不结球白菜花青苷合成负调控基因BrcLBD39的克隆和表达分析及其对外源6-BA的响应.pdf

南 京 农 业 大 学 学 报 ２０１８，４１１４９－５６ ｈｔｔｐ//ｎａｕｘｂ.ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＤＯＩ１０.７６８５/ｊｎａｕ.２０１７０４０３５ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ 收 稿 日 期２０１７－０４－２４ 基 金 项 目 江 苏 省 农 业 科 技 自 主 创 新 项 目[ＣＸ１５１０１５]； 江 苏 省 科 技 支 撑 计 划 项 目ＢＥ２０１３４２９ 作 者 简 介 董 慧 杰， 硕 士 研 究 生。 ∗ 通 信 作 者 胡 春 梅， 副 教 授， 研 究 方 向 为 蔬 菜 分 子 生 物 学 与 遗 传 育 种，Ｅ-ｍａｉｌｊｊｊｈｃｍ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ。 董慧杰， 侯喜 林， 韩 克， 等. 不结球白 菜花青苷合 成负调控基 因ＢｒｃＬＢＤ３９ 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源６-ＢＡ 的 响 应[Ｊ]. 南 京 农 业 大 学 学 报， ２０１８，４１１４９－５６. 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因ＢｒｃＬＢＤ３９ 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源６-ＢＡ 的 响 应 董 慧 杰， 侯 喜 林， 韩 克， 张 志 硕， 胡 春 梅 ∗ 南 京 农 业 大 学 园 艺 学 院/ 作 物 遗 传 与 种 质 创 新 国 家 重 点 实 验 室， 江 苏 南 京２１００９５ 摘 要[ 目 的] 本 文 旨 在 探 究ＬＢＤ３９ 基 因 在 不 结 球 白 菜 紫 色 和 绿 色 材 料 中 的 特 性 及 其 对 外 源６-ＢＡ 的 响 应， 为 花 青 苷 调 控 机 制 奠 定 理 论 基 础。 [ 方 法] 以 不 结 球 白 菜 紫 色 自 交 系ＮＪＺＸ１-３ 及 其 绿 色 突 变 体ＮＪＺＸ１-０ 为 材 料， 同 源 克 隆ＬＢＤ３９ 基 因 的 全 长， 应 用 生 物 信 息 学 方 法 分 析 其 核 酸 和 蛋 白 序 列 及 其 进 化 关 系， 并 在 线 预 测 蛋 白 质 二 级 和 三 级 结 构。 采 用 外 源６-ＢＡ 处 理 后 测 定 叶 片 中 花 青 苷 含 量， 并 通 过 实 时 荧 光 定 量ＰＣＲ 技 术 测 定 了ＬＢＤ３９ 基 因 在 外 源６-ＢＡ 处 理 后 的 表 达 水 平。 [ 结 果] 在 ２ 个 不 同 材 料 中 克 隆 获 得 的ＬＢＤ３９ 基 因 完 全 相 同， 序 列 长 为８７６ｂｐ， 包 含 编 码 区 长 为６９９ｂｐ 及 非 编 码 区 长 为１７７ｂｐ。 其 编 码 区 序 列 含 有１ 个 长 为６９６ｂｐ 的 开 放 阅 读 框ＯＲＦ， 编 码２３２ 个 氨 基 酸， 将 该 基 因 命 名 为ＢｒｃＬＢＤ３９。 亚 细 胞 定 位 预 测 该 蛋 白 分 布 在 细 胞 核 中， 蛋 白 相 对 分 子 质 量 为２５.３０１０ ３ ， 等 电 点 为８.８５。 进 化 树 分 析 表 明，ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 序 列 与 大 白 菜 ＢｒａＬＢＤ３９ 相 似 性 为１００％， 其 次 与 油 菜 和 甘 蓝 关 系 最 近， 相 似 性 分 别 为９９％ 和９３％。 外 源６-ＢＡ 处 理２４ｈ 以 后 紫 色 材 料 ＮＪＺＸ１-３ 叶 片 中 花 青 苷 含 量 均 高 于 对 照， 而 绿 色 突 变 体 叶 片 基 本 不 含 花 青 苷；ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 在２ 个 材 料 中 具 有 相 似 的 表 达 模 式， 即 先 下 降 后 上 升 而 后 又 下 降， 其 中 在 处 理 后４８ｈ 时ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 表 达 量 急 剧 增 加， 在 紫 色 和 绿 色 材 料 中 增 量 分 别 为 ７４.８４％ 和４９.８７％。 此 外，ＢｒｃＬＢＤ３９ 表 达 量 在 绿 色 材 料 中 明 显 高 于 紫 色 材 料。 [ 结 论] 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 负 调 控 基 因 ＢｒｃＬＢＤ３９ 既响应 外 源６-ＢＡ， 又 与 叶 片 中 花 青 苷 的 积累 密 切相 关， 在 花青苷 的生物 合成 过程中 起着 重要的 调控 作 用。 关 键 词 不 结 球 白 菜；ＬＢＤ３９； 同 源 克 隆； 序 列 分 析； 基 因 表 达 中 图 分 类 号Ｓ６３４.３ 文 献 标 志 码Ａ 文 章 编 号１０００－２０３０２０１８０１－００４９－０８ Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒＢｒｃＬＢＤ３９ａｎｄｉｔｓｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｅｘｏｇｅｎｏｕｓ６-ＢＡ ｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ ＤＯＮＧＨｕｉｊｉｅ，ＨＯＵＸｉｌｉｎ，ＨＡＮＫｅ，ＺＨＡＮＧＺｈｉｓｈｕｏ，ＨＵＣｈｕｎｍｅｉ ∗ ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ/ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ， ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ[Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ]ＴｈｅａｉｍｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｉｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆＬＢＤ３９ｇｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏ６-ＢＡｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ.[Ｍｅｔｈｏｄｓ]Ｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｏｆ ＬＢＤ３９ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｗｏｍａｔｅｒｉａｌｓｏｆｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ，ｔｈａｔｗａｓｔｈｅｐｕｒｐｌｅｓｅｌｆ-ｌｉｎｅＮＪＺＸ１-３ａｎｄｉｔｓｇｒｅｅｎｍｕｔａｎｔ ｌｉｎｅＮＪＺＸ１-０.Ｔｈｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ａｎｄｔｈｅｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｏｎｌｉｎｅ.Ｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙ６-ＢＡ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＬＢＤ３９ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ-ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｃｏｎｔｅｎｔｗａｓａｌｓｏｍｅａｓｕｒｅｄ.[Ｒｅｓｕｌｔｓ]Ｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ，ｗｉｔｈａｆｕｌｌ-ｌｅｎｇｔｈｏｆ８７６ｂｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃｏｄｅａｒｅａ６９９ｂｐａｎｄｔｈｅ ｎｏｎｃｏｄｅａｒｅａ１７７ｂｐ.ＴｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅＯＲＦｏｆｔｈｅｃｏｄｅａｒｅａｏｆＬＢＤ３９ｗａｓ６９６ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈａｎｄｅｎｃｏｄｅｄ２３２ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＢｒｃＬＢＤ３９.Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｃｅｌｌｎｕｃｌｅｕｓ.Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｗａｓ２５.３０１０ ３ ａｎｄｐＩｖａｌｕｅｗａｓ８.８５.ＴｈｅＢｒｃＬＢＤ３９ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄ１００％ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｔｏＢｒａＬＢＤ３９，ａｎｄｓｈａｒｅｄｔｈｅ ｍｏｓｔｃｌｏｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａ，ｔｈｅｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓａｎｄＢｒａｓｓｉｃａｏｌｅｒａｃｅａ，ｗｉｔｈｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｏｆ９９％ａｎｄ９３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｗｉｔｈｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ６-ＢＡ，ｔｏｔａｌａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｐｕｒｐｌｅｓｅｌｆ-ｌｉｎｅＮＪＺＸ１-３ｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌ ａｆｔｅｒ２４ｈ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｗｅｒｅａｂｓｅｎｔｉｎｔｈｅｇｒｅｅｎｍｕｔａｎｔｌｉｎｅＮＪＺＸ１-０.Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ＢｒｃＬＢＤ３９ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｌｆ-ｌｉｎｅｓｗｉｔｈｓｉｍｉｌａｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓ，ｗｈｉｃｈｄｅｃｌｉｎｅｄｆｉｒｓｔａｎｄｔｈｅｎｒｏｓｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｆｅｌｌａｇａｉｎ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 南 京 农 业 大 学 学 报 第４１ 卷 ｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｏｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｔ４８ｈ，ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅｍｅｎｔｏｆ７４.８４％ ａｎｄ４９.８７％ ｉｎｔｈｅｐｕｒｐｌｅａｎｄｇｒｅｅｎｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｉｎＮＪＺＸ１-０ｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＮＪＺＸ１-３.[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ]Ｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅ ＢｒｃＬＢＤ３９ ｗａｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ６-ＢＡ ａｎｄ ｈａｄ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ ｉｎ ｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ，ｉｔｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｍｉｇｈｔｐｌａｙａｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｉｎａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ. Ｋｅｙｗｏｒｄｓｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ；ＬＢＤ３９；ｈｏｍｏｌｏｇｙ-ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 不 结 球 白 菜Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ 是 一 类 十 字 花 科 蔬 菜， 其 营 养 丰 富， 深 受 人 们 喜 爱。 紫 色 不 结 球 白 菜 是 近 年 来 培 育 的 新 品 种， 叶 片 呈 紫 色， 富 含 花 青 苷。 花 青 苷 是 一 种 水 溶 性 色 素， 广 泛 存 在 于 植 物 液 泡 中， 使 植 物 呈 现 出 不 同 的 色 彩， 且 具 有 协 助 植 物 抵 抗 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 的 作 用 [１] 。 花 青 苷 不 仅 对 植 物 本 身 有 重 要 的 作 用， 对 人 类 健 康 也 有 非 常 重 要 的 医 疗 保 健 功 能， 具 有 抗 氧 化 和 抗 癌 作 用 [２－３] 。 花 青 苷 生 物 合 成 的 调 控 主 要 是 通 过 转 录 因 子 对 结 构 基 因 转 录 水 平 的 调 节 来 完 成 的。 其 中 正 调 控 基 因 主 要 包 括Ｒ２Ｒ３-ＭＹＢｖ-ｍｙｂａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒａｌｏｎｃｏｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｇｙ、ｂＨＬＨｂａｓｉｃｈｅｌｉｘ-ｌｏｏｐ-ｈｅｌｉｘ 和 ＷＤ４０ 类 转 录 因 子， 以 三 元 转 录 调 控 复 合 体ＢＭＷ 激 活 结 构 基 因 来 促 进 花 青 苷 的 生 物 合 成 [４] 。 负 调 节 基 因 主 要 有 两 类 一 类 是 转 录 因 子Ｒ３-ＭＹＢ [５] ， 另 一 类 是 受 氮 或 硝 酸 盐 诱 导 的ＬＢＤｌａｔｅｒａｌｏｒｇａｎｂｏｕｎｄａｒｙ ｄｏｍａｉｎ 转 录 因 子 家 族， 包 括ＬＢＤ３７、ＬＢＤ３８ 和ＬＢＤ３９ 基 因 [６－７] 。 目 前， 对 花 青 苷 合 成 调 控 因 子 的 研 究 大 多 集 中 在 正 调 控 因 子Ｒ２Ｒ３-ＭＹＢ、ｂＨＬＨ 和ＷＤ４０ 类 转 录 因 子 上， 对 负 调 控 基 因 特 别 是ＬＢＤ３９ 基 因 的 研 究 较 少。 本 试 验 以 紫 色 叶 自 交 系ＮＪＺＸ１-３ 及 其 绿 色 突 变 株 系ＮＪＺＸ１-０ 为 材 料， 利 用 同 源 克 隆 的 方 法 分 离 得 到 ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 的ｃＤＮＡ。 运 用 生 物 信 息 学 分 析 基 因 序 列， 比 较ＢｒｃＬＢＤ３９ 在２ 种 不 同 材 料 中 的 相 对 表 达 量 以 及 外 源６-ＢＡ 对 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 的 影 响， 为 进 一 步 研 究ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 的 功 能、 调 控 机 制 及 紫 色 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 合 成 的 分 子 调 控 机 制 奠 定 生 物 学 基 础。 １ 材 料 与 方 法 １.１ 试 验 材 料 供 试 材 料 不 结 球 白 菜 来 源 于 南 京 农 业 大 学 白 菜 系 统 生 物 学 实 验 室。 其 中 紫 色 叶 自 交 系ＮＪＺＸ１-３ 经 秋 水 仙 素 诱 导 后 筛 选 出 可 稳 定 遗 传 的 绿 色 突 变 系ＮＪＺＸ１-０。 将ＮＪＺＸ１-３ 与 绿 色 突 变 系ＮＪＺＸ１-０ 杂 交 后 得 到 的Ｆ １ 代 全 为 紫 色，Ｆ １ 自 交 后 得 到 的Ｆ ２ 后 代 植 株 中 紫 色 叶 与 绿 色 叶 的 比 例 约 为３∶１。 取 紫 色 叶 和 绿 色 突 变 植 株 自 交 系 植 株 作 为 试 验 材 料 图１。 将 种 子 用 蒸 馏 水 冲 洗 干 净， 室 温 催 芽３ｄ 左 右， 播 种 至 穴 盘 并 移 至 温 室。 图１ 不 结 球 白 菜 紫 色 自 交 系ＮＪＺＸ１-３ 和 绿 色 突 变 系ＮＪＺＸ１-０ 表 型 Ｆｉｇ.１ Ｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｐｕｒｐｌｅｓｅｌｆ-ｌｉｎｅＮＪＺＸ１-３ａｎｄｇｒｅｅｎｍｕｔａｎｔｌｉｎｅＮＪＺＸ１-０ｏｆｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ １.２ ｃＤＮＡ 的 合 成 用ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒ＴａＫａＲａ 分 别 提 取ＮＪＺＸ１-３ 和ＮＪＺＸ１-０７ 叶 期 叶 片 的 总ＲＮＡ。 使 用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ 反 转 录 试 剂 盒ＴａＫａＲａ 合 成 第 一 链ｃＤＮＡ 用 于ＬＢＤ３９ 基 因 克 隆。 用ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 分 别 提 取 经６-ＢＡ 溶 液 处 理 后 的 不 结 球 白 菜ＮＪＺＸ１-３ 和ＮＪＺＸ１-０ 总ＲＮＡ， 使 用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ ｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ 反 转 录 试 剂 盒ＴａＫａＲａ 合 成 单 链ｃＤＮＡ。 １.３ 不 结 球 白 菜ＬＢＤ３９ 基 因 克 隆 利 用 大 白 菜 数 据 库ＢＲＡＤ，ｈｔｔｐ//ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ.ｏｒｇ/ｂｒａｄ/ 中ＬＢＤ３９ 同 源 基 因ＢｒａＬＢＤ３９Ｂｒａ０１７８３１ 设 计 引 物 表１， 以 反 转 录 得 到 的 第 一 链ｃＤＮＡ 为 模 板。 ＰＣＲ 总 体 系２０μＬ 模 板１μＬ， 正、 反 引 物 各 １μＬ，２ＨｉＱＰＣＲＭＩＸ１０μＬ，ｄｄＨ ２ Ｏ７μＬ。 扩 增 条 件 为９５℃４ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ， ３５ 个 循 环；７２℃１０ｍｉｎ。 扩 增 产 物 经１５ｇＬ －１ 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离， 回 收 目 的 片 段， 经ＤＨ５α 转 化， 挑 ０ ５ 第１ 期 董 慧 杰， 等 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因ＢｒｃＬＢＤ３９ 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源６-ＢＡ 的 响 应 选 阳 性 克 隆 菌 液 测 序。 表１ 引 物 序 列 Ｔａｂｌｅ１ Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ 引 物 对 名 称Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｎａｍｅ 引 物 对 序 列５′→３′Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｓｅｑｕｅｎｃｅ 用 途Ｕｓａｇｅ ＬＢＤ３９-Ｆ/Ｒ ＡＴＧＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＴＡＧＡＧＴＴＣＴ/ ＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＴ 扩 增 保 守 片 段 Ｆｏｒｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ ＬＢＤ３９-Ｓ/Ａ ＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＡ/ＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴ 检 测ＬＢＤ３９ 的 表 达 ＦｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＢＤ３９ ａｃｔｉｎ-Ａ/Ｓ ＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴ/ＡＧＣＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＡＣ 检 测 内 参 基 因 的 表 达 Ｆｏｒｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｃｏｎｔｒｏｌ １.４ ＬＢＤ３９ 基 因 序 列 及 其 蛋 白 的 生 物 信 息 学 分 析 用Ｂｉｏｘｍ２.６ 软 件 查 找ＬＢＤ３９ 基 因 的 开 放 阅 读 框ＯＲＦ 并 推 导 其 氨 基 酸 序 列； 利 用 在 线 软 件ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｈｔｔｐ//ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ.ｈｔｍｌ 分 析 基 因ＬＢＤ３９ 编 码 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成， 推 测 其 相 对 分 子 质 量 和 等 电 点； 利 用ＰｒｏｔＳｃａｌｅｈｔｔｐ//ｗｅｂ. Ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａｌｅ/ 预 测 所 编 码 蛋 白 质 的 信 号 肽； 用 ＴＭＨＭＭ２.０ｈｔｔｐ//ｗｗｗ.Ｃｂｓ.Ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＴＭＨＭＭ/ 和ＰＳＯＲＴｈｔｔｐ//ｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ/ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ 分 别 对 其 跨 膜 结 构 域 和 亚 细 胞 定 位 进 行 预 测 分 析； 用ＮＣＢＩ 中 在 线 工 具ＳｐｅｃｉａｌｉｚｅｄＢＬＡＳＴｈｔｔｐ//ｗｗｗ. ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ 和ＩｎｔｅｒＰｒｏｈｔｔｐ//ｗｗｗ.ｅｂｉ.ａｃ.ｕｋ/ｉｎｔｅｒｐｒｏ/ 分 析 其 编 码 蛋 白 的 结 构 域； 采 用ＣｌｕｓｔａｌＸ２ 和ＧｅｎｅＤｏｃ 软 件 进 行 蛋 白 质 多 序 列 比 对， 用ＭＥＧＡ５.２ 软 件 构 建 系 统 进 化 树； 通 过 在 线 软 件Ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎｈｔｔｐｓ//ｗｗｗ.ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ.ｏｒｇ/ｖｉｓｕａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｑ ｉｄ＝５４０２６３ 和Ｐｈｙｒｅ２ｈｔｔｐ// ｗｗｗ.ｓｂｇ.ｂｉｏ.ｉｃ.ａｃ.ｕｋ/ｐｈｙｒｅ２/ｈｔｍｌ 分 析 其 蛋 白 质 序 列 的 二 级 结 构 并 进 行 三 级 结 构 建 模 预 测。 １.５ 外 源６-ＢＡ 处 理 不 结 球 白 菜 待 不 结 球 白 菜 植 株 长 到７ 叶 期 时， 叶 面 喷 施 质 量 浓 度 为３０ｍｇＬ －１ 的６-ＢＡ 溶 液， 并 于 喷 前 及 喷 后６、 １２、２４、３６、４８、７２ 和８４ｈ 剪 取 叶 片０.１ｇ， 置－８０℃ 保 存 备 用。 每 个 处 理３ 个 重 复。 为 了 增 强６-ＢＡ 的 吸 收 效 果， 喷 施 液 中 加 入０.４ｇＬ －１ 的 吐 温８０， 以 喷 施 等 量 清 水 加０.４ｇＬ －１ 吐 温８０ 作 为 对 照。 喷 施 时 间 为 １７００１８００。 １.６ 不 结 球 白 菜 总 花 青 苷 含 量 的 测 定 总 花 青 苷 的 提 取 参 照 王 小 青 等 [８] 的 方 法 并 略 有 改 动。 取 冷 冻 干 燥 叶 片０.１ｇ， 用 液 氮 研 磨 后， 加 入 １.５ｍＬ 酸 化 甲 醇 其 中 含 体 积 分 数 为３％ 的ＨＣｌ， 在 适 当 摇 晃 的 条 件 下 室 温 浸 提１０ｈ。 因 提 取 液 中 花 青 苷 见 光 易 分 解， 试 验 过 程 中 应 注 意 避 光 [９] 。 花 青 苷 含 量＝Ａ ５３０ －０.２５Ａ ６５７ /Ｍ， 其 中Ａ ５３０ 和Ａ ６５７ 表 示 花 青 苷 提 取 液 分 别 在５３０ 和６５７ｎｍ 下 的 吸 光 值；Ｍ 表 示 叶 片 鲜 质 量ｇ。 每 个 反 应 设３ 次 重 复。 １.７ 实 时 荧 光 定 量ＰＣＲ 表 达 分 析 根 据 克 隆 所 得ＬＢＤ３９ 基 因 的ｃＤＮＡ 全 长 序 列， 采 用ＢｅａｃｏｎＤｅｓｉｇｎｅｒ７ 软 件 设 计 正、 反 引 物 表１， ａｃｔｉｎ 基 因 [１０] 作 为 内 参。 试 验 参 照ＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ ＴＭ ⅡＴａＫａＲａ 试 剂 盒 的 说 明 书， 采 用 标 准 的 两 步 法 程 序， 在７５００ 实 时 荧 光 定 量ＰＣＲ 仪 美 国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 上 完 成 定 量 分 析。 反 应 体 系２０μＬ 模 板 稀 释１０ 倍２μＬ， 正、 反 引 物 各０.４μＬ，ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１０μＬ，ｄｄＨ ２ Ｏ７.２μＬ。 相 对 定 量 使 用 参 照 基 因 的ΔＣ Ｔ 法 [１１] ， 表 达 差 异 等 于２ －ΔΔＣ Ｔ ，ΔＣ Ｔ ＝Ｃ Ｔ 目 标 基 因 －Ｃ Ｔ ａｃｔｉｎ 。 每 个 反 应 设３ 次 生 物 学 重 复。 ２ 结 果 与 分 析 ２.１ 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 的 克 隆 及 序 列 分 析 分 别 以 紫 色 叶 自 交 系ＮＪＺＸ１-３ 及 其 绿 色 突 变 系ＮＪＺＸ１-０ 叶 片ｃＤＮＡ 为 模 板， 用 特 异 性 引 物 对 ＬＢＤ３９-Ｆ/Ｒ 扩 增 出 长 约９００ｂｐ 的 扩 增 产 物。 通 过 基 因 克 隆 分 别 获 得ＮＪＺＸ１-３ 和ＮＪＺＸ１-０ 中ＬＢＤ３９ 基 因 序 列。 测 序 结 果 图２ 表 明， 克 隆 所 得ＬＢＤ３９ 基 因 片 段 在２ 个 自 交 系 中 大 小 一 致， 长 度 均 为８７６ｂｐ， 其 中 包 括 编 码 区ＣＤＳ６９９ｂｐ， 非 编 码 区１７７ｂｐ１８４３６１， 其 编 码 区 序 列 含 有６９６ｂｐ 的 开 放 阅 读 框ＯＲＦ， 编 码２３２ 个 氨 基 酸， 将 克 隆 片 段 命 名 为ＢｒｃＬＢＤ３９。 核 苷 酸 序 列 比 对 发 现ＢｒｃＬＢＤ３９ 编 码 区 序 列 与 大 白 菜 ＢｒａＬＢＤ３９ 的 完 全 一 致 图３。 ２.２ 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 的 特 征 分 析 ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 等 电 点 为８.８５， 蛋 白 相 对 分 子 质 量 为２５.３０１０ ３ ， 氨 基 酸 组 成 中 丝 氨 酸Ｓｅｒ 所 占 比 例 １ ５ 南 京 农 业 大 学 学 报 第４１ 卷 图２ 不 结 球 白 菜 中ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 的 核 苷 酸 序 列 及 其 编 码 的 氨 基 酸 序 列 Ｆｉｇ.２ ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｃｉｄａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｆｒｏｍｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ ∗ 表 示 终 止 密 码 子。 ∗ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎ. 图３ 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 和 大 白 菜 中ＢｒａＬＢＤ３９ 基 因 的 核 苷 酸 序 列 比 对 Ｆｉｇ.３ ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｇｅｎｅｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇ ＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａｎｄＢｒａＬＢＤ３９ｇｅｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ 最 大。 ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 中 含 有 酸 性 氨 基 酸３７ 个， 碱 性 氨 基 酸３０ 个。 生 物 信 息 学 分 析 表 明ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 位 于 细 胞 核 中， 为 亲 水 性 蛋 白， 无 跨 膜 区。 保 守 域 分 析 结 果 表 明，ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 属 于ＤＵＦ２６０ 超 家 族。 运 图４ 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 编 码 蛋 白 的 二 级 结 构 Ｆｉｇ.４ ＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅＡＤＮＡ 结 合 区 域；Ｂ 蛋 白 结 合 区 域；Ｃα－ 螺 旋；Ｄ 延 伸 链；Ｅ 外 露 的 蛋 白 质；Ｆ 隐 藏 的 蛋 白 质。 ＡＤＮＡ-ｂｉｎｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＢＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；Ｃα-ｈｅｌｉｘ；ＤＥｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ；ＥＴｈｅｅｘｐｏｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＦＴｈｅｂｕｒｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ. 用Ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ 软 件 预 测ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 的 二 级 结 构 结 果 图４ 显 示 该 蛋 白 含 有５ 个ＤＮＡ 结 合 位 点，４０ 个 蛋 白 质 结 合 位 点， 其 二 级 结 构 由２５.２５％ 的α－ 螺 旋、６.８９％ 的 延 伸 链 以 及７２.８６％ 的 随 机 卷 曲 组 成。 此 外， 蛋 白 结 构 中 暴 露 在 外 的 氨 基 酸 占６８.５３％， 隐 藏 在 内 的 氨 基 酸 占２３.７１％， 其 余７.７６％ 的 氨 基 酸 居 中。 其 无 序 蛋 白 含 量 占６８.１０％， 表 明 该 蛋 白 结 构 灵 活 性 较 强。 预 测 的ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 的 三 级 结 构 图５ 与 其 二 级 结 构 预 测 结 果 基 本 相 符。 ２ ５ 第１ 期 董 慧 杰， 等 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因ＢｒｃＬＢＤ３９ 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源６-ＢＡ 的 响 应 图５ 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 三 级 结 构 的 预 测 Ｆｉｇ.５ ＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａα－ 螺 旋α-ｈｅｌｉｘ；ｂ 延 伸 链Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ；ｃ 随 机 卷 曲 Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌｓ. ２.３ ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 的 同 源 性 比 较 及 进 化 树 分 析 利 用ＢＬＡＳＴｐ 对ＢｒｃＬＢＤ３９ 编 码 的 蛋 白 序 列 进 行 同 源 检 索， 结 果 图６ 表 明，ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 与 大 白 菜 ＸＰ ００９１３８４９６.１ 中 的ＬＢＤ３９ 同 源 性 高 达１００％， 其 次 与 油 菜ＣＤＹ２９５６４.１、 甘 蓝ＸＰ ０１３５９５５７４.１ 的 同 源 性 较 高， 分 别 为９９％ 和９３％。 利 用ＣｌｕｓｔａｌＸ 及 ＧｅｎｅＤｏｃ 软 件 对 包 括ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 在 内 的７ 个 物 种 的ＬＢＤ３９ 蛋 白 序 列 进 行 多 重 比 对 分 析， 结 果 图６ 显 示，ＤＵＦ２６０ 超 家 族 所 在 的 区 域 第３１０２ 个 氨 基 酸 序 列 在 比 对 的 植 物 蛋 白 序 列 中 高 度 保 守， 表 明 ＢｒｃＬＢＤ３９ 编 码 的 蛋 白 可 能 与 其 他 物 种 的ＬＢＤ３９ 蛋 白 具 有 相 同 的 功 能。 此 外， 由４ 个 保 守 的 半 胱 氨 酸 残 基 组 成 的Ｃ-ｘ２-Ｃ-ｘ６-Ｃ-ｘ３-Ｃ 基 序 也 存 在 于 ＬＢＤ３９ 蛋 白 的 高 保 守 区 域 中。 图６ ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 和 其 他 植 物 已 知ＬＢＤ３９ 蛋 白 同 源 性 比 较 Ｆｉｇ.６ ＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ａｎｄＬＢＤ３９ｉｎｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ黑 框 第３１０２ 个 氨 基 酸 序 列 表 示ＤＵＦ２６０ 超 家 族 所 在 的 高 保 守 区 域， 黑 框 第３１７ 个 氨 基 酸 序 列 表 示Ｃ-ｘ２-Ｃ-ｘ６-Ｃ-ｘ３-Ｃ 基 序，Δ 表 示 半 胱 氨 酸。 Ⅰ 不 结 球 白 菜；Ⅱ 大 白 菜ＸＰ ００９１３８４９６.１；Ⅲ 油 菜ＣＤＹ２９５６４.１；Ⅳ 甘 蓝ＸＰ ０１３５９５５７４.１；Ⅴ 拟 南 芥 ＮＰ １９５４７０.１；Ⅵ 亚 麻 芥ＸＰ ０１０４３７２１７.１；Ⅶ 琴 叶 拟 南 芥ＸＰ ００２８６６９４１.１。 Ｂｌａｃｋｂｏｘ３－１０２ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｒｅａｏｆｔｈｅＤＵＦ２６０ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｂｌａｃｋｂｏｘ３－１７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄＣ-ｘ２-Ｃ-ｘ６-Ｃ-ｘ３-Ｃ ｍｏｔｉｆ，Δ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ.ⅠＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；ⅡＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ. ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ ＸＰ ００９１３８４９６.１；ⅢＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＣＤＹ２９５６４.１；ⅣＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａＸＰ ０１３５９５５７４.１；ⅤＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＮＰ １９５４７０.１； ⅥＣａｍｅｌｉｎａｓａｔｉｖａＸＰ ０１０４３７２１７.１；ⅦＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌｙｒａｔａＸＰ ００２８６６９４１.１. 为 进 一 步 分 析ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 与 其 他 植 物ＬＢＤ３９ 蛋 白 之 间 的 进 化 关 系， 在 多 重 比 对 的 基 础 上， 利 用 软 件ＭＥＧＡ５.２ 对 上 述 植 物 与 荠 菜ＸＰ ００６２８２６９７.１、 天 蓝 遏 蓝 菜ＪＡＵ１０８４９.１、 山 葵ＸＰ ００６４１１８７６.１ 和 萝 卜ＸＰ ０１８４５８８５４.１ 中 的ＬＢＤ３９ 蛋 白 进 行 系 统 进 化 分 析。 由 图７ 可 见ＬＢＤ３９ 的 进 化 基 本 符 合 植 物 分 类 学 地 位， 且 具 有 明 显 的 种 属 特 性， 同 一 科 植 物 不 同 属 之 间 的 分 类 明 显， 同 属 植 物 在 进 化 树 上 处 于 同 一 分 支。 其 中， 拟 南 芥 属 的 拟 南 芥 和 琴 叶 拟 南 芥 聚 为 一 组； 同 为 芸 薹 属 的 大 白 菜、 油 菜 和 甘 蓝 聚 为 一 组； 而 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 与 同 属 的 大 白 菜ＢｒａＬＢＤ３９ 关 系 最 近， 聚 为 一 组， 其 次 与 油 菜 和 甘 蓝 关 系 较 近。 ３ ５ 南 京 农 业 大 学 学 报 第４１ 卷 图７ ＢｒｃＬＢＤ３９ 蛋 白 与 其 他 植 物 中ＬＢＤ３９ 蛋 白 的 系 统 进 化 分 析 Ｆｉｇ.７ ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＬＢＤ３９ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ２.４ 外 源６-ＢＡ 处 理 后 不 结 球 白 菜 花 青 苷 含 量 的 变 化 由 图８ 可 见 在 紫 色 材 料ＮＪＺＸ１-３ 中 检 测 到 大 量 花 青 苷， 外 源６-ＢＡ 在 一 定 程 度 上 可 以 促 进 紫 色 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 的 积 累， 且 在 处 理２４ｈ 以 后 花 青 苷 含 量 均 高 于 对 照Ｐ０.０１。 而 绿 色 材 料ＮＪＺＸ１-０ 中 则 基 本 不 含 花 青 苷。 图８ 外 源６-ＢＡ 处 理 下 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 含 量 Ｆｉｇ.８ Ｔｈｅａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓｃｏｎｔｅｎｔｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｗｉｔｈｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓ６-ＢＡ 不 同 大 写 字 母 表 示 在０.０１ 水 平 上 差 异 极 显 著。 下 同。 Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔ０.０１ｌｅｖｅｌ.Ｔｈｅｓａｍｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ. 图９ 外 源６-ＢＡ 处 理 下 不 结 球 白 菜 中ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 相 对 表 达 量 Ｆｉｇ.９ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＢｒｃＬＢＤ３９ｇｅｎｅｉｎｎｏｎ-ｈｅａｄｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ ｗｉｔｈｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓ６-ＢＡ ２.５ 外 源６-ＢＡ 处 理 后 不 结 球 白 菜ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 的 表 达 分 析 由 图９ 可 见ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 在ＮＪＺＸ１-３ 和ＮＪＺＸ１-０ 中 的 表 达 水 平 不 同 但 具 有 相 似 的 表 达 模 式， 即 先 降 低 后 急 剧 升 高，４８ ｈ 时 表 达 量 达 到 最 高 而 后 又 急 剧 下 降。 在ＮＪＺＸ１-３ 中，６-ＢＡ 处 理 后，１２ ｈ 时 ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 表 达 量 降 低 了５１.７２％， 而４８ｈ 时 基 因 表 达 量 比 对 照 增 加 了７４.８４％， 在７２ｈ 时 表 达 量 又 急 剧 下 降。 在ＮＪＺＸ１-０ 中，６-ＢＡ 处 理 后，１２ｈ 时 基 因 表 达 量 降 低 了７４.９５％，４８ｈ 时 基 因 表 达 量 与 对 照 相 比 增 加 了４９.８７％。 此 外，ＢｒｃＬＢＤ３９ 基 因 在 紫 色 叶 材 料ＮＪＺＸ１-３ 中 的 表 达 量 明 显 低 于 绿 色 突 变 体 材 料 ＮＪＺＸ１-０。 ４ ５ 第１ 期 董 慧 杰， 等 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因ＢｒｃＬＢＤ３９ 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源６-ＢＡ 的 响 应 ３ 讨 论 ＬＢＤ 家 族 的 基 因 所 编 码 的 蛋 白 在 其Ｎ 末 端 含 有 约１００ 个 氨 基 酸 的 高 保 守 区 域， 其 中 保 守 基 序 Ｃ-ｘ２-Ｃ-ｘ６-Ｃ-ｘ３-Ｃ 存 在 于 所 有 的ＬＢＤ 蛋 白 中 [１２] 。 有 研 究 表 明，ＬＢＤ 家 族 的 基 因 可 编 码 锌 指 转 录 因 子， 其 中ＬＢＤ 家 族Ⅰ