矾根叶柄和叶片不定芽高效再生体系优化.pdf

收稿日期 2019 07 24 基金项目 上海市花卉产业技术体系 沪农科产字 2019 第8号 作者简介 孙翊 1985 女 博士 助理研究员 从事观赏植物资源评价与育种研究 E mail gnsuny 163 com 通信作者 E mail saasflower 163 com 上海农业学报 2020 36 6 39 43 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 08 孙翊 殷丽青 张永春 等 矾根叶柄和叶片不定芽高效再生体系优化 J 上海农业学报 2020 36 6 39 43 矾根叶柄和叶片不定芽高效再生体系优化 孙 翊1 殷丽青1 张永春1 庹晓庆1 付正龙2 田 莉1 3 1上海市农业科学院林木果树研究所 上海201403 2上海安康园艺工程有限公司 上海201111 3长江大学园艺园林学院 荆州434025 摘 要 以矾根 巴黎 和 闪秋 作为试验材料 分别以叶柄和叶片作为外植体 研究不同暗培养时间以及 不同种类和浓度的植物生长调节剂对矾根不定芽再生的影响 结果表明 矾根再生的最佳暗培养时间为21 d 矾根叶片和叶柄产生不定芽的最适培养基成分分别为MS 0 5 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA和MS 0 2 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA 矾根 巴黎 的不定芽再生率高达89 58 不定芽数为28 50个 矾根 闪秋 的不定芽再 生率可达75 00 不定芽数为21 25个 研究建立的矾根直接再生方法取材范围更广 且更为简便高效 能够 为矾根种苗的快速繁殖 新品种的培育以及利用基因工程手段进行矾根性状的改良提供技术支持 关键词 矾根 再生体系 叶片 叶柄 优化 中图分类号 S682 36 文献标志码 A 文章编号 1000 3924 2020 06 039 05 Optimization of the efficient regeneration system of adventitious shoots induced from petioles and leaf blades of Heuchera spp SUN Yi1 YIN Liqing1 ZHANG Yongchun1 TUO Xiaoqing1 FU Zhenglong2 TIAN Li1 3 1 Forest and Fruit Tree Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403 China 2 Shanghai Ankang Horticulture Engineering Co Ltd Shanghai 201111 China 3 College of Horticulture and Gardening Yangtze University Jingzhou 434025 China Abstract Using Heuchera Paris and H Autumn Bride as experimental varieties petioles and leaf blades were used as explants of initial culture respectively The effects of different periods of darkness culture and different kinds and concentrations of plant growth regulators on the regeneration of adventitious shoots of H spp were studied Results showed that the best darkness culture time for regeneration was 21 days and the optimum medium of adventitious shoots induction were MS 0 5 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA and MS 0 2 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA for petioles and leaf blades respectively Under the optimal treatments established the regeneration rate of adventitious shoots of H Paris was up to 89 58 and the number of adventitious shoots was 28 50 While that of H Paris were 75 00 and 21 25 In this study a more convenient and effective direct regeneration system of H spp was established which could provide important technical support for the rapid propagation of seedlings new varieties cultivations and the improvement of traits by genetic engineering Key words Heuchera spp Regeneration system Leaf blades Petioles Optimization 矾根 Heuchera spp 是虎耳草科矾根属 Heuchera 植物的统称 原产于美洲中部 为宿根花卉类群 其花叶兼美 叶色亮丽且颜色丰富 是不可多得的新优彩叶地被观赏植物 可作为边饰 丛植 地被 盆栽 等材料应用 1 也可用于土壤修复 2 在我国花卉市场上关注度不断上升 目前 大部分矾根品种以无性 繁殖方式进行种苗生产 3 分株繁殖和扦插繁殖周期长 繁殖系数低 受季节影响大 4 组织培养技术 是现今规模化繁育矾根种苗的主要方法 矾根的组培快繁技术绝大部分以芽作为起始扩繁的材料 5 8 孙翊 等 矾根叶柄和叶片不定芽高效再生体系优化 存在取材困难 数量较少 对母株破坏性大等问题 已有的研究显示 矾根叶柄和叶片经诱导均可获得愈 伤组织 然而两者的诱导率不高 分别为19 和11 9 利用矾根叶柄作为起始扩繁材料建立矾根离体 再生体系 不定芽分化率较高 达81 25 10 然而该方法需经过愈伤组织阶段 且期间需要更换培养基 操作较为复杂 植物高效再生体系的建立是成功进行基因转化的基础 能够为深入开展植物遗传机理研究和品质改 良提供重要支撑 11 本研究以矾根无菌苗的叶柄和叶片作为外植体 通过对培养条件和植物生长调节剂 浓度进行筛选 直接诱导并分化获得不定芽 旨在建立一种更为简便 经济且有效的矾根直接再生体系 为矾根种苗的快速繁殖及新品种的培育奠定良好基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 以矾根 巴黎 和 闪秋 无菌苗的叶柄和叶片为外植体 将叶柄剪成0 8 1 cm长 叶片剪成约 0 5 cm 0 5 cm 用于后续接种 1 2 试验方法 将外植体接种于培养基上进行诱导 每皿接种12个外植体 培养基成分 以MS为基本培养基 均添 加3 蔗糖 0 6 琼脂粉 0 1 mg L萘乙酸 Naphthylacetic acid NAA 并分别添加不同浓度的噻重氮苯 基脲 Thidiazuron TDZ 和6 苄氨基嘌呤 6 Benzylaminopurine 6 BA 所有培养基pH均为5 8 并经 121 0 11 MPa的高温 高压灭菌20 min 培养室温度为 24 2 先进行暗培养 再转移至光照强 度为 35 3 mol m2 s 光照12 h 黑暗12 h条件下培养 1 2 1 暗培养时间的筛选 将外植体接种于MS 0 2 mg L TDZ 0 1 mg L NAA培养基上进行培养 暗培养时间设置0 d 7 d 14 d 21 d和28 d共5个处理 之后进行光照培养 每个处理重复4次 接种50 d后统计不定芽再生率和 不定芽数 不定芽再生率 分化获得有效不定芽的外植体数 接种的外植体数 100 不定芽数为每皿 12个外植体总计分化获得的有效不定芽数量 1 2 2 植物生长调节剂种类和浓度的筛选 以MS 0 1 mg L NAA为基础 分别添加不同质量浓度的TDZ 0 1 mg L 0 2 mg L 0 5 mg L 1 0 mg L 或者6 BA 0 2 mg L 0 5 mg L 1 0 mg L 2 0 mg L 配制培养基 将外植体接种于其上进行培 养 暗培养时间为21 d 之后进行光照培养 每个处理重复4次 30 d后统计不定芽再生率和不定芽数 1 3 数据统计 分析采用SPSS 17 0软件进行方差分析 ANOVA 和多重比较分析 Duncan 显著水平P 0 05 表1 不同暗培养时间对矾根叶片不定芽再生的影响 Table 1 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of Heuchera spp 暗培养 时间 d 不定芽再生率 巴黎 闪秋 不定芽数 个 巴黎 闪秋 0 20 83 4 81 b 6 25 4 17 d 3 25 0 96 c 0 75 0 50 d 7 25 00 6 80 b 27 08 4 17 c 4 25 0 96 c 3 75 0 96 c 14 39 58 7 98 a 37 50 4 81 b 6 25 1 89 b 6 50 1 29 b 21 45 83 4 81 a 45 83 4 81 a 8 50 0 58 a 7 75 0 96 a 28 37 50 4 81 a 29 17 8 33 c 6 75 0 96 b 3 50 1 00 c 注 数据为平均数 标准差 同列数据不同小写字母表示差异显著 P 0 05 下同 2 结果与分析 2 1 不同暗培养时间对矾根叶柄和叶片不定芽再生的影响 在不同的暗培养时间条件下 矾根 巴黎 和 闪秋 的叶片和叶柄均能够产生不定芽 不定芽再生率 和不定芽数在处理间具有明显差异 表1和表2 随着暗培养时间的增加 矾根不定芽再生率和不定芽 数均呈现出先升高再下降的趋势 均在暗培养21 d时达到峰值 而品种间具有一定的差异性 巴黎 的 再生情况优于 闪秋 表现为前者的不定芽再生率和不定芽数总体高于后者 此外 在不同外植体材料 04 上 海 农 业 学 报 间 巴黎 叶柄的再生情况优于叶片 而 闪秋 叶片的再生情况优于叶柄 巴黎 的不定芽再生率最高 为56 25 闪秋 为45 83 巴黎 的不定芽数最高为9 75个 闪秋 为7 75个 表2 不同暗培养时间对矾根叶柄不定芽再生的影响 Table 2 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from petioles of H spp 暗培养 时间 d 不定芽再生率 巴黎 闪秋 不定芽数 个 巴黎 闪秋 0 18 75 12 50 c 12 50 4 81 b 2 25 1 50 cd 1 50 0 58 b 7 29 17 4 81 bc 25 00 6 80 a 4 00 0 82 bc 3 25 0 50 a 14 37 50 4 81 b 27 08 4 17 a 5 00 0 82 b 3 50 0 58 a 21 56 25 7 98 a 29 17 4 81 a 9 75 2 22 a 3 75 0 96 a 28 6 25 4 17 d 12 50 4 81 b 0 75 0 50 d 1 75 0 50 b 2 2 植物生长调节剂种类和浓度对矾根叶柄和叶片不定芽再生的影响 以矾根 巴黎 和 闪秋 叶片和叶柄作为外植体 在各自适宜培养基的条件下 叶片为MS 0 5 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA 叶柄为MS 0 2 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA 光照培养10 d左右 即培养30 d左 右 外植体伤口附近均能够出现浅绿色的凸起 表明外植体已经开始进行不定芽的分化 经过50 d左右 的培养 分化获得的不定芽形态十分明显 图1 图2 A B C D A叶片培养30 d B叶柄培养30 d C叶片培养50 d D叶柄培养50 d 图1 矾根 巴黎 不定芽再生情况 Fig 1 The adventitious shoot regeneration of Heuchera Paris A B C D A叶片培养30 d B叶柄培养30 d的 C叶片培养50 d D叶柄培养50 d 图2 矾根 闪秋 不定芽再生情况 Fig 2 The adventitious shoot regeneration of Heuchera H Autumn Bride 表3 不同浓度TDZ与6 BA对矾根叶片不定芽再生的影响 Table 3 Effects of different concentrations of TDZ and 6 BA on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of H spp 质量浓度 mg L 1 不定芽再生率 巴黎 闪秋 不定芽数 个 巴黎 闪秋 TDZ 0 1 37 50 4 81 b 31 25 7 98 b 6 75 0 96 b 5 00 0 82 b 0 2 47 92 4 17 a 43 75 4 17 a 8 00 0 82 a 8 25 0 50 a 0 5 6 25 4 17 c 37 50 4 81 ab 1 00 0 82 c 7 25 1 26 a 1 0 0 00 0 00 d 0 00 0 00 c 0 00 0 00 c 0 00 0 00 c 6 BA 0 2 56 25 10 49 a 66 67 11 79 a 16 75 4 03 a 16 75 3 77 a 0 5 62 50 14 43 a 75 00 6 80 a 20 50 4 04 a 21 25 3 40 a 1 0 60 42 23 94 a 70 83 10 76 a 19 75 5 80 a 18 25 1 71 a 2 0 58 33 6 80 a 58 33 13 61 a 16 50 3 11 a 11 00 3 37 b 由表3可知 随着植物生长调节剂浓度的增加 矾根叶片不定芽再生率和不定芽数均呈现先上升后 下降的趋势 低浓度处理效果优于高浓度 而6 BA的处理效果要优于TDZ 前者处理的 巴黎 平均不定 芽再生率为59 38 闪秋 为67 71 远高于后者的22 92 和28 13 两个品种的叶片再生不定芽 情况均在0 5 mg L 6 BA的培养基上表现最佳 矾根的不定芽再生率达到最高 巴黎 为62 50 闪 秋 为75 00 与此同时 不定芽数也最多 分别为20 50个和21 25个 综上 MS 0 5 mg L 6 BA 14 孙翊 等 矾根叶柄和叶片不定芽高效再生体系优化 0 1 mg L NAA是矾根叶片产生不定芽的最适培养基 由表4可知 随着TDZ及6 BA浓度的增加 矾根叶柄不定芽再生率和不定芽数均呈现下降趋势 且 6 BA的处理效果要优于TDZ 前者处理的 巴黎 平均不定芽再生率为81 25 闪秋 为59 90 远高 于后者处理的34 38 和14 06 在0 2 mg L 6 BA的培养基上 矾根 巴黎 和 闪秋 的叶柄再生不定 芽情况表现最佳 分别为89 58 和77 08 不定芽数也最多 分别为28 50个和12 50个 巴黎 的再 生情况略优于 闪秋 综上 MS 0 2 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA是矾根叶柄产生不定芽的最适培 养基 表4 不同浓度TDZ与6 BA对矾根叶柄不定芽再生的影响 Table 4 Effects of TDZ and 6 BA concentrations on the adventitious shoot regeneration from petioles of H spp 质量浓度 mg L 1 不定芽再生率 巴黎 闪秋 不定芽数 个 巴黎 闪秋 TDZ 0 1 79 17 10 76 a 22 92 4 17 a 14 50 2 65 a 3 00 0 82 a 0 2 56 25 7 98 b 25 00 6 80 a 10 25 1 71 b 3 25 0 96 a 0 5 2 08 4 17 c 6 25 4 17 b 0 25 0 50 c 0 75 0 50 b 1 0 0 00 0 00 c 2 08 4 17 b 0 00 0 00 c 0 25 0 50 b 6 BA 0 2 89 58 7 98 a 77 08 4 17 a 28 50 5 69 a 12 50 2 38 a 0 5 85 42 4 17 a 62 50 4 81 b 27 25 8 85 a 10 50 1 29 a 1 0 87 50 8 33 a 72 92 12 50 ab 28 00 5 35 a 10 00 2 16 a 2 0 62 50 4 81 b 27 08 7 98 c 13 75 1 26 b 3 25 0 96 b 3 讨论 不同基因型矾根属植物愈伤组织诱导效果不同 红花矾根 H sanguinea 叶柄在MS 4 40 mol L 6 BA 0 19 mol L NAA培养基上的愈伤组织诱导率最高可达90 12 而矾根 H micrantha 叶柄在 MS 6 BA 0 5 mg L的培养基上愈伤组织诱导率仅为19 9 田莉等 10 以矾根 巴黎 叶柄作为起始扩 繁材料 经过60 d左右的诱导及分化培养 获得的不定芽分化率为81 25 相对较低 且操作复杂 污染 几率大 本文建立的方法适用于两种不同的矾根品种 其外植体在同一种培养基上经过50 d左右的培养 可获得不定芽 是今后进行矾根属植物不定芽再生研究的首选方法之一 光照对植物器官的形成具有诱导作用 外植体在暗培养下进行脱分化 在光照培养下进行再分化 最 终可形成愈伤组织和不定芽 13 14 在蝴蝶兰 枣树等的研究中发现 适当长度的暗培养有利于不定芽的 再生 15 16 本研究结果表明 暗培养时间过短或过长均不利于矾根不定芽再生 21 d是矾根不定芽再生 的最佳暗培养时间 植物生长调节剂的种类 浓度与配比是调节外植体形成愈伤组织或不定芽的重要影响因素 17 18 田 莉等 10 研究显示 低浓度的NAA更适宜矾根 巴黎 愈伤组织的诱导 且在MS 0 5 mg L 6 BA 0 5 mg L NAA培养基上仅产生愈伤组织 无法分化获得不定芽 10 邹清成等 19 利用矾根叶片作为外植 体 在MS 2 0 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA培养基上诱导获得愈伤并进一步形成不定芽 分化率为 68 67 相对较低 矾根 巴黎 和 闪秋 在MS 2 0 mg L 6 BA 0 1 mg L NAA培养基上 诱导率不高 的同时还会出现一定程度的玻璃化现象 会对后续获得种苗的质量产生不利影响 本研究结果表明 多 种植物生长调节剂的复合使用 能够达到在同一种培养基上完成脱分化和再分化过程的效果 使矾根获 得较高的不定芽再生率 培养基中添加的NAA能够与细胞分裂素相互作用促进矾根愈伤组织的诱导 添加TDZ或6 BA能够有效促进矾根不定芽的分化 但是 若植物生长调节剂浓度过低 则不能够有效促 进外植体再生 浓度过高 则易产生玻璃化问题 1 本研究建立的矾根不定芽再生方法 利用含有较低浓 度植物生长调节剂的培养基 结合光照条件的变化 21 d暗培养和30 d光照培养 叶柄和叶片两种外植 体上均再生出优质的矾根不定芽 该方法在获得较高不定芽再生率的同时解决了不定芽的玻璃化问题 并可减少变异产生 不定芽再生效果良好 综上 本研究以叶柄和叶片作为外植体 通过开展不同暗培养时间以及不同植物生长调节剂种类和 浓度对矾根不定芽再生影响的研究 建立了一种取材范围更广且更为简便 经济且有效的矾根不定芽再 生方法 该方法可以克服以芽作为起始扩繁材料的局限 进一步扩大了外植体取材范围 提高矾根的不 24 上 海 农 业 学 报 定芽再生率 矾根 巴黎 高达89 58 在同一种培养基上经诱导和分化直接再生获得不定芽 有效简 化操作并节约生产成本 同时 优化了矾根不定芽高效再生体系 能够为种苗的快速繁殖 新品种培育以 及利用基因工程手段进行性状的改良提供良好的技术支持 本研究显示 矾根叶柄比叶片更容易诱导产 生不定芽 但在相同外植体个数下获得的不定芽数量在不同品种间具有差异 针对特定矾根品种 可对 其叶柄和叶片诱导产生的不定芽数量进行比较 从而确定该品种不定芽再生的最佳外植体材料 参 考 文 献 1 孙翊 殷丽青 支月娥 等 矾根 紫色宫殿 离体培养与快繁技术研究 J 上海农业学报 2019 35 3 85 89 2 SAKOL G MIROSLAWSKI J BREWCZYNSKI P Z Efficient Pb translocation by Purple Petticoats cv of Heuchera L from contaminated soil in a coal 6 Basin J Pol J Environ Stud 2014 23 6 2199 2205 3 殷丽青 谢苗苗 孙翊 等 彩叶植物矾根的研究进展 J 上海农业学报 2018 34 1 138 143 4 李春辉 黄少玲 郭翔 等 我国矾根研究进展 J 安徽农学通报 2017 23 15 109 111 134 5 孙国峰 张金政 吴东启 矾根杂种 银王子 的组织培养和快速繁殖 J 植物生理学报 2007 43 3 500 6 陈宏 唐莹 施月欢 等 矾根的组织培养与快速繁殖 J 上海农业学报 2011 27 4 80 82 7 高燕 宋垚 叶康 等 矾根欧布西迪昂组培快繁技术 J 浙江农业科学 2015 1 6 895 898 8 李川 封梦 张浩 四种不同矾根品种组培快繁技术研究 J 安徽科技学院学报 2019 33 2 39 43 9 陈锦 杨侃侃 王志伟 等 美洲矾根愈伤组织诱导及其快繁技术体系研究 J 湖北农业科学 2017 56 5 973 975 10 田莉 孙翊 张永春 等 矾根叶柄愈伤组织诱导及植株再生技术 J 分子植物育种 2019 17 14 4769 4775 11 黄帆 李俊 刘磊 等 无芒雀麦组织培养再生体系的建立 J 植物生理学报 2018 54 5 783 789 12 HOSOKI T KAJINO E Shoot regeneration from petioles of coral bells Heuchera sanguine Engelm cultured in vitro and subsequent planting and flowering ex vitro J Vitro Cellular Developmental Biology Plant 2003 39 2 135 138 13 杨秀莲 胡蝶 宋佳妮 等 海州常山叶片愈伤组织诱导及不定芽再生 J 东北林业大学学报 2018 46 7 28 32 101 14 张旭红 王頔 梁振旭 等 欧洲百合愈伤组织诱导及植株再生体系的建立 J 植物学报 2018 53 6 840 847 15 陆顺教 易双双 任羽 等 TDZ和暗培养对蝴蝶兰叶片不定芽发生的影响 J 热带农业科学 2015 35 7 22 26 35 16 HOU L WANG Y CUI Y H et al Optimisation of a highly efficient shoot regeneration system using leaf explants of Chinese jujube Ziziphus jujuba Mill by response surface ology J The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 2018 93 3 289 295 17 吴丽芳 魏晓梅 陆伟东 白刺花胚性愈伤组织诱导和植株再生体系建立 J 植物生理学报 2019 55 2 218 224 18 肖望 涂红艳 张爱玲 白姜花胚性愈伤组织的诱导与植株再生体系的建立 J 园艺学报 2016 43 8 1605 1612 19 邹清成 马广莹 史小华 等 矾根叶片离体快繁及工厂化生产技术研究 J 分子植物育种 2018 16 9 2920 2925 责任编辑 郭娇 34