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草莓炭疽病拮抗菌SKL108的分离、鉴定及拮抗活性.pdf

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草莓炭疽病拮抗菌SKL108的分离、鉴定及拮抗活性.pdf

书 书 书 刘 程 程 王 媛 花 张 雯 婷 等 草 莓 炭 疽 病 拮 抗 菌 的 分 离 鉴 定 及 拮 抗 活 性 江 苏 农 业 科 学 草 莓 炭 疽 病 拮 抗 菌 的 分 离 鉴 定 及 拮 抗 活 性 刘 程 程 王 媛 花 张 雯 婷 储 西 平 明 亮 江 苏 省 苏 科 农 化 有 限 责 任 公 司 江 苏 南 京 江 苏 省 农 业 科 学 院 江 苏 南 京 江 苏 农 林 职 业 技 术 学 院 江 苏 镇 江 摘 要 为 了 寻 找 优 质 高 效 的 生 物 菌 种 资 源 从 森 林 土 壤 中 分 离 出 个 菌 落 特 征 相 异 的 细 菌 以 草 莓 炭 疽 病 病 原 菌 为 指 示 菌 进 行 平 板 对 峙 试 验 筛 选 出 一 株 拮 抗 效 果 最 强 的 生 防 菌 抑 菌 率 高 达 经 系 统 进 化 树 分 析 结 合 细 胞 形 态 学 观 察 和 生 理 生 化 指 标 结 果 分 析 将 该 菌 株 鉴 定 为 萨 拉 曼 卡 假 单 胞 菌 利 用 平 板 对 峙 培 养 法 研 究 该 菌 株 的 抑 菌 谱 结 果 表 明 菌 株 对 多 种 病 原 真 菌 的 生 长 具 有 明 显 的 抑 制 作 用 包 括 常 见 的 番 茄 灰 葡 萄 孢 菌 水 稻 立 枯 丝 核 菌 小 麦 禾 谷 镰 孢 菌 等 这 一 研 究 结 果 是 萨 拉 曼 卡 假 单 胞 菌 作 为 生 防 菌 在 农 业 上 的 首 次 报 道 也 表 明 该 菌 株 具 有 开 发 成 生 物 菌 剂 的 潜 力 关 键 词 拮 抗 菌 草 莓 炭 疽 病 筛 选 萨 拉 曼 卡 假 单 胞 菌 中 图 分 类 号 文 献 标 志 码 文 章 编 号 收 稿 日 期 基 金 项 目 江 苏 省 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金 编 号 作 者 简 介 刘 程 程 女 江 苏 徐 州 人 硕 士 助 理 研 究 员 主 要 从 事 生 物 农 药 的 开 发 和 应 用 研 究 通 信 作 者 明 亮 副 研 究 员 主 要 从 事 农 药 剂 型 的 开 发 和 应 用 研 究 在 自 然 生 态 系 统 中 农 作 物 面 临 多 种 病 原 菌 的 侵 染 威 胁 近 年 来 农 作 物 种 类 和 栽 培 方 式 多 样 化 使 得 作 物 病 害 日 趋 严 重 草 莓 因 其 口 感 和 营 养 越 来 越 受 到 消 费 者 的 欢 迎 但 草 莓 病 害 大 量 发 生 消 费 者 对 草 莓 上 农 药 残 留 更 加 关 注 近 年 来 随 着 全 国 范 围 内 设 施 草 莓 的 种 植 面 积 不 断 扩 大 空 间 密 闭 形 成 高 温 高 湿 环 境 使 草 莓 炭 疽 病 发 生 日 益 严 重 造 成 草 莓 减 产 草 莓 炭 疽 病 在 草 莓 整 个 生 育 期 都 能 发 生 危 害 以 苗 期 和 移 栽 期 最 为 严 重 它 是 由 草 莓 炭 疽 菌 胶 孢 炭 疽 菌 和 尖 孢 炭 疽 菌 等 引 起 的 主 要 危 害 匍 匐 茎 和 根 冠 造 成 根 冠 腐 烂 最 终 导 致 植 株 萎 蔫 死 亡 已 严 重 制 约 了 草 莓 产 业 的 健 康 发 展 目 前 国 内 的 防 治 措 施 正 往 生 物 防 治 方 面 发 展 不 仅 因 其 环 境 友 好 对 人 类 健 康 安 全 而 且 在 防 病 的 同 时 还 能 提 高 作 物 的 品 质 和 产 量 关 于 草 莓 炭 疽 病 的 生 物 防 治 近 年 来 国 内 外 有 少 量 报 道 等 利 用 种 木 霉 菌 的 提 取 物 防 治 草 莓 葡 萄 的 炭 疽 病 和 灰 霉 病 并 取 得 了 良 好 效 果 张 雪 等 的 研 究 也 证 实 了 木 霉 菌 剂 能 显 著 提 高 红 颜 草 莓 植 株 对 炭 疽 病 的 抗 病 性 魏 彩 燕 等 鉴 定 出 株 生 防 菌 生 防 菌 株 对 草 莓 炭 疽 病 的 生 长 抑 制 率 达 但 国 内 的 报 道 都 尚 在 研 究 阶 段 暂 时 还 未 有 产 品 登 记 因 此 对 草 莓 炭 疽 病 有 拮 抗 效 果 的 拮 抗 生 防 菌 亟 待 开 发 本 研 究 从 南京 紫 金 山 森 林 土 壤 这 一 相 对 原 始 的 生 态 环 境 中 筛 选 出 株 对 草 莓 炭 疽 病 菌 有 强 烈 的 拮 抗 效 果 的 生 防 菌 经 细 胞 形 态 学 观 察 生 理 生 化 指 标 结 果 分 析 以 及 系 统 进 化 树 分 析 鉴 定 为 萨 拉 曼 卡 假 单 胞 菌 并 利 用 平 板 对 峙 培 养 法 研 究 了 的 抑 菌 谱 这 为 草 莓 炭 疽 病 生 物 防 治 提 供 了 优 良 的 菌 种 资 源 更 为 假 单 胞 菌 属 作 为 拮 抗 菌 开 发 提 供 了 理 论 基 础 材 料 与 方 法 供 试 植 物 病 原 菌 草 莓 炭 疽 病 菌 草 莓 灰 霉 病 葡 萄 溃 疡 病 病 原 菌 均 由 江 苏 省 丘 陵 地 区 镇 江 农 业 科 学 研 究 所 提 供 水 稻 纹 枯 病 水 稻 恶 苗 病 水 稻 稻 曲 病 小 麦 纹 枯 病 小 麦 赤 霉 病 小 麦 全 蚀 病 番 茄 灰 霉 病 病 原 菌 均 由 江 苏 省 农 业 科 学 院 提 供 培 养 基 及 主 要 试 剂 拮 抗 菌 分 离 采 用 培 养 基 胰 蛋 白 胨 江 苏 农 业 科 学 年 第 卷 第 期 大 豆 蛋 白 胨 琼 脂 蒸 馏 水 值 拮 抗 菌 培 养 采 用 培 养 基 胰 蛋 白 胨 酵 母 提 取 物 蒸 馏 水 值 草 莓 炭 疽 病 病 原 菌 培 养 和 平 板 对 峙 试 验 采 用 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 水 值 自 然 生 化 试 剂 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 片 段 扩 增 所 用 的 各 种 酶 等 试 剂 均 为 宝 生 物 工 程 大 连 有 限 公 司 产 品 其 余 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 拮 抗 菌 的 分 离 在 南 京 紫 金 山 森 林 的 土 层 中 随 机 选 取 土 壤 样 品 份 自 然 晾 干 称 取 土 壤 样 品 份 混 合 均 匀 称 取 混 合 土 样 倒 入 三 角 瓶 中 用 无 菌 水 定 容 至 加 入 适 量 灭 菌 的 玻 璃 珠 置 于 水 平 摇 床 太 仓 华 美 生 化 仪 器 厂 振 荡 混 匀 制 成 土 壤 悬 浮 液 依 次 加 无 菌 水 稀 释 制 成 浓 度 梯 度 的 系 列 土 壤 悬 浮 液 取 各 稀 释 液 涂 布 于 固 体 培 养 基 上 于 下 光 照 培 养 后 根 据 菌 落 特 征 挑 选 出 单 个 菌 落 划 线 纯 化 次 纯 化 后 的 细 菌 菌 株 置 于 液 体 培 养 基 中 于 下 培 养 过 夜 后 冰 箱 保 存 拮 抗 菌 的 筛 选 草 莓 炭 疽 病 菌 拮 抗 细 菌 初 筛 和 复 筛 采 用 对 峙 生 长 法 将 各 细 菌 在 固 体 培 养 基 上 活 化 然 后 分 别 移 入 培 养 液 中 振 荡 培 养 获 得 拮 抗 菌 液 将 草 莓 炭 疽 病 菌 在 固 体 培 养 基 上 活 化 沿 菌 落 边 缘 用 直 径 打 孔 器 打 孔 将 菌 饼 置 于 空 白 平 板 中 央 培 养 皿 四 周 呈 十 字 形 点 接 拮 抗 菌 液 距 培 养 皿 中 心 每 个 处 理 重 复 皿 设 清 水 对 照 恒 温 培 养 待 对 照 平 板 菌 落 长 满 时 测 量 拮 抗 带 宽 并 计 算 抑 菌 率 抑 菌 率 对 照 菌 落 直 径 处 理 菌 落 直 径 对 照 菌 落 直 径 拮 抗 菌 的 鉴 定 拮 抗 菌 的 提 取 将 对 峙 筛 选 的 拮 抗 菌 在 固 体 培 养 基 上 划 线 恒 温 培 养 挑 取 单 菌 落 摇 床 培 养 过 夜 离 心 培 养 的 菌 液 收 集 菌 体 利 用 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 提 取 拮 抗 菌 保 存 基 因 扩 增 将 提 取 好 的 拮 抗 细 菌 进 行 反 应 所 用 引 物 为 通 用 引 物 反 应 采 用 体 系 浓 缩 反 应 缓 冲 液 混 合 物 上 游 引 物 下 游 引 物 模 板 无 菌 水 补 齐 反 应 程 序 预 变 性 变 性 退 火 延 伸 个 循 环 延 伸 将 扩 增 产 物 进 行 电 泳 检 测 切 胶 回 收 后 送 至 南 京 金 斯 瑞 生 物 科 技 有 限 公 司 测 序 测 序 得 到 的 碱 基 序 列 在 中 进 行 同 源 序 列 分 析 并 用 软 件 构 建 系 统 进 化 树 拮 抗 菌 的 生 理 生 化 分 析 根 据 初 步 鉴 定 的 菌 株 种 类 参 考 伯 杰 氏 系 统 细 菌 学 手 册 选 择 所 需 测 定 的 生 理 生 化 项 目 测 定 菌 株 的 生 理 生 化 反 应 菌 株 抗 菌 谱 测 定 采 用 对 峙 生 长 法 测 定 对 种 植 物 病 原 真 菌 的 抑 制 作 用 将 各 病 原 菌 在 固 体 培 养 基 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防 控 但 化 学 农 药 会 导 致 炭 疽 病 菌 抗 药 性 不 断 增 加 防 治 效 果 越 来 越 不 理 想 韩 国 兴 等 曾 报 道 多 年 连 续 使 用 多 菌 灵 和 乙 霉 威 防 治 草 莓 炭 疽 病 导 致 高 抗 菌 株 的 比 例 达 以 上 单 剂 和 两 者 的 混 剂 都 不 宜 再 推 广 应 用 鉴 于 化 学 农 药 导 致 的 抗 性 和 残 留 问 题 在 草 莓 产 业 中 越 来 越 受 到 重 视 利 用 拮 抗 生 防 菌 防 治 草 莓 炭 疽 病 成 为 一 种 极 具 发 展 潜 力 的 防 治 措 施 假 单 胞 菌 属 是 土 壤 中 分 布 最 广 的 微 生 物 类 群 之 一 也 是 一 种 重 要 的 植 物 根 际 促 生 菌 等 证 实 植 物 根 际 假 单 胞 菌 应 用 在 谷 物 种 子 或 土 壤 中 可 以 抑 制 病 原 菌 的 生 长 其 作 用 机 理 主 要 包 括 根 际 营 养 竞 争 分 泌 降 解 微 生 物 的 酶 及 抗 生 作 用 等 据 江 苏 农 业 科 学 年 第 卷 第 期 表 菌 株 的 细 胞 形 态 和 生 理 生 化 特 征 试 验 项 目 结 果 试 验 项 目 结 果 试 验 项 目 结 果 细 胞 形 态 杆 状 革 兰 氏 染 色 试 验 半 乳 糖 苷 酶 精 氨 酸 双 水 解 酶 柠 檬 酸 的 产 生 触 酶 葡 萄 糖 明 胶 液 化 氧 化 酶 羟 基 苯 乙 酸 丙 酮 酸 甲 酯 糊 精 甘 露 糖 甘 氨 酸 脯 氨 酸 麦 芽 糖 果 糖 丙 氨 酸 海 藻 糖 半 乳 糖 精 氨 酸 乳 酸 甲 酯 乳 酸 柠 檬 酸 纤 维 二 糖 甲 基 葡 萄 糖 天 冬 氨 酸 酮 戊 二 酸 苹 果 酸 苹 果 酸 龙 胆 二 糖 岩 藻 糖 谷 氨 酸 蔗 糖 岩 藻 糖 组 氨 酸 松 二 糖 鼠 李 糖 焦 谷 氨 酸 水 苏 糖 肌 苷 丝 氨 酸 溴 代 丁 二 酸 吐 温 氨 基 丁 酸 棉 子 糖 山 梨 醇 果 胶 乳 糖 甘 露 醇 半 乳 糖 醛 酸 蜜 二 糖 阿 糖 醇 半 乳 糖 酸 内 酯 羟 丁 酸 羟 基 丁 酸 丁 酮 酸 甲 基 葡 糖 苷 肌 醇 葡 糖 酸 水 杨 苷 甘 油 葡 萄 糖 醛 酸 乙 酰 葡 糖 胺 葡 糖 磷 酸 葡 糖 醛 酰 胺 乙 酰 乙 酸 果 糖 磷 酸 黏 酸 乙 酰 半 乳 糖 胺 天 冬 氨 酸 奎 宁 酸 乙 酰 神 经 氨 酸 丝 氨 酸 糖 质 酸 甲 酸 乙 酸 丙 酸 注 表 示 阳 性 表 示 阴 性 报 道 假 单 胞 菌 可 以 产 生 多 种 抗 生 素 如 二 乙 酰 基 间 苯 三 酚 吩 嗪 酸 硝 吡 咯 菌 素 根 菌 素 假 单 胞 菌 酸 等 能 大 大 减 轻 病 原 菌 对 植 物 的 侵 染 目 前 假 单 胞 菌 在 生 物 防 治 领 域 研 究 最 为 深 入 的 是 荧 光 假 单 胞 菌 它 产 生 的 噬 铁 素 能 促 进 植 物 生 长 的 同 时 抑 制 植 物 病 害 的 发 生 除 噬 铁 素 外 它 还 能 够 产 生 十 几 种 抗 生 性 次 级 代 谢 产 物 在 生 防 菌 剂 的 开 发 及 应 用 方 面 具 有 巨 大 的 潜 力 本 研 究 从 相 对 原 始 的 森 林 土 壤 中 分 离 筛 选 出 江 苏 农 业 科 学 年 第 卷 第 期 表 菌 株 对 种 植 物 病 原 真 菌 营 养 生 长 的 抑 制 效 果 测 定 病 原 真 菌 抑 制 率 草 莓 炭 疽 病 菌 草 莓 灰 霉 病 水 稻 稻 曲 病 水 稻 纹 枯 病 水 稻 恶 苗 病 番 茄 灰 霉 病 葡 萄 溃 疡 病 小 麦 赤 霉 病 小 麦 全 蚀 病 小 麦 纹 枯 病 注 数 据 后 不 同 小 写 字 母 表 示 不 同 病 原 真 菌 间 抑 菌 效 果 达 显 著 差 异 株 对 草 莓 胶 孢 炭 疽 菌 有 强 烈 抑 制 效 果 的 拮 抗 生 防 菌 菌 株 经 细 胞 形 态 观 察 生 理 生 化 测 定 及 系 统 进 化 树 分 析 等 鉴 定 该 菌 株 为 假 单 胞 菌 属 与 荧 光 假 单 胞 菌 有 很 高 的 亲 缘 关 系 菌 株 发 酵 液 对 草 莓 炭 疽 病 的 抑 制 率 高 达 且 抑 菌 谱 较 广 这 一 研 究 结 果 为 开 发 高 效 安 全 的 生 防 菌 剂 拓 宽 了 研 究 方 向 也 提 供 了 优 质 的 菌 种 资 源 尽 管 室 内 生 物 测 定 试 验 中 菌 株 抑 菌 作 用 效 果 明 显 但 还 须 要 进 行 大 量 的 实 践 工 作 才 能 明 确 抑 菌 作 用 机 理 和 田 间 试 验 防 治 效 果 因 此 下 一 步 的 研 究 重 点 是 初 步 筛 选 菌 株 的 初 生 代 谢 产 物 和 次 生 代 谢 产 物 同 时 明 确 田 间 防 效 以 期 开 发 出 优 质 高 效 的 生 物 菌 剂 参 考 文 献 胡 德 玉 钱 春 刘 雪 峰 草 莓 炭 疽 病 研 究 进 展 中 国 蔬 菜 任 海 英 蒋 桂 华 方 丽 等 浙 江 省 草 莓 炭 疽 病 菌 鉴 定 及 生 物 学 特 性 研 究 浙 江 农 业 学 报 任 小 杰 梁 艳 陆 金 萍 上 海 地 区 草 莓 炭 疽 病 病 原 鉴 定 植 物 病 理 学 报 李 娟 刘 丹 梅 王 东 来 等 草 莓 炭 疽 病 拮 抗 放 线 菌 的 筛 选 及 鉴 定 西 南 农 业 学 报 吉 沐 祥 杨 敬 辉 吴 祥 等 草 莓 炭 疽 病 的 生 物 防 治 江 苏 江 苏 农 业 科 学 年 第 卷 第 期 书 书 书 櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 櫄櫄櫄櫄 櫄櫄櫄櫄櫄 櫄櫄櫄 櫄 櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 櫄櫄櫄櫄 櫄櫄櫄櫄櫄櫄 农 业 学 报 陈 哲 黄 静 赵 佳 等 防 治 草 莓 炭 疽 病 的 芽 胞 杆 菌 组 合 的 筛 选 中 国 生 物 防 治 学 报 杨 华 纪 明 山 李 广 旭 等 不 同 发 酵 条 件 对 苹 果 轮 纹 病 拮 抗 细 菌 生 长 的 影 响 果 树 学 报 张 雪 张 志 宏 刘 月 学 等 木 霉 菌 剂 提 高 红 颜 草 莓 炭 疽 病 抗 性 的 效 应 西 北 农 业 学 报 魏 彩 燕 毛 雪 琴 柴 荣 耀 等 草 莓 炭 疽 病 生 防 菌 株 的 鉴 定 及 生 物 学 特 性 菌 物 学 报 王 刚 李 志 强 小 麦 内 生 细 菌 的 分 离 及 其 对 小 麦 纹 枯 菌 的 拮 抗 作 用 微 生 物 学 通 报 董 汉 松 植 病 研 究 法 北 京 中 国 农 业 出 版 社 韩 国 兴 礼 茜 孙 飞 洲 等 杭 州 地 区 草 莓 炭 疽 病 病 原 鉴 定 及 其 对 多 菌 灵 和 乙 霉 威 的 抗 药 性 浙 江 农 业 科 学 邱 德 文 我 国 植 物 病 害 生 物 防 治 的 现 状 及 发 展 策 略 植 物 保 护 张 力 群 张 俊 威 假 单 胞 菌 产 生 的 抗 生 素 中 国 生 物 防 治 学 报 张 伟 琼 聂 明 肖 明 荧 光 假 单 胞 菌 生 防 机 理 的 研 究 进 展 生 物 学 杂 志 刘 冲 邢 锦 城 魏 福 友 等 外 源 硝 态 氮 对 盐 胁 迫 下 马 齿 苋 谷 氨 酸 积 累 及 其 代 谢 酶 活 性 的 影 响 江 苏 农 业 科 学 外 源 硝 态 氮 对 盐 胁 迫 下 马 齿 苋 谷 氨 酸 积 累 及 其 代 谢 酶 活 性 的 影 响 刘 冲 邢 锦 城 魏 福 友 董 静 朱 小 梅 洪 立 洲 江 苏 沿 海 地 区 农 业 科 学 研 究 所 江 苏 盐 城 盐 城 市 新 洋 农 业 试 验 站 江 苏 盐 城 摘 要 为 了 阐 明 外 源 硝 态 氮 对 盐 胁 迫 下 马 齿 苋 谷 氨 酸 积 累 及 其 代 谢 酶 活 性 的 影 响 采 用 石 英 砂 砂 培 试 验 以 苏 马 齿 苋 号 为 材 料 设 定 个 浓 度 个 外 增 硝 态 氮 浓 度 培 养 后 对 马 齿 苋 各 项 指 标 进 行 测 定 结 果 表 明 在 盐 分 处 理 下 马 齿 苋 生 物 量 可 溶 性 蛋 白 含 量 谷 氨 酸 含 量 以 及 谷 氨 酸 合 成 酶 活 性 谷 氨 酸 脱 氢 酶 活 性 明 显 高 于 盐 分 处 理 在 盐 分 处 理 下 各 指 标 数 值 明 显 降 低 整 体 上 看 外 源 硝 态 氮 的 添 加 可 增 加 盐 胁 迫 下 马 齿 苋 生 物 量 可 溶 性 蛋 白 含 量 谷 氨 酸 含 量 以 及 谷 氨 酸 合 成 酶 的 活 性 基 本 呈 现 的 趋 势 但 对 盐 胁 迫 下 马 齿 苋 谷 氨 酸 脱 氢 酶 活 性 的 影 响 不 显 著 由 此 可 见 外 源 硝 态 氮 可 有 效 促 进 盐 胁 迫 下 马 齿 苋 中 谷 氨 酸 的 积 累 提 高 其 代 谢 关 键 酶 活 性 以 处 理 浓 度 外 源 硝 态 氮 浓 度 效 果 最 佳 关 键 词 硝 态 氮 盐 胁 迫 马 齿 苋 谷 氨 酸 代 谢 酶 中 图 分 类 号 文 献 标 志 码 文 章 编 号 收 稿 日 期 基 金 项 目 江 苏 省 农 业 科 技 自 主 创 新 资 金 编 号 作 者 简 介 刘 冲 男 江 苏 盐 城 人 硕 士 副 研 究 员 主 要 从 事 耐 盐 植 物 栽 培 利 用 研 究 通 信 作 者 洪 立 洲 硕 士 研 究 员 主 要 从 事 土 壤 肥 料 与 盐 土 农 业 工 程 研 究 近 年 来 研 究 者 们 普 遍 认 为 土 壤 盐 渍 化 是 全 国 乃 至 全 球 限 制 农 业 生 产 力 发 展 的 主 要 因 子 之 一 我 国 滩 涂 资 源 丰 富 盐 碱 地 总 面 积 达 万 苏 北 地 区 拥 有 全 国 的 盐 碱 地 且 每 年 在 不 断 淤 涨 年 淤 涨 面 积 达 合 理 地 开 发 利 用 广 大 滩 涂 资 源 使 盐 碱 地 变 废 为 宝 是 近 年 来 研 究 的 焦 点 马 齿 苋 为 马 齿 苋 科 马 齿 苋 属 草 本 植 物 是 我 国 原 卫 生 部 审 定 的 药 食 同 源 型 植 物 其 氨 基 酸 含 量 极 为 丰 富 马 齿 苋 的 环 境 适 江 苏 农 业 科 学 年 第 卷 第 期

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