不同施肥处理对土壤微生物群落结构及西瓜枯萎病发生的影响.pdf

p344589-597 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 中国生物防治学报 nbsp;Chinese Journal of Biological Control nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;2018 年 8 月 nbsp;收稿日期 2018-01-02 基金项目公益性行业（农业）科研专项（ 201503110-03） ；国家重点研发计划（ 2017YFD0200606） nbsp;作者简介朱菲莹，女，硕士，助理研究员， E-mail ； *通信作者，博士，研究员， E-mail 。 DOI 10.16409/ki.2095-039x.2018.04.014 不同施肥处理对土壤微生物群落结构 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 及西瓜枯萎病发生的影响 nbsp;朱菲莹1，田 程1,3，张 nbsp;屹1，肖姬玲1，魏 林2，梁志怀1*1.湖南省农业生物技术研究所，长沙 nbsp;410125； 2. 湖南省植物保护研究所，长沙 nbsp;410125； 3. 湖南大学研究生院隆平分院，长沙 nbsp;410125 摘要研究不同肥料组合对西瓜枯萎病发生的影响，寻找与西瓜幼苗发病密切相关的菌群种类。设置3组不同土壤肥料组合，依次为对照组CK、T1、T2。利用Illumina Miseq高通量测序平台对试验组和对照组之间的土壤微生物群落组成在16S rDNA水平上进行测序分析。通过对测序结果在OTU和种群相对丰度的计算和分析发现，CK组中平均共获得28986条序列，T1组中平均共有30308条序列，T2组中平均共有29730个条序列；三组共有细菌OTU数量为860，占各组分平均总OTU数量的50以上，其中芽胞杆菌属Bacillus、肠球菌属Enterococcus、乳球菌属Lactococcus、梭菌属Clostridium在T1组中相对丰度最高；而2种未知细菌unclassified_TM7-1c和unclassified_Ellin329o在T2组中的相对丰度值最高。西瓜枯萎病发病率情况为CK＞ T1＞ T2，施用棉隆＋生物有机肥可以通过重建土壤生态环境，提高土壤细菌多样性，从而对西瓜枯萎病有显著的防治作用。 关 nbsp;键 nbsp;词西瓜；土壤微生物群落；生物有机肥；16S rDNA；枯萎病 nbsp;中图分类号 S476，S651 nbsp; nbsp;文献标识码 A nbsp; nbsp;文章编号 1005-9261201804-0589-09 Effects of Different Fertilization Treatments on Soil Microbial Community Structure and the Occurrence of Watermelon Wilt ZHU Feiying1, TIAN Cheng1,3, ZHANG Yi1, XIAO Jiling1, WEI Lin2, LIANG Zhihuai1*1. Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute, Changsha 410125, China; 2. Institute of Plant Protection, Changsha 410125, China; 3. Graduate School of Hunan University, Longping Branch, Changsha 410125, China Abstract The objective of this study was to compare the effects of different fertilizer combinations on occurrence of fusarium wilt of watermelon and to excavate the closely related genus to the disease of watermelon seedlings. The composition of bacterial communities of soil samples fertilized by 3 different soil fertilizer combination groups, followed by the control group CK, T1 and T2, were compared to that of bacterial communities by the Illumina Meseq plat targeting the V3-V4 regions of 16S rDNA. Through the sequencing results analysis in OTU and the relative abundance of the population, we have find 28986 tags in CK, 30308 tags in T1, and 29730 tags in T2, and there are 860 OTUs in common, which is more than 50 within average of each treatment. And in the genus top 10 bacteria population, the abundance of Bacillus, Enterococcus, Lactococcus, Clostridium in T1 was apparently higher than others, while the unclassified_TM7-1c and unclassified_Ellin329o were significantly high in T2. The incidence of watermelon Fusarium wilt is CK＞ T1＞ T2. The application of BasamidBio-organic fertilizer can be used to rebuild the soil ecological environment and help to improve the soil bacterial diversity, which has a significant preventive effect on watermelon fasurium wilt. nbsp;Key words watermelon; soil microbes; bio-organic fertilizer; 16S rDNA; Fusarium wilt 590 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 中 nbsp;国 nbsp;生 nbsp;物 nbsp;防 nbsp;治 nbsp;学 nbsp;报 nbsp; nbsp;第 34 卷 nbsp;西瓜为葫芦科植物，是世界上重要的园艺作物之一。西瓜枯萎病的发生是造成西瓜产量降低和品质下降的重要原因[1]。因此，研究通过施用生物有机肥，调节土壤微生物群落结构，达到防治西瓜枯萎病的目的，不仅有利于增加瓜农收入、还可以减少环境污染和维持农业可持续发展，对发展西瓜生产具有重大的理论和生产意义。通过增加有机碳源可促进土壤生物多样性恢复，抑制病原菌种群数量的增长。大量研究表明不同类型外源有机物的投入对土壤微生物种群数量及其群落结构调控的机制存在着显著性差异[2−5]。施用生物有机肥不仅可以增进土壤肥力，而且能改善作物根系微生态环境中的理化性状，从而提高有益微生物活性及作物的抗病能力[6−10]。邵丽等[11]通过盆栽试验研究了生物复混肥对土壤微生物功能多样性的影响，发现通过调节生物复混肥的施用比等能提高土壤微生物对碳源的利用率、微生物群落的丰富度。邵丽等[12]分析了不同施肥处理土壤微生物群落结构，表明猪粪＋化肥处理和秸秆＋化肥处理微生物群落代谢活性和数量显著高于化肥和不施肥处理。以西瓜早佳 8424 为材料，通过 Illumina Miseq 平台测序，差异比较生物有机肥对西瓜枯萎病发生及土壤微生物多样性的影响。该研究旨在用不同的生物有机肥处理的土壤为材料，比较对照组、 T1、 T2 中特有或含量显著升高的菌群种类的变化，分析土壤微生物的菌落变化以及对西瓜生长的变化，以期找到与西瓜枯萎病的相关群落结构。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;试验区概况 nbsp;试验于 2016 2017 年在湖南省农业科学院高桥科研基地大棚种植区进行 （ 11258′42′′E， 2811′49′′N） 。土壤质地为砂壤土。 nbsp;1.2 nbsp;试验设计 nbsp;试验在连作 3 年西瓜的大棚（ 30 m 6 m）内进行， T1（生物有机肥）即施加“馕播王”（总养分 N＋ P2O5＋ K2O8，有效活菌数＞ 0.2 亿 /g，有机质＞ 20）生物有机肥 280 kg/棚，撒施后立即旋耕。 T2（棉隆＋生物有机肥）棉隆 10 kg/棚，撒施后立即旋耕，保持土壤含水量在 40左右，覆膜保气提高地温， 20 d后揭膜通风，通风 15 d 后施加“馕播王”生物有机肥 280 kg/棚，撒施后旋耕，以常规栽培基肥处理为 CK，每个处理为 1 个大棚， 3 次重复。各处理在西瓜苗移栽前完成。西瓜苗营养钵内培育 30～ 35 d 后移栽，畦宽 3 m、长 30 m，瓜蔓对爬，株距 60 cm，密度 360 株 /667 m2。供试作物为西瓜，品种“早佳 8424”，由新疆农人公司提供。供试肥料为“馕播王”生物有机肥，土壤消毒剂棉隆，均由南京农业大学提供。不同处理土壤 pH 平均值分别为 4.88（ CK）； 4.77（ T1）； 4.99（ T2），均偏酸性。 nbsp;1.3 nbsp;田间病害调查 nbsp;西瓜生育期内调查统计枯萎病的发生情况，计算发病率。发病率（ ） （发病株数 /调查总株数） 100。 nbsp;由表 1 可见，不同处理下，西瓜枯萎病发病率差异显著，施用 T2 发病率最低，为 18，施用 T1 发病植株次之，对照组发病率最高，为 93。与 CK 相比， T1 处理的西瓜枯萎病发病率降低 39，而 T2 处理组西瓜发病率降低 75，说明不同施肥处理能够抑制西瓜枯萎病的发生。 nbsp;1.4 nbsp;田间取样 nbsp;于 2016 年 5 月 26 日西瓜枯萎病发病初期，在试验小区取样。用土钻在大棚按“ S”形随机选择采取15～ 20 cm 深的 5 处根际土壤样品混为一个处理，共 9 个处理土样装密封袋低温带回实验室。去除植物根 nbsp;表 1 nbsp;西瓜发病情况分析 nbsp;Table 1 nbsp;Disease incidence analysis of watermelon plants 处理 nbsp;Treatments 总植株数 nbsp;Total plant number 发病植株数 nbsp;Disease plant number 发病率 nbsp;disease rate CK 89.33 1.15 82.67 1.53 93 0.27 a T1 89.33 6.11 nbsp;48.00 14.00 54 0.15 b T2 88.00 2.00 15.67 9.29 18 0.11 c 注以上数值均表示平均值标准差（ n3）小写英文字母代表 5的差异显著性，下同。 nbsp;Note Data were expressed as mean SD n3. Different lower-case letters showed significant difference at 0.05 level according to Duncan’s multiple range test at 0.05 level. The same as below. 第 4 期 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 朱菲莹等不同施肥处理对土壤微生物群落结构及西瓜枯萎病发生的影响 nbsp;591 系和石块并过 2 mm 目筛，将采集的土壤样品保存于无菌离心管中于- 80 ℃冰箱用于 16S rDNA 测序分析，另外一部分样品风干后用于测定土壤理化性质、 pH 值、电导率等。 nbsp;1.4.1 nbsp;土壤pH及土壤电导率测定方法 nbsp;称量 10 g 风干土至于小烧杯（最好 50 mL），加入无二氧化碳水（或者 1 mmp KCl 溶液），用磁力搅拌器搅拌 1 min，静置 30 min，用 pH 计插入读数即可。 nbsp;1.4.2 nbsp;微生物群落组成和差异在16S rDNA水平上进行测序分析 nbsp;采用 OMEGA Soil DNA kit（ 200）试剂盒对土壤样本总 DNA 进行提取。对细菌 16S rDNA 基因 V3-V4 高变区进行 PCR 扩增，引物序列为 343F（ 539;-TACGGRAGGCAGCAG-339;）和 798R（ 539;-AGGGTATCTAATCCT-339;），采用 HiFi Hot Start Ready Mix 试剂盒，（反应体系为 2 HiFi Hot Start Ready Mix 15 μL， P1 1 μL， P2 1 μL， DNA 50 ng， ddH2O 13 μL，T 30 μL），扩增反应程序为 94 ℃预变性 5 mins； 30 个循环（ 94 ℃ nbsp;30 s， 56 ℃ nbsp;30 s， 72 ℃ nbsp;30 s），72 ℃ nbsp;7 min。并对 PCR 产物使用 2浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测。 nbsp;1.5 nbsp;数据统计与分析 由 Illumina Miseq 测序所得原始数据，利用 Fast QC 软件对原始双端测序数据进行去杂并拼接，然后对拼接后的 paired end 数据进行精准去杂。随后进行去嵌合体序列处理，最终得到较优质的序列，进行下游分析。首先挑选 OTU 步骤，即对所有的优质序列使用 CD-HIT[13]方法以相似度进行 OTU 分类，相似度为 97相似度即对应物种分类到属的一个水平分类标准。随后以 OTU 分类中丰度最大的序列为代表序列，在 Greengenes 数据库[14]进行比对后最终得到系统发育树和 OTU 分类表格。最终执行下游的 α-和 β-多样性分析。利用 MOTHUR 软件进行微生物群落的 α-多样性分析，包括稀释性曲线、 CHAO1 指数和 SHANNON 指数[15-18]。利用主成份分析技术（ Principal component analysis， PCA）对各处理进行聚类分析[19]；利用冗余分析技术（ Redundancy analysis， RDA）对土壤样品、微生物群落结构和西瓜植株的病害进行关联性分析[20]。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;不同处理对西瓜田土壤养分含量的影响 从表 2 可以看出，不同处理土壤中 pH 值，总氮，总磷，总钾以及有机质含量均无明显差异。但是，增施微生物有机肥 , 促进了西瓜根系对土壤养分的吸收 , 西瓜植株吸收磷、钾总量增加。 T1 和 T2 的磷总量分别比 CK 增加 23.86和 nbsp;17.05, 钾总量分别比 CK 增加 4.27和 nbsp;3.52， 有效磷总量分别比 CK 增加169.32和 89.47，速效钾分别比 CK 增加 167.5和 74.36。 nbsp;表 2 nbsp;不同处理对西瓜田土壤养分含量的影响 nbsp;Table 2 nbsp;Effects of different treatment on soil nutrients of watermelon field 处理 nbsp;Treatment pH 总氮 TN g/kg 总磷 TP g/kg 总钾 TK g/kg 有机质 SOMg/kg 碱解氮 AN g/kg 有效磷 AP g/kg 速效钾 AK g/kg CK 4.88 0.17 1.61 0.28 0.88 0.14 22.73 1.33 22.70 5.30 116.60 23.18 93.93 28.66 195.00 95.35 T1 4.77 0.37 1.64 0.43 1.09 0.15 23.70 2.39 23.60 5.99 107.50 31.71 252.97 70.91 362.50 63.79 T2 4.99 0.38 1.56 0.36 1.03 0.10 23.53 1.56 23.43 2.55 129.80 16.44 177.97 44.25 340.00 69.46 2.2 nbsp;土壤样品测序深度评估 参与测序的所有 9 个样品的总序列数为 2685747 条，所有 9 个样本序列中观测到的总的 OTU 数目为19367 条。其中对照组 CK6有 27415 条序列， CK11有 30627 条序列， CK16有 28907 条序列， T15有29928 条序列， T18有 30671 条序列， T121有 31285 条序列， T24有 30171 条序列， T29有 29902 条序列， T220有 29118 条序列。所有 9 个样本序列中鉴定到的总的 OTU 数目为 19367 个。覆盖率常用来评估克隆文库信息对环境微多样性的代表性，本研究中各组文库的覆盖率均为 90以上，表明所建的文库可以真实体现所取样本中的细菌多样性。 nbsp;2.3 nbsp;土壤细菌群落 Alpha 多样性 Alpha 多样性用于分析样品内（ Within-community）的微生物群落多样性[21]，通过单样本的多样性分 nbsp;592 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 中 nbsp;国 nbsp;生 nbsp;物 nbsp;防 nbsp;治 nbsp;学 nbsp;报 nbsp; nbsp;第 34 卷 nbsp;析（ α-多样性）可以反映样品内的微生物群落的丰富度和多样性。 Shannon 指数和 Simpson 指数是衡量群落多样性的重要指标，指数越大，表明群落的丰富度和多样性越高。由表 3 可以看出，与 CK 相比， T1、T2 处理对土壤微生物丰度提高具有促进作用。 不同处理后土壤细菌群落 Shannon 指数和 Simpson 指数无明显差异，说明各组分土壤细菌群落多样性差异不显著。 nbsp;表 3 nbsp;不同处理土壤细菌群落丰富度和多样性指数 nbsp;Table 3 nbsp;Diversity indices of rhizosphere soil bacterial commnities under different managements 处理 nbsp;Treatments Shannon 指数 nbsp;Shannon index Simpson 指数 nbsp;Simpson index CK 8.72 1.97 a 0.97 0.037 a T1 7.80 1.13 a 0.97 0.031 a T2 8.61 1.16 a 0.99 0.017 a 2.4 nbsp;土壤中细菌的群落结构分析 共有的 Top 10 优势菌门从高到低分别为变形菌门 Proteobacteria，厚壁菌门 Firmicutes，酸杆菌门Acidobacteria，放线菌门 Actinobacteria，芽单胞菌门 Gemmatimonadetes，绿弯菌门 Chloroflexi， TM7，拟杆菌门 Bacteroidetes， OD1， Other。其中变形菌门 Proteobacteria 在各组中占比均为最高， CK 中占比为40.84， T1 中占比为 29.63， T2 中占比为 33.67；其次是厚壁菌门 Firmicutes 在各组所占比例， CK 为10.25， T1 为 38.70， T2 为 13.24。 nbsp;由图 1 可见，在门水平上丰度在前 10 的优势物种中， CK 组中较高的为变形菌门 Proteobacteria，酸杆菌门 Acidobacteria， T1 在厚壁菌门 Firmicutes 上丰度相对最高， T2 在放线菌门 Actinobacteria，芽单胞菌门 Gemmatimonadetes，以及 TM7， OD1 等 4 种门上细菌群落上丰度均高于 CK 及 T1。 nbsp;CK T1 T200.050.100.150.200.250.300.350.400.45图 1 nbsp;门水平上 TOP10 细菌的相对丰度 nbsp;Fig. 1 nbsp;Relative abundance of the top 10 bacteria at the level of Phylum 图 2 可见，共有的 Top10 优势菌属从高到低分别为芽胞杆菌属 Bacillus，肠球菌属 Enterococcus，unclassified_Koribacteraceaef ， unclassified_Xanthomonadaceaef ， unclassified_TM7-1c ， unclassified_ Rhodospirillaceaef， 乳球菌属 Lactococcus， unclassified_Ellin329o， 梭菌属 Clostridium。 其中 unclassified_ Koribacteraceaef， nbsp;unclassified_Xanthomonadaceaef， nbsp;unclassified_Rhodospirillaceaef在 CK 组中相对丰度最高。而芽胞杆菌属 Bacillus 在 T1 组中占比相对其他组分最高约为 13.21，且乳球菌属 Lactococcus， nbsp;TM7-1C，梭菌属 Clostridium， nbsp;肠球菌属 Enterococcus 在 T1 组相对丰度最高。且在 T2 组中unclassified_TM7-1c， unclassified_Ellin329o两种细菌的相对丰度处于最高值。 nbsp;第 4 期 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 朱菲莹等不同施肥处理对土壤微生物群落结构及西瓜枯萎病发生的影响 nbsp;593 OtherBacillusEnterococcusunclassified__Koribacteraceaefunclassified__Xanthomonadaceaefunclassified__TM7-1cunclassified__RhodospirillaceaefLactococcusunclassified__Ellin329oClostridium00.050.100.150.200.250.30CK T1 T2图 2 nbsp;属水平上 TOP10 细菌的相对丰度 nbsp;Fig. 2 nbsp;Relative abundance of the top 10 bacteria at the level of genus 2.5 nbsp;不同组间土壤细菌群落 OTU 特异性分析 Venn 图可以直观地表现 nbsp;3种处理（ CK、 T1、 T2）土壤微生物群落的 OTU 数目组成相似性，重叠情况以及特异性（图 3）。 CK、 T1、 T2 三组之间存在共有细菌 OTU 数量为 860，占到各组分平均总 OTU数量的 50以上，说明各组分优势菌基本组成相似。其中 CK 特有 142 个细菌 OTU， T1 特有 45 个细菌OTU， T2 特有 36 个细菌 OTU。 nbsp;2.6 nbsp;微生物群落与环境因子 pH，电导率影响的关系 通过 RDA 分析可将菌群结构数据与某种给定的影响因素互相拟合，并通过置换检验来判断该因素对 nbsp;66142 4586010116836T2T1CK图 3 nbsp;不同组间土壤微生物群落 OTU 维恩图 nbsp;Fig. 3 nbsp;OTU Venn diagram of soil microbial communities in different groups 594 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 中 nbsp;国 nbsp;生 nbsp;物 nbsp;防 nbsp;治 nbsp;学 nbsp;报 nbsp; nbsp;第 34 卷 nbsp;于菌群结构的影响是否显著。分析每个点代表一个样品，两点之间的距离越接近，说明 2 个样品的群落结构相似度越高。彩色箭头分别代表不同的影响因素，影响因素之间的夹角代表它们之间相关性的大小，锐角表示 2 个因素正相关，直角为不相关，钝角时为负相关，射线越长，表明该因素对群落结构的影响作用越大。将样品、微生物群落与环境因子（ pH，电导率 EC1，发病率 MORBILIT）进行关联分析， CK 组的3 个样品在 pH 与 MORBILIT 上呈正相关， T2 组 3 个样品在 pH 与 EC1 上为负相关。 pH 值对样本影响的大小排序为 S16.1＞ S6.1＞ S11.1＞ S9.1＞ S20.1＞ S4.1＞ S8.1＞ S21.1＞ S5.1；电导率（ EC）对所有样本影响的大小排序为 S5.1＞ S21.1＞ S8.1＞ S4.1＞ S9.1＝ S20.1＞ S11.1＞ S6.1＞ S16.1；发病率（ MORBILIT）S16.1＞ S6.1＞ S11.1＞ S8.1＞ S5.1＞ S9.1＞ S4.1＞ S21.1＞ S20.1。 nbsp;可见， CK 组微生物群结构变化受 PH 值影响较大，而 T2 组受三者影响均等（图 4）。 nbsp;PH10.6-0.6-0.6 0.8s8.1s5.1EC1MORBILITs21.1s4.1s9.1s20.1s6.1s16.1 s11.1图 4 nbsp;RDA 分析图 nbsp;Fig. 4 nbsp;Redundancy analysis diagram 3 nbsp;讨论 nbsp;3.1 nbsp;单施生物有机肥对土壤微生物群落结构的影响 nbsp;西瓜产业中西瓜枯萎病已成为导致产量、品质下降最为严重的土传病害，已引起了世界各国的广泛重视。目前针对西瓜枯萎病菌的生防菌，主要有木霉属真菌、丛枝菌根真菌、非致病尖孢镰刀、芽胞杆菌和内生真菌等。生防微生物不仅安全无毒，而且是用来防治枯萎病理想的方法。 土壤微生物在土壤生态系统的物质和能量循环以及有机物质转化等过程中担负维持土壤生态系统的稳定， 加快土壤生态系统中养分的循环和提高土壤对不良环境的抵御能力， 也是预防土传病害的关键所在。生物有机肥的施用可增加土壤中微生物数量， 提高土壤中微生物的活性。 生物有机肥本身含多种有益菌群，对土壤中的土著微生物有一定的活化作用，并且生物有机肥基料多为有机物，丰富土壤中微生物可利用营养增加菌群数。多样性高的土壤对病原菌具有较强的抑制作用，施用生物有机肥可提高土壤微生物活性，改善微生物结构和功能，从而实现土壤微生物生态平衡，抑制病害发生。有机肥为微生物提供了较多的能源与养分，促进土壤中多种微生物的大量繁殖[21,22]。杨元根等[23]研究发现，土壤微生物通过消耗有机质来维持正常的生理活动，生理活动越强，消耗的有机质越多。 Liu 等[24]用 Biolog 方法研究了土壤微生物群落结构，结果表明有机肥处理的 Shannon 指数与碳源利用率均极显著高于化肥处理。 Chen 等[25]通过大田试第 4 期 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 朱菲莹等不同施肥处理对土壤微生物群落结构及西瓜枯萎病发生的影响 nbsp;595 验发现，接种微生物菌剂可显著提高土壤丰富度指数，且改变土壤微生物功能多样性。 Zhou 等[26]在温室盆栽条件下研究连作黄瓜土壤中真菌群落多样性的动态变化，发现种群大小和土壤病态与黄瓜生长紧密相关。本试验发现， T1 组厚壁菌门 Firmicutes 丰度相对最高；而在属水平上，芽胞杆菌属 Bacillus，乳球菌属 Lactococcus TM7-1（ C） ，梭菌属 Clostridium， nbsp;肠球菌属 Enterococcus 在 T1 组相对丰度最高。说明这些菌属可能对土壤中的土著微生物有一定的活化作用，通过改善微生物结构和功能，从而抑制了植物病害的发生。 nbsp;3.2 nbsp;施用棉隆 ＋ 生物有机肥对土壤微生物群落结构的影响 nbsp;棉隆是一种环保型广谱性综合土壤熏蒸消毒剂。施用棉隆对土壤消毒可大幅度的提高产量、减少地上部分的病虫害、提高作物的品质、无农药残留问题、减少地上部分喷农药的次数。 2014 年，王媛等[27]试验发现，施用棉隆后的土壤中细菌、真菌和放线菌的数量均大幅度减少，而且棉隆施用的浓度越高，真菌、细菌和放线菌的数量减少的程度越大。随着西瓜植株的生长，棉隆处理试验田中真菌、细菌和放线菌的数量都会回升。 2016 年，张超等[28]在温室大棚条件下研究发现棉隆剂量越高对辣椒疫霉病的防效越显著，对微生物活性影响越大，高剂量处理能明显抑制土壤微生物的活性，降低土壤微生物的多样性。 nbsp;本试验结果发现， T2 组（棉隆＋生物有机肥）的西瓜枯萎病发病率平均仅为 18，远低 于 T1（ 54），CK（ 93）。可见，施用棉隆＋生物有机肥可以通过重建土壤生态环境，提高土壤细菌多样性，从而对西瓜枯萎病有显著的防治作用。 nbsp;土壤微生物的数量和种类是影响植物生长发育的重要因子之一，土壤微生物的数量和种类与植物病害也有密切的关系[29-32]。 Philippot 等[33]研究表明土壤微生物群落结构多样性是反应土壤健康状态的重要指标，土壤微生物群落是土壤生态系统持续发挥作用的重要媒介。土壤微生物群落的多样性受土壤特性影响较大，不同的施肥制度对微生物产生的影响不同。了解各种施肥处理对土壤微生物群落特性的影响十分重要[34]。因此，本试验进一步通过 Illumina Miseq 平台进行测序，比较不同施肥处理后土壤微生物中细菌多样性差异。 CK、 T1、 T2 三组之间存在共有细菌 OTU 数量为 860，占到各组分平均总 OTUs 数量的 50以上，说明各组分优势菌基本组成相似。其中， Simpson 指数和 nbsp;Shannon 指数说明施用 T2（棉隆＋生物有机肥）的土壤细菌多样性最高。通过对各个样品的细菌群落结构分析，在门水平上发现变形菌门 Proteobacteria 在各组分中占比均为最高， T2 在 TM7，芽单胞菌门 Gemmatimonadetes，以及 OD1中相对丰度较高。 而在属水平上， unclassified_TM7-1（ c） ， unclassified_Ellin329（ o） ， 芽胞杆菌属 Bacillus，肠球菌属 Enterococcus 在 T2 组中相对丰度较高，其中 unclassified_TM7-1（ c） 最为显著。通过 RDA 分析可将菌群结构数据与环境因素互相拟合（ pH，电导率 EC1，发病率 MORBILIT），发现 T2 组受三者影响均等， T2 组 3 个样品在 pH 与 EC1 上为负相关。结果表明，不同组间微生物群落结构的差异可能对西瓜枯萎病的发生起到主要调控作用。 T2 组中特有的细菌群落结构在数量增减和种类的差异，说明这些属菌在西瓜植株健康中起重要作用，可能抑制西瓜枯萎病的发生。 nbsp;本试验研究结果表明，不同处理对照组（不施肥）、 T1（生物有机肥）、 T2（棉隆＋生物有机肥）三组土壤细菌群落结构有显著差异，说明土壤细菌群落结构差异可能是调控西瓜枯萎病发生的主要因子之一。其中 T1 组对西瓜枯萎病的发生有一定的防治作用，从而验证了生物有机肥由于本身含有益菌群，从而提高土壤微生物活性，改善微生物结构和功能，实现土壤微生物生态平衡，达到抑制作物病害的效果。且 T2 组对西瓜枯萎病防治效果最好，可能是因为棉隆对合土壤熏蒸消毒的作用加上生物有机肥施用后对土壤生态系统的重建有利于西瓜植株的健康生长。通过以上研究，有利于我们更进一步通过调节土壤微生物群落结构，从而有效防治西瓜枯萎病。但是由于 16S rDNA 测序仅能开展在菌属层面的分析，因此，我们需要通过宏基因组和转录组等分子生物学手段进一步探索影响西瓜枯萎病发生的关键菌种及其功能基因，为克服西瓜连作障碍提供理论依据。 nbsp;参 nbsp;考 nbsp;文 nbsp;献 nbsp;[1] Ling N, Deng K, Song Y, et al. Variation of rhizospHere bacterial community in watermelon continuous mono-cropping soil by long-term application of 596 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 中 nbsp;国 nbsp;生 nbsp;物 nbsp;防 nbsp;治 nbsp;学 nbsp;报 nbsp; nbsp;第 34 卷 nbsp;a novel bioorganic fertilizer[J]. Microbiological Research, 2014, 1697-8 570. [2] 马利平 , 高芬 , 乔雄梧 . 家畜沤肥浸渍液对黄瓜枯萎病的防治及作用机理探析 [J]. 植物病理学报 , 1999, 293 270-274. [3] 蔡燕飞 , 廖宗文 , 章家恩 . 生态有机肥对番茄青枯病及土壤微生物多样性的影响 [J]. 应用生态学报 , 2003, 143 349-353. [4] 蔡燕飞 , 廖宗文 . FAME 法分析施肥对番茄青枯病抑制和土壤健康恢复的效果 [J]. 中国农业科学 , 2003, 368 922-927. [5] 张树生 , 杨兴明 , 黄启为 , 等 . 施用氨基酸肥料对连作条件下黄瓜的生物效应及土壤生物性状的影响 [J]. 土壤学报 , 2007, 444 689-694. [6] 朱林 , 彭宇 , 袁飞 , 等 . 几种有机物对连作黄瓜生长的影响 [J]. 安徽农业科学 , 2001, 292 214-216. [7] 徐福利 , 梁银丽 , 张成娥 , 等 . 日光温室土壤生物学特性与施肥的关系 [J]. 水土保持研究 , 2004, 111 20-22. [8] 吕卫光 , 张春兰 , 袁飞 . 有机肥减轻连作对黄瓜自毒作用的机制 [J]. 上海农业学报 , 2002, 182 52-56. [9] 孙红霞 , 武琴 , 郑国祥 , 等 . EM 对茄子、黄瓜抗连作障碍和增强土壤生物活性的效果 [J]. 土壤 , 20015 264-267. [10] 张春兰 , 吕卫光 , 袁飞 . 生物有机肥减轻设施栽培黄瓜连作障碍的效果 [J]. 中国农学通报 , 1999, 156 67-69. 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