 保留时间 min Retention time 10 705 10 132 11 139 12 101 12 703 13 640 14 161 14 190 14 988 16 074 16 500 18 418 19 678 20 449 21 406 21 710 22 065 22 249 25 423 名称 Name 乙酸异丁酯 Isobutyl acetate 2 3 丁二酮 2 3 butanedione 丁酸乙酯 Ethyl butyrate 异丁醇 2 methyl 1 propanol 2 甲基丁基乙酸酯 2 methylbutyl acetate 巴豆酸乙酯 Ethyl crotonate 2 甲基丁醇 2 methylbutanol 异戊醇 3 methylbutanoI 惕各酸乙酯 Ethyl tiglate 3 羟基 2 丁酮 3 hydroxy 2 oxobutane 乙酸3 辛酯 3 octylacetat 1 庚醇 1 heptanol 3 羟基丁酸乙酯 Ethyl 3 hydroxybutyrate 3 乙酰氧基丁酸乙酯 Ethyl 3 acetoxybutyrate 2 糠酸乙酯 Ethyl 2 furoate 戊内酯 valerolactone 丁内酯 butyrolactone 苯甲酸乙酯 Ethyl benzoate 苯乙醇 Phenylethyl alcohol 分子式 Molecular formula C 6 H 12 O 2 C 4 H 6 O 2 C 6 H 12 O 2 C 4 H 10 O C 7 H 14 O 2 C 6 H 10 O 2 C 5 H 12 O C 5 H 12 O C 7 H 12 O 2 C 4 H 8 O 2 C 10 H 20 O 2 C 7 H 16 O C 6 H 12 O 3 C 8 H 14 O 4 C 7 H 8 O 3 C 5 H 8 O 2 C 4 H 6 O 2 C 9 H 10 O 2 C 8 H 10 O CAS编号 CAS number 110 19 0 431 03 8 105 54 4 78