草莓灰霉病菌拮抗放线菌的筛选及活性测定.pdf

pnbsp; nbsp; 北方园艺２０１８（０４）５９－６５ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ研究论文第一作者简介赵娟（１９８５－），女，博士，助理研究员，研究方向为微生物资源利用与果蔬病害生物防治。Ｅ－ｍａｉｌｚｈａｏｊｕａｎ１１９８８２＠１６３．ｃｏｍ．责任作者刘伟成（１９５９－），男，博士，研究员，研究方向为资源微生物及植物病害生物防治。Ｅ－ｍａｉｌｌｉｕｗｉｃｈ＠１６３．ｃｏｍ．基金项目北方果树病虫害绿色防控北京市重点实验室资助项 目 （ＢＺ０４３２）；北 京 市 科 技 计 划 资 助 项 目（Ｄ１５１１００００３９１５００３，Ｄ１５１１００００３９１５００２）；北京市优秀人才资助项目（２０１５００００２００６０Ｇ１４０）；北京市农林科学院所级创新团队资助项目（ＪＮＫＳＴ２０１６０７）。收稿日期２０１７－１０－１２ｄｏｉ１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１７２７６７草莓灰霉病菌拮抗放线菌的筛选及活性测定赵娟１，贾 卫 国２，刘 伟 成１，刘 德 文１，张 殿 朋１，卢 彩 鸽１（１．北京市农林科学院 植物保护环境保护研究所，北京１０００９７；２．固安县牛驼镇林城驻军生产基地，河北 廊坊０６５５０１）摘要以分离自新疆古尔班通古特沙漠土壤的放线菌为试材，采用琼脂块法和生长速率法，研究了供试放线菌对草莓灰霉病菌的抑菌活性；采用形态学特征、生理生化特性、１６ＳｒＤＮＡ序列分析等方法对筛选出的高活性拮抗菌株进行种类鉴定。结果表明从１４１株放线菌中筛选出１株对草莓灰霉病菌的抑菌圈直径为２０．６７ｍｍ的高活性拮抗菌株ＸＪ９３。该菌株无菌发酵滤液对多种植物病原真菌具有明显抑制作用，抑菌率为２５．００％～７１．６７％；８０℃处理６０ｍｉｎ其抑菌率未见明显变化，在ｐＨ ５～９范围内其抑菌活性稳定，在可见光和紫外线照射１５０ｍｉｎ内亦保持良好的抑菌活性。拮抗菌株ＸＪ９３经鉴定为唐德链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ）。拮抗放线菌ＸＪ９３具有广谱抑菌活性，对环境有良好的稳定性，可作为防治果蔬草莓灰霉病的生物农药潜力菌株进行开发应用。关键词草莓灰霉病菌；唐德链霉菌；抑菌活性；发酵液稳定性中图分类号Ｓ ４７６；Ｑ ９３９．９２ 文献标识码Ａ 文章编号１００１－０００９（２０１８）０４－００５９－０７灰霉病是草莓开花后危害最严重的一种真菌性病害，该病害由灰葡萄孢（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）侵染引起，主要危害果实、果梗、花瓣、叶片和叶梗，在草莓生产中严重降低了果实的产量和品质［１－２］。目前生产上防治果蔬灰霉病仍以化学防治为主［３］，虽然防治效果比较显著，但是长期大量使用化学农药造成了病原菌产生抗药性、农药残留及环境污染等系列问题。生物防治以其环境友好，成本低、无污染等特点被人们所重视，因此关于筛选和利用拮抗微生物防治果蔬灰霉病已成为研究热点［４－５］。李德全等［６］筛选到１株对草莓灰霉病具有较好防治效果的枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＨ－８。黄静等［７］从草莓根际土壤中分离到１株解淀粉芽孢杆菌ＣＭ３，该菌株对草莓灰霉病具有明显抑菌作用。秦晓杰等［１］从草莓果实３３℃，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １２０ｈｏｕｒｓ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＪＭ－３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ３２．４％ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆｓｔｒａｉｎ ＪＭ－３ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｃｕｒｅ ｃａｎｋｅｒ ｌｅｓｉｏｎ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｂｕｔ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃａｎｋｅｒ ｌｅｓｉｏｎ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＪＭ－３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｗｈｅｎ ｉｔ ｗａｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｐｐｌｅ ｔｗｉｇｓ ｂｅｆｏｒｅ ２４－４８ｈｏｕｒｓ，ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈ ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ；Ｖａｌｓａ ｃｅｒａｔｏｓｐｅｒｍａ上分离筛选到１株对灰霉病具有明显抑制效果的拮抗酵母菌季也蒙毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒ－ｍｏｎｄｉｉ）Ｎ１。但由于灰霉病具有适应性强、繁殖速度快、病原菌易变异等特点，因此从实际生产中不断寻找新的不同种类的拮抗微生物资源是一项长期且重要的工作［８］。放线菌是土壤中广泛分布的微生物，可产生抗菌活性物质和胞外水解酶从而抑制病原菌生长或溶解病原菌菌体［９－１０］，是具有生物农药开发潜力的微生物［１１］。孙平平等［５］研究表明，分离自果树根际土壤的多产色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙ－ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）Ｌ－３０处理梨果实能显著降低梨灰霉病菌的扩展，并提高了果实的防御酶系活性。朱海云等［１２］采用平皿渗透法筛选出７株对猕猴桃细菌性溃疡病具有生防潜力的内生放线菌，其中肉桂地链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）Ｍ１０９发酵液２０倍稀释处理猕猴桃植株，对猕猴桃细菌性溃疡病的防效可达７２％。但是目前利用放线菌进行草莓灰霉病防治的研究相对较少。根据课题组前期研究发现，分离自新疆通古特沙漠土壤的可培养放线菌类群具有丰富的多样性。该研究以草莓灰霉病菌为靶标，通过琼脂块法筛选出高活性拮抗放线菌，并对其种类进行鉴定；在此基础上对该拮抗菌的抑菌谱和发酵液稳定性进行研究，以确定该菌株抑菌作用广谱性和抑菌活性成分对不同环境因素的耐受能力，为草莓灰霉病绿色防控中高效微生物农药的开发应用提供菌株资源和科学依据。１ 材料与方法１．１ 试验材料供试放线菌由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所生防微生物研究室分离自新疆通古特沙漠特殊生境土壤。供试靶标菌草莓灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅ－ｒｅａ），由该研究室分离自京郊科技园区保护地草莓发病果实。其它供试植物病原真菌包括番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、桃褐腐病菌（Ｍｏｎｉｌｉｎ－ｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、番茄叶霉病菌（Ｆｕｌｖｉａ ｆｕｌｖａ）、辣椒炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ）、小麦纹枯病菌 （Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉ）、黄瓜 枯 萎 病 菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、甘蓝枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕ－ｔｉｎａｎｓ），均由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所生防微生物研究室保存。供试培养基病原真菌培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）［１３］；放线菌培养采用高氏一号培养基［１３］；放线菌发酵液制备采用高氏一号液体培养基。１．２ 试验方法１．２．１ 放线菌分离培养采用稀释平板法［１３］分离放线菌。根据程丽娟等［１３］的方法进行土壤悬浮液的制备和梯度稀释，吸取不同浓度的悬浮液各０．１ｍＬ加到高氏一号培养基（加入终浓度为７５ｍｇＬ－１的Ｋ２ＣｒＯ７）平板上，涂布均匀后置于２８℃培养观察，５～７ｄ后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，４℃保存备用。１．２．２ 草莓灰霉病菌拮抗放线菌筛选采用琼脂块法［１４］进行草莓灰霉病菌拮抗放线菌的筛选。２８℃培养４ｄ后十字交叉法测量抑菌圈直径。１．２．３ 拮抗菌种类鉴定１）形态学观察和生理生化指标的检测。将供试拮抗菌接种于国际链霉菌计划（ＩＳＰ）指定的培养基上，２８℃培养７～１０ｄ观察菌株生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝颜色以及可溶性色素的有无及颜色。将灭菌的盖玻片斜插入高氏一号培养基内，供试菌株划线接种于盖玻片内侧，２８℃培养５～７ｄ取出盖玻片在１０４０倍光学显微镜下观察菌丝、孢子形态。菌株碳源利用试验与生理生化反应参照文献［１５］。２）分子生物学鉴定。采用细菌基因组提取试剂盒提取供试拮抗菌基因组ＤＮＡ。细菌通用引物２７ｆ５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′和１４９２ｒ５′－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′扩增菌株１６ＳｒＤＮＡ序列。ＰＣＲ扩增体系１０ｐｍｏＬＬ－１上下游引物各１μＬ，ｄＮＴＰ Ｍｉｘ－ｔｕｒｅ（１０ｍｍｏｌＬ－１）１μＬ，２．５ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，１０ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ，基因组ＤＮＡ模板１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １８μＬ。扩增产物用１％的琼０６北方园艺２月（下）脂糖凝胶电泳检测，目标条带经切胶回收纯化后，送至北京博迈德生物技术有限公司测序。对获得的１６ＳｒＤＮＡ序列提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，并采用Ｂｌａｓｔ在ＮＣＢＩ网站进行序列相似性搜索。采用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ软件进行多序列比对，利用ＭＥＧＡ ５．０软件中Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树。１．３ 项目测定１．３．１ 拮抗菌抑菌谱的测定采用生长速率法［１６］对获得的高活性菌株进行抑菌谱测定，抑菌率（％）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径１００。１．３．２ 拮抗菌活性产物稳定性的测定１）对温度稳定性的测定。将供试菌株的无菌发酵滤液在０、２０、４０、６０、８０、１００℃条件下，处理６０ｍｉｎ；在１２１℃条件下，高压蒸汽灭菌处理３０ｍｉｎ，快速冷却。２）对酸碱稳定性的测定。将供试菌株无菌发酵滤液装入１０ｍＬ离心管，用已经配好的１ｍｏｌＬ－１盐酸和１ｍｏｌＬ－１氢氧化钠分别调节ｐＨ，使各组ｐＨ分别为１、３、５、７、９、１１、１３，放置２ｈ后调回至初始ｐＨ。３）对可见光和紫外光稳定性的测定。将供试菌株无菌发酵滤液在可见光和波长为３２０～４００ｎｍ的紫外灯３０ｃｍ处，分别照射０、３０、６０、９０、１２０、１５０ｍｉｎ。以上３个项目均以草莓灰霉病菌为指示菌，采用生长速率法［１６］测定不同处理后无菌发酵滤液的抑菌率，每处理重复３次。１．４ 数据分析采用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ软件作图并对试验数据进行分析，采用ＳＰＳＳ软件进行差异显著性分析。２ 结果与分析２．１ 草莓灰霉病菌拮抗放线菌筛选采用稀释平板法从采集自新疆通古特沙漠的土样中分离纯化共得到１４１株放线菌，又通过琼脂块法筛选到１８株对草莓灰霉病菌具有良好抑菌活性的放线菌，其中菌株ＸＪ９３对草莓灰霉病菌的抑菌圈直径最高，为２０．６７ｍｍ（表１），因此利用菌株ＸＪ９３进行后续试验。表１供试放线菌对草莓灰霉病菌的抑菌活性Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒａ nbsp;ｍｍ菌株编号Ｓｔｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ抑菌圈直径Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ菌株编号Ｓｔｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ抑菌圈直径Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｉａｍｅｔｅｒＸＪ６ nbsp;１５．８３０．７６ ＸＪ７５ nbsp;１２．５０１．３２ＸＪ１８ nbsp;１３．３３０．５８ ＸＪ７７ nbsp;１３．１７１．１５ＸＪ２２ nbsp;１８．１７０．７６ ＸＪ８２ nbsp;１２．６７０．５８ＸＪ２８ nbsp;１５．３３０．５８ ＸＪ８８ nbsp;１３．５００．５０ＸＪ３５ nbsp;１３．８３２．０２ ＸＪ９３ nbsp;２０．６７１．１５ＸＪ５２ nbsp;１３．６７０．５８ ＸＪ９６ nbsp;１６．５００．５０ＸＪ５３ nbsp;１４．８３０．２９ ＸＪ９９ nbsp;１８．６７０．５８ＸＪ６２ nbsp;１５．６７１．５３ ＸＪ１０６ nbsp;１３．００１．７３ＸＪ６４ nbsp;１８．３３０．５８ ＸＪ１１５ nbsp;１６．８３１．６１２．２ 拮抗菌ＸＪ９３种类２．２．１ 形态学观察和生理生化特性菌株ＸＪ９３在甘油硝酸盐琼脂、淀粉琼脂、蔗糖察氏琼脂培养基上无气生菌丝，在马铃薯蔗糖琼脂、高氏一号琼脂以及ＩＳＰ２、ＩＳＰ３、ＩＳＰ４培养基上气生菌丝呈白色或白灰色，在葡萄糖天门冬素琼脂培养基上气生菌丝呈肉桂褐色；各培养基中基内菌丝浅黄色至深褐色；菌株ＸＪ９３在甘油硝酸盐琼脂、马铃薯蔗糖琼脂、淀粉琼脂、蔗糖察氏琼脂、ＩＳＰ３培养基上无可溶性色素，在高氏一号、葡萄糖天门冬素琼脂、ＩＳＰ２、ＩＳＰ４培养基上可溶性色素呈浅黄色、褐色或深褐色（表２）。通过光学显微镜观察发现，在高氏一号培养基上，菌株ＸＪ９３菌丝细长、发达、不断裂、多分枝，孢子卵圆形至椭圆形，呈链状（图１）。１６ 第４期北方园艺表２拮抗菌ＸＪ９３在不同培养基上的培养特征Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａｓ培养基Ｍｅｄｉａ气生菌丝Ａｅｒｉａｌ ｍｙｃｅｌｉｕｍ基内菌丝Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ可溶性色素Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔ甘油硝酸盐琼脂Ｇｌｙｃｅｒｏｌ－ｎｉｔｒａｔｅ ａｇａｒ 浅黄色 马铃薯蔗糖琼脂Ｐｏｔａｔｏｇｌｕｃｏｓｅ ａｇａｒ白色 褐色 高氏一号琼脂ＧａｕｓｅＮｏ．１ａｇａｒ白色 深褐色 褐色葡萄糖天门冬素琼脂Ｇｌｕｃｏｓｅ－ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ａｇａｒ肉桂褐色 浅黄 浅黄色淀粉琼脂Ｓｔａｒｃｈａｇａｒ 浅黄 蔗糖察氏琼脂Ｓｕｃｒｏｓｅｃｚａｐｅｋ′ｓ ａｇａｒ 浅黄 酵母膏麦芽膏琼脂ＩＳＰ２Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ－ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ａｇａｒ白灰色 褐色 深褐色燕麦粉琼脂ＩＳＰ３ｏａｔｍｅａｌａｇａｒ白灰色 浅黄 无机盐淀粉琼脂ＩＳＰ４Ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｓ－ｓｔａｒｃｈ ａｇａｒ白灰色 浅黄 浅黄色注箭头指菌株ＸＪ９３产生的孢子链。ＮｏｔｅＴｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｓｐｏｒｅｓ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３．图１拮抗菌ＸＪ９３菌落（ａ）、菌丝（ｂ）及孢子链（ｃ）形态特征Ｆｉｇ．１ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ（ａ），ｈｙｐｈａｅ（ｂ）ａｎｄ ｓｐｏｒｅｓ ｃｈａｉｎ（ｃ）ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３根据碳源利用和生理生化特性检测结果，菌株ＸＪ９３能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、甘露醇、肌醇、蔗糖，不能利用半乳糖、棉子糖；明胶液化、淀粉水解微弱，不产生类黑色素和硫化氢。２．２．２ 分子生物学鉴定结果将拮抗菌ＸＪ９３的１６ＳｒＤＮＡ基因进行ＰＣＲ扩增测序，得到１ ３２７ｂｐ的序列，将其１６ＳｒＤＮＡ序列相关信息提交到ＧｅｎＢａｎｋ，获得登录号ＭＦ４４３１１７。进行Ｂｌａｓｔ比对后选取与菌株ＸＪ９３同源性较高的序列，通过Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ进化树发 现 菌 株ＸＪ９３与Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ（ＡＢ１８４１７２、Ｄ６３８７３、ＫＦ４５４８４４）聚在同一分支，相似性达到９９％（图２）。由此结合形态学特征和培养特征，将菌株ＸＪ９３鉴定为唐德链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ）。２．３ 拮抗菌ＸＪ９３抑菌谱由表３可知，菌株ＸＪ９３对８株供试植物病原真菌生长具有抑制作用，抑菌圈直径为１２．８３～２０．６７ｍｍ；对草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制效果较明显，抑菌率分别为７１．６７％、５６．３５％和５７．６１％。２．４ 拮抗菌ＸＪ９３活性物质的稳定性２．４．１ 温度由图３－ａ可知，菌株ＸＪ９３无菌发酵滤液在８０℃及以下温度处理６０ｍｉｎ后依然保持较高的抑菌活性（６３．５１％～７０．７２％），且与对照差异不显著。经１００℃高温处理６０ｍｉｎ后，发酵液抑菌率明显下降，但仍能达到４０．９９％；在１２１℃高压蒸汽灭菌处理３０ｍｉｎ后，发酵液抑菌率急速下降至２５．５９％，这２个处理均显著低于对照。说明菌株ＸＪ９３发酵液在温度低于８０℃的环境条件下具有较好的热稳定性。２６北方园艺２月（下）图２基于１６ＳｒＤＮＡ序列的拮抗菌ＸＪ９３系统进化分析Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ １６ＳｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ表３菌株ＸＪ９３对植物病原真菌的抑制效果Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３ａｇａｉｎｓｔ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ植物病原真菌Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ抑菌圈直径Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ／ｍｍ抑菌率Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ／％草莓灰霉病菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ nbsp;２０．６７１．１５ nbsp;７１．６７３．８２桃褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ nbsp;１９．１７０．７６ nbsp;５６．３５２．４８辣椒炭疽病菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ nbsp;１７．００１．７３ nbsp;２５．００１．３７黄瓜枯萎病菌Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ nbsp;１４．１７２．０２ nbsp;５７．６１４．３６番茄灰霉病菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ nbsp;１５．３３０．５８ nbsp;５０．４０５．４１番茄叶霉病菌Ｆｕｌｖｉａｆｕｌｖａ nbsp;１３．１７０．７６ nbsp;３２．３８３．３２小麦纹枯病菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｃｅｒｅａｌｉ nbsp;１２．８３１．０４ nbsp;３１．１６１．０９甘蓝枯萎病菌Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ nbsp;１３．５０１．８０ nbsp;３４．５２２．０６２．４．２ 光照由图３－ｂ可知，拮抗菌ＸＪ９３无菌发酵滤液对可见光和紫外光具有较好的稳定性，在连续照射１５０ｍｉｎ后，抑菌活性较对照均没有显著性差异。当紫外光照射时间不断延长，抑菌活性呈逐渐降低趋势，但处理１５０ｍｉｎ时菌株ＸＪ９３无菌发酵滤液抑菌活性仍然维持在５９．８２％。说明菌株ＸＪ９３无菌滤液的对可见光和紫外光稳定，在田间应用时可保持较好的抑菌活性。２．４．３ ｐＨ由图３－ｃ可知，拮抗菌ＸＪ９３无菌发酵滤液在ｐＨ为５～９时具有较强的抑菌活性，抑菌率保持在６６．２０％～７０．３３％。发酵液在ｐＨ低于５或高于９时，其抑菌作用下降较明显；在ｐＨ为１和１３时抑制率明显降低（Ｐ＜０．０５），但抑制率仍可达到５１．３０％和４５．５６％。说明菌株ＸＪ９３无菌发酵液的抑菌活性物质对酸碱条件有较强的耐受性。３ 结论与讨论从放线菌及其次生代谢产物中筛选广谱、稳定、低毒的农用抗生素在植物病害绿色防控具有广阔的应用前景。由于从普通环境中筛选出的放线菌抑菌活性低且同种属菌株重复性高，研究人员对一些极端环境中的放线菌资源进行了探究［１７］。新疆通古特沙漠西部和中部以中亚荒漠植被区系占优势，蕴藏有丰富的微生物资源［１８］。该研究从分离自新疆通古特沙漠的１４１株放线菌中筛选到１株对草莓灰霉病菌具有高抑菌活性的广谱拮抗放线菌ＸＪ９３，并鉴定为链霉菌属唐德链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ）。从唐德链霉菌发酵３６ 第４期北方园艺图３不同温度（ａ）、光照（ｂ）、ｐＨ（ｃ）处理对拮抗菌ＸＪ９３活性物质稳定性的影响Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ａ），ｉｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ（ｂ）ａｎｄ ｐＨ（ｃ）ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３液中分离到的核苷肽次级代谢产物尼可霉素（ｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ）是几丁质合成酶的竞争性抑制剂，抗真菌活性强但抗菌谱相对较窄，主要应用于医药领域［１９－２１］。林真亭等［２２］研究表明，从海洋放线菌库中筛选到的唐德链霉菌（Ｓ．ｔｅｎｄａｅ）对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著抗菌活性，其产生的抗菌活性化合物为环二肽衍生物。该研究中菌株ＸＪ９３及其产生活性物质对草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌等多种重要植物病原真菌均具有明显的抑菌活性。由此推测分离自新疆特殊生境的Ｓ．ｔｅｎｄａｅ ＸＪ９３菌株发酵液中可能含有新的抑菌活性物质，但其具体类型还需对其活性产物进行进一步的分离纯化和结构鉴定研究。拮抗微生物及其产生的活性抑菌物质无论是施用到作物表面还是进入植物根际土壤，都要受到温度、光照及土壤酸碱性的影响。因此微生物次生代谢产物在自然环境中的稳定性直接生产菌种作为生物农药进行开发应用［２３］。该研究结果表明，发酵液耐高温，在强酸碱条件下较稳定，在可见光及紫外光处理后，对指示菌依然具有显著抑菌活性，说明菌株ＸＪ９３发酵液中的抗菌活性物质具有较强的热、酸碱和光稳定性。综上所述，将唐德链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ）ＸＪ９３活菌及其活性代谢产物作为防治果蔬作物灰霉病的生物农药具有一定的应用价值和开发前景。参考文献［１］秦晓杰，许皎姣，索娜，等．草莓灰霉病拮抗酵母菌的筛选鉴定及对采后草莓品质的影响［Ｊ］．食品工业科技，２０１２，３３（２１）３３０－３３５．［２］高翠珠，杨红玲，黄夏宇骐，等．湖北省设施草莓灰霉病发生规律及流行因子分析［Ｊ］．中国农业科学，２０１７，５０（９）１６１７－１６２３． ［３］刘永春，张红玲．腈苯唑与氟啶胺混剂防治草莓白粉病和灰霉病［Ｊ］．农药，２０１７，５６（５）３７４－３７６．［４］ＳＹＬＬＡ Ｊ，ＡＬＳＡＮＩＵＳ Ｂ Ｗ，ＫＲＵＧＥＲ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｉｅｓ ｂｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔｓａｐｐｌｉｅｄ ａｓ ｓｉｎｇｌｅ ｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１５，１４３（３）４６１－４７１．［５］孙平平，贾晓辉，崔建潮，等．梨灰霉病拮抗Ｌ－３０的筛选、鉴定及作用机制研究［Ｊ］．园艺学报，２０１６，４３（１２）２３３５－２３４６．［６］李德全，钱亚明，周鸣鸣，等．海洋细菌ＮＨ－８防治草莓灰霉病机理及其抗菌物质分析［Ｊ］．植物保护学报，２０１６，４３（２）２１５－２２１． 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ｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ａｎｄ １６ＳｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ１４１ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｇａｉｎｓｔ ｇｒｅｙｍｏｕｌｄ ｒｅａｃｈｅｄ ２０．６７ｍｍ．Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ａｌｓｏｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｎｙｐｌａｎｔ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ２５．００％－７１．６７％．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＸＪ９３ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｉｎｃｅ ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｕｎｃｈａｎｇｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｏｓｅ ｔｏ ８０℃．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｗａｓ ａｌｓｏｓｔａｂｌｅ ａｔ ｐＨ ５－９，ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｇｏｏｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｗｈｅｎ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ａ ｄｏｓｅ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ａｎｄｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ １５０ ｍｉｎｕｔｅｓ．Ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ＸＪ９３ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ．Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ，Ｓ．ｔｅｎｄａｅ ＸＪ９３ｈａｄ ｇｏｏｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄ ｂｒｏａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｓｐｅｃｔｒｕｍ；ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｙｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｎｔｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｇｒｅｙｍｏｕｌｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｇｒｅｙｍｏｕｌｄ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ；ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙ；ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ５６ 第４期北方园艺/p