不同菌剂处理对葡萄叶片细菌多样性的影响.pdf

p北方园艺２０１８（０４）８２－８７ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ研究简报第一作者简介郭继平（１９７９－），女，博士，副教授，研究方向为植物病理。Ｅ－ｍａｉｌｇｕｏｊｉｐｉｎｇ８８８＠１６３．ｃｏｍ．责任作者马光（１９７７－），男，博士，副教授，研究方向为植物生物技术。Ｅ－ｍａｉｌｍａａｏｈａｎ＠１６３．ｃｏｍ．基金项目河北省青年拔尖人才支持计划资助项目（２０１６１９）；河北省高等学校青年拔尖人才研究计划资助项目（ＢＪ２０１６０８）。收稿日期２０１７－０９－２５ｄｏｉ１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１７２８７１不同菌剂处理对葡萄叶片细菌多样性的影响郭 继 平１，马光１，王 志 杰１，齐 善 厚１，王 宝 梅２（１．衡水学院 生命科学系，河北 衡水０５３０００；２．宝鸡市农业科学院，陕西 宝鸡７２２４００）摘要以喷施砖红微杆菌Ｙ２４和解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２菌剂后的葡萄叶片为试材，采用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法研究葡萄叶片表面细菌多样性，以期阐明２种菌剂对葡萄叶片细菌多样性的影响。结果表明经过ＰＣＲ扩增出大小约为２５０ｂｐ的细菌１６ＳｒＤＮＡ Ｖ３可变区。经ＤＧＧＥ电泳共标记出１７条带，其对应葡萄叶片上的１５种已知细菌包括芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌ－ｌｕｓ）、微球菌属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、链霉菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等和２种非可培养细菌。其中砖红微杆菌Ｙ２４菌剂的细菌种类更为丰富，其中４条特有条带所代表的细菌类群包括微杆菌属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、马杜拉放线菌属（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）、黄假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖａ）和简单芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）。聚类分析表明，Ｙ２４菌剂处理后与对照及Ｎ２２菌剂处理的叶片在细菌多样性方面有明显差别，而Ｎ２２菌剂的处理与对照没有差别。系统发育分析表明，葡萄叶片喷施菌剂后，其表面细菌仍维持一定的多样性。砖红微杆菌Ｙ２４菌剂可显著提高葡萄叶片的细菌多样性，而解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２对葡萄叶片细菌多样性无显著性影响。关键词葡萄叶片；菌剂；细菌多样性；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ中图分类号Ｓ ４３２．１ 文献标识码Ｂ 文章编号１００１－０００９（２０１８）０４－００８２－０６葡萄（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）是世界上普遍种植的重要水果和酿酒原料之一。随着葡萄无公害生产技术的推进，生物拮抗菌剂在葡萄病害防治中的应用越来越广泛。生物菌剂的使用会影响葡萄叶片的微生物生态体系，改变葡萄叶片上的微生物多样性。植物叶片微生物多样性是衡量其群落结构稳定性的重要指标［１］。对葡萄叶片和果实微生物群落多样性的研究已有相关报道。ＭＡＲ－ＴＩＮＳ等［２］通过Ｔ－ＲＦＬＰ技术研究了法国ＬｕｓｓａｃＳｔ．Ｅｍｉｌｉｏｎ地区不同葡萄园中“美乐”葡萄上的附生细菌，发现其优势菌群为假单胞杆菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）和 鞘 脂 单 胞 菌 属 （Ｓｐｈｉｎ－ｇｏｍｏｎａｓ）。张世伟等［３］采用高通量测序技术对不同品种酿酒葡萄表皮的微生物群落进行了分析，结果显示，细菌主要分布在变形菌门（Ｐｒｏ－ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）等８个门，优势细菌主要是欧文氏菌属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等６个属。目前，利用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术进行微生物多样性研究越来越多［４－５］。以ＰＣＲ技术结合ＤＧＧＥ的ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术高效快速，并且可重复性高，可在短时间获取ＤＧＧＥ图谱，并直观的反映出样品中各组分的丰富度［６－７］。该研究采用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术，对葡萄叶片喷施砖红微杆菌（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｓｔａｃｅｕｍ）Ｙ２４和解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｎ２２菌剂，研究不同菌剂对葡萄叶片表面细菌多样性的影响，以期为生防菌剂防治葡萄病害提供生产指导，并为生物防治机理的研究提供数据支撑。１ 材料与方法１．１ 试验材料供试砖红微杆菌Ｙ２４和解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２由衡水学院生命科学系微生物学实验室前期研究筛选并保存，２种细菌对葡萄霜霉病菌和白腐病菌均具有拮抗作用。１．２ 试验方法１．２．１ 菌剂制备砖红微杆菌Ｙ２４菌剂将活化好的砖红微杆菌Ｙ２４接入ＹＥＰＤ液体培养基中，２８ ℃、１５０ｒｍｉｎ－１振荡培养７２ｈ，当发酵液中的活芽孢含量为２０亿ｍＬ－１时，加入１％吐温８０、０．５％山梨醇。解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２菌剂将活化好的解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２接入ＮＡ液体培养基中，２８℃、１５０ｒｍｉｎ－１振荡培养７２ｈ，当发酵液中的活芽孢含量为２０亿ｍＬ－１时，加入１％吐温８０、０．５％山梨醇。１．２．２ 葡萄植株的菌剂喷施和取样选择５年生葡萄树２０株，将上述２种菌剂分别稀释１００倍，在１６００以后向葡萄叶片正反面和果实均匀喷洒，３次重复。对照组不喷洒稀释菌液，保证其它条件与试验组一致。从５月３０日起，每间隔１０ｄ喷洒１次，共喷洒４次，７月１０日取样进行测定。每组处理分别随机采摘２０个葡萄叶片，３次重复。１．２．３ 基因组ＤＮＡ的提取和纯化将叶片的反正面均用无菌水冲洗１０次，收集冲洗后的水溶液，１２ ０００ｒｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上清收集菌体，再按Ｆａｓｔ ＤＮＡＴＭ ＳＰＩＮ ＫｉｔＦｏｒ Ｓｏｉｌ试剂盒说明提取总ＤＮＡ，并采用天根的ＤＮＡ凝胶回收试剂盒基因组ＤＮＡ进行纯化。１．２．４ 细菌１６ＳｒＤＮＡ Ｖ３区的ＰＣＲ扩增以样品基因组ＤＮＡ为模板，采用细菌通用引物ＧＣ－３３８Ｆ和５１８Ｒ扩增样品１６ＳｒＤＮＡ高变区序列。引物ＧＣ３３８Ｆ５′－ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧ－ＣＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＧＧＣ－ＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３′； 引 物５１８Ｒ５′－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３′。ＰＣＲ扩增体系（５０μＬ）１０ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ；ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌＬ－１）３．２μＬ；ｒ Ｔａｑ酶（５ＵμＬ－１）０．４μＬ；ＧＣ－３３８Ｆ（２０μｍｏｌＬ－１）１μＬ；５１８Ｒ（２０μｍｏｌＬ－１）１μＬ；模 板ＤＮＡ ５０ｎｇ；补ｄｄＨ２Ｏ至５０μＬ。ＰＣＲ扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５５℃复性４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；最终７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物采用ＯＭＥＧＡ公司ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃ－ｔｉｏｎ Ｋｉｔ纯化回收。１．２．５ ＰＣＲ产物的变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分析制备浓度为７％，即变性梯度范围为３５％～５５％的聚丙烯酰胺凝胶，取１０μＬ ＰＣＲ产物进行变形梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分析，在１ＴＡＥ缓冲液中１５０Ｖ、６０℃下电泳５ｈ。采用银染法染色，使用紫外凝胶系统拍照，并用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ４．６．９软件分析结果。１．２．６ ＤＧＧＥ图谱中优势条带的回收与测序根据ＤＧＧＥ图谱中样品条带数目及每个条带的强度（灰度），采用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件对每样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析，确定测序条带。采用ＯＭＥＧＡ公司Ｐｏｌｙ－Ｇｅｌ ＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ回收目的条带。以２μＬ回收产物为模板，３３８Ｆ／５１８Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增体系（５０μＬ）１０ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ；ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌＬ－１）３．２μＬ；ｒ Ｔａｑ酶（５ＵμＬ－１）０．４μＬ；３３８Ｆ（２０ｍｍｏｌＬ－１）１μＬ；５１８Ｒ（２０ｍｍｏｌＬ－１）１μＬ；模板ＤＮＡ １μＬ；补ｄｄＨ２Ｏ至５０μＬ。ＰＣＲ扩增程序９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃复性３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３０个循环；最后，７２℃延伸１０ｍｉｎ。将重新扩增的ＤＮＡ片段切胶回收、纯化后，连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，并转化至ＤＨ５α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。１．３ 数据分析测得的序列在ＮＣＢＩ数据库进行相似性比较。将测序结果和代表性菌株的ｒＲＮＡ部分序列用程序ＣｌｕｓｔａｌＸ ２．０．１１进行序列比对测序，依据 戴 斯 相 似 系 数ＵＰＧＭＡ并 采 用 软 件ＭＥＧＡ ６．０６构建进化树，分析亲缘关系及相似性，对各样品中细菌多样性等指标进行分析。３８ 第４期北方园艺２ 结果与分析２．１ 细菌１６ＳｒＤＮＡ Ｖ３可变区的扩增采用细菌通用引物ＧＣ－３３８Ｆ和５１８Ｒ扩增出的目的片段大小均约为２５０ｂｐ（图１）。条带经过ＤＮＡ琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收后满足ＤＧＧＥ电泳的条件。注１．ＤＬ２ ０００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；２．Ｙ２４；３．Ｎ２２；４．对照。Ｎｏｔｅ１．ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ２．Ｙ２４；３．Ｎ２２；４．Ｃｏｎｔｒｏｌ．图１细菌１６ＳｒＤＮＡＶ３可变区的扩增Ｆｉｇ．１ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ １６ＳｒＤＮＡＶ３ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ２．２ 细菌的ＤＧＧＥ图谱分析由图２可知，ＤＧＧＥ图谱均可以分离出清晰的电泳条带，说明葡萄叶片上的细菌多样性较高。２个处理和对照的条带的相对强度和迁移率不完全相同，说明三者中既存在共有细菌种群，又存在特有细菌。在ＤＧＧＥ图谱分析软件Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ给出的１７条条带（图２）中，与对照相比，喷施砖红微杆菌Ｙ２４菌剂特有的电泳条带有４条，说明喷施该菌剂后改变了叶片局部的微生态环境，使细菌菌群的种类更加丰富。与对照相比，喷施解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２菌剂后的电泳条带与对照无显著差异，说明喷施Ｎ２２菌剂后叶片的细菌种群无明显变化，也进一步反映Ｎ２２对葡萄叶片的微环境的影响较小。图２对照和处理组细菌的ＤＧＧＥ图谱Ｆｉｇ．２ ＤＧＧＥ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ２．３ 测序结果分析对图２中标注的１７条条带进行了克隆和测序。由表１可知，１７种条带所代表的细菌与表１葡萄叶片细菌ＤＧＧＥ条带测序结果Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＧＧＥ ｂａｎｄｓ ｉｎ ｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ测序条带编号Ｎｏ．ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂａｎｄｓ比对结果Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒｅｓｕｌｔ序列登录号ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．相似度Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ／％１ 微杆菌属Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ． ＥＵ７２１６１３．１ nbsp;９９２ 马杜拉放线菌属Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｓｐ． ＦＲ７４４９２７．１ nbsp;１００３ 黄假单胞菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖａ nbsp;ＫＭ２１９９８５．１ nbsp;１００４ 简单芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ nbsp;ＡＪ６２８７４７．１ nbsp;９９５ 产氧光合细菌Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ nbsp;ＣＰ００２６８４．１ nbsp;１００６ 食烷菌Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｐａｃｉｆｉｃｕｓ nbsp;ＤＱ６５９４５１．２ nbsp;１００７ 灰色链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ nbsp;Ｙ１５５０１．１ nbsp;１００８ 枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ nbsp;ＬＴ５４６４２８．１ nbsp;１００９ 地衣芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ nbsp;ＡＢ００６９２９．１ nbsp;１００１０ 葡萄假单胞菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｔｉｓｗｏｏｄｒｏｗｉｉ nbsp;ＬＯＫＧ０１０００００９．１ nbsp;９９１１ 非可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ nbsp;ＫＸ９９８１５６．１ nbsp;１００１２ 藤黄微球菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ nbsp;ＡＢ０８８７６４．１ nbsp;１００１３ 短杆菌属Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ． Ｄ８８２１２．１ nbsp;１００１４ 非可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ nbsp;ＫＸ９９６７５６．１ nbsp;９９１５ 解淀粉芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ nbsp;ＦＮ６６２４８６．１ nbsp;１００１６ 固氮菌属Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＭＦ３８３４９０．１ nbsp;１００１７ 微球菌属Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＨＥ５７５９０１．１ nbsp;１００４８北方园艺２月（下）ＮＣＢＩ公布的序列的最大相似度均在９９％以上。包括１５种已经被培养鉴定的细菌和２种尚未被鉴定的非可培养细菌。与对照和喷施解淀粉芽孢杆菌Ｎ２２菌剂的葡萄叶片相比，喷施砖红微杆菌Ｙ２４菌剂的葡萄叶片的细菌种类更为丰富，其中特有的条带１～４所代表的微生物类群为微杆菌属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）、马杜拉放线菌属（Ａｃｔｉ－ｎｏｍａｄｕｒａｓｐ．）、黄假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａ－ｖａ）和简单芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）。２．４ 聚类分析从图３可以看出，对照和处理的重复样品一共分为２类，第一类为Ｙ２４菌剂处理的３次重复样品，第二类为ＣＫ和Ｎ２２菌剂处理的３次重复样品。Ｙ２４处理单独在一个枝上，说明其与对照及Ｎ２２菌剂处理的叶片表面在细菌多样性上具有明显差别。而喷施Ｎ２２菌剂处理与对照聚在一个枝上，说明二者在叶片表面细菌多样性上没有差别，这也与２．２中ＤＧＧＥ图谱的结果相对应。图３处理和对照的聚类分析Ｆｉｇ．３ Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ２．５ 系统发育分析由图４可以看出，所测序列分为２个大枝。条带１２和藤黄微球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓＡＢ０８８７６４．１）聚为一个大枝。另一个大枝分为４组条带１、１３、１７、２和７聚为一组；条带３、１０、５、１６和６聚为一组；条带１１和１４为一组；条带４、８、１５和９为一组。从系统发育树可看出，聚在一枝的序列均是相近种属，该发育树的多个分支代表不同的细菌，体现出一定的多样性。可见葡萄叶片喷施菌剂后其表面的细菌仍维持一定的多样性。注数字１～１７代表表１中的测序条带编号。ＮｏｔｅＮｕｍｂｅｒｓ ｏｆ １－１７ｍｅａｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １．图４葡萄叶片上细菌的系统发育分析Ｆｉｇ．４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ３ 讨论从目前研究看，对葡萄果实上的细菌类群的研究更多一些。葡萄叶片和果实上的附生细菌种类既存在相似性，但又有各自独特的类群。如张世伟等［３］通过研究不同品种酿酒葡萄表皮的微生物群落发现，优势细菌主要是欧文氏菌属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、丙酸杆菌属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ－ｕｍ）、Ｋａｉｓｔｏｂａｃｔｅｒ和小双孢菌属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）等６个属。ＬＥＶＥＡＵ等［８］发现“霞多丽”葡萄上的优势菌属为假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）。ＭＡＲＴＩＮＳ等［２］发现“美乐”葡萄上的优势菌属为假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）和鞘脂单胞菌属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａ）。该研究中葡萄叶片表面上的细菌也是以假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）和芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）为主，说明葡萄植株中的不同部位如叶片和果实处于相同的生态环境中，细菌类群具有一定的相似性，但叶片和果实的营养和微环境又具有各自的特点，所以又存在一定的特异性。５８ 第４期北方园艺２０世纪４０年代以来，研究者一直采用分离培养的方法来研究微生物多样性，而事实上一些微生物经常处于“活的非可培养状态”［９］。尽管研究人员利用看家基因（特别是１６ＳｒＲＮＡ基因）了解混合细菌群落的特征，许多新的微生物种系型被发现。但在实际研究中，只有通过分离得到纯培养物种，才能够对该物种的生理生化综合特征和潜在致病性进行充分的评价。通过实验室人工培养方法已经分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的１％～５％，而其余９５％～９９％的微生物类群仍然未被分离和认识［１０］。因此，对于非可培养细菌的培养一直是研究的重点和难点［１１］。通过现代分子生物技术，可以绕过纯培养的手段来研究微生物的多样性，使其进入了一个崭新的研究阶段［１２］。变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术在微生物群落多样性和种群动态监测中得到广泛应用［１３］。该研究采用ＤＧＧＥ技术发现条带１１和条带１４均为非可培养细菌，需进一步进行研究鉴定。ＷＥＳＴ等［１４］应用ＤＧＧＥ技术研究了不同种植园中葡萄内生细菌多样性，特征条带测序结果显示，ＤＧＧＥ图谱中显示的优势细菌多数为不可培养细菌，说明非可培养细菌在葡萄植株上大量存在。参考文献［１］ＳＵＳＡＮ Ｓ Ｈ，ＣＨＲＩＳＴＥＮ Ｄ Ｕ．Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｅｃｏｓｙｓ－ｔｅｍ ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ－ａｐａｔｈｏｇｅｎ，ｉｃｅ ｎｕ－ｃｌｅｕｓ，ａｎｄ ｅｐｉｐｈｙｔｅ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅ－ｖｉｅｗｓ，２０００，６４（３）６２４－６５３．［２］ＭＡＲＴＩＮＳ Ｇ，ＬＡＵＧＡ Ｂ，ＭＩＯＴ－ＳＥＲＴＩＥＲ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒ－ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｇｒａｐｅｓ，ｌｅａｖ－ｅｓ，ｂａｒｋ ａｎｄ ｓｏｉｌ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｐｌａｎｔｓ ｇｒｏｗｎ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８（８）ｅ７３０１３．［３］张世伟，陈曦，钟其顶．不同品种酿酒葡萄表皮微生物群落多样性分析［Ｊ］．生物技术通报，２０１７，３３（３）１２８－１３７．［４］刘蓓一，丁成龙，乔伟艳，等．利用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术研究稻草与黑麦草混合青贮过程中菌群的动态变化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１１）１２３－１２６．［５］冉淦侨，张红艳，任平．ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术监测自然发酵葛根中微生物菌群动态变化［Ｊ］．生物技术通报，２０１７，３３（９）８５－９３．［６］刘沛．应用ＤＧＧＥ技术研究低分子量聚乙烯粉末对土壤细菌遗传多样性的影响［Ｄ］．成都四川师范大学，２０１７．［７］马俊孝，季明杰，孔健．ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（５）４９３－４９７．［８］ＬＥＶＥＡＵ Ｊ Ｈ Ｊ，ＴＥＣＨ Ｊ Ｊ．Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｉｃｓＢａｃｔｅ－ｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｎ ｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｂｅｒｒｉｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６ＳｒＲＮＡ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ［Ｃ］．Ｉｎｔｅｒ－ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ Ｄｉｓｅａ－ｓｅｓＣｈａｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．２０１０３１－４２．［９］ＢＬＯＯＭＦＩＥＬＤ Ｓ Ｆ，ＳＴＥＷＡＲＴ Ｇ Ｓ Ａ Ｂ，ＤＯＤＤ Ｃ Ｅ Ｒ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎ－ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ［Ｊ］．Ｍｉ－ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１４４１－３．［１０］ＲＡＰＰＥ Ｍ Ｓ，ＧＩＯＶＡＮＮＯＮＩ Ｓ Ｊ．Ｔｈｅ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｍａｊｏｒｉｔｙ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，５７３６９－３９４．［１１］张秀敏，滕忠才，任凯．“非可培养的”细菌研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１２，４０（１０）５８１１－５８１２，５８１９．［１２］ＳＴＥＥＬＥ Ｈ Ｌ，ＳＴＲＥＩＴ Ｗ Ｒ．ＭｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５，２４７（２）１０５－１１１．［１３］刘慧杰，杨彩云，田蕴．基于ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术的红树林区微生物群落结构［Ｊ］．微生物学报，２０１０，５０（７）９２３－９３０．［１４］ＷＥＳＴ Ｅ Ｒ，ＣＯＴＨＥＲ Ｅ Ｊ，ＳＴＥＥＬ Ｃ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃ－ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ［Ｊ］．Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，５６（３）２０９－２１６．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｒａｐｅ ＬｅａｖｅｓＧＵＯ Ｊｉｐｉｎｇ１，ＭＡ Ｇｕａｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｚｈｉｊｉｅ１，ＱＩ Ｓｈａｎｈｏｕ１，ＷＡＮＧ Ｂａｏｍｅｉ ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎｇｓｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｎｇｓｈｕｉ，Ｈｅｂｅｉ ０５３０００；２．Ｂａｏｊｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂａｏｊｉ，Ｓｈａａｎｘｉ ７２２４００）ＡｂｓｔｒａｃｔＧｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ ｔｈａｔ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ（Ｙ２４）ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｎ２２）ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｇｒａｐｅｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２５０ｂｐｂａｃｔｅｒｉａｌ １６ＳｒＤＮＡ Ｖ３ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｗａｓｈｅｄ ｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ，１７ｂａｎｄｓｗｅｒｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙＤＧＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｔｈｏｓｅ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ １５ｋｎｏｗｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ６８北方园艺２月（下）北方园艺２０１８（０４）８７－９０ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ设施园艺第一作者简介冯争光（１９７７－），男，硕士，副研究员，研究方向为果树设施栽培。Ｅ－ｍａｉｌｚｈｅｎｇｇｕａｎｇｆ＠１２６．ｃｏｍ．基金项目河北省科技支撑计划资助项目（１３２２６８１８Ｄ）。收稿日期２０１７－１０－１２ｄｏｉ１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１７２９４９不同落叶时期和落叶方式对设施桃无需冷栽培萌芽率的影响冯 争 光１，胡青２，杨 金 库１，王 桂 英１，刘 晓 杰１（１．廊坊市农林科学院，河北 廊坊０６５０００；２．沧州市园林绿化局，河北 沧州０６１０００）摘要以４年生“中农金辉”油桃为试材，在设施无需冷栽培方式下，采用不同落叶时期和落叶方式对油桃进行处理，分析了不同处理方式对油桃萌芽率的影响。结果表明在设施桃无需冷栽培中，不同落叶时期对萌芽率的影响差别很大，从８月开始，萌芽率逐渐升高，在９月中下旬时萌芽率达到最高，之后萌芽率开始下降，到１０月下旬时萌芽率降低为０％；不同落叶方式同样对萌芽率的影响很大，其中避光闷棚落叶的萌芽率最高，与人工摘叶和８％尿素脱叶相比差异极显著。由此筛选出了设施桃无需冷栽培方式下最适宜的落叶时期为９月中下旬，最适宜的落叶方式为避光闷棚落叶。关键词落叶时期；落叶方式；设施桃；无需冷栽培；萌芽率中图分类号Ｓ ６６２．１２７ 文献标识码Ａ 文章编号１００１－０００９（２０１８）０４－００８７－０４我国设施桃栽培起步较晚，２０世纪８０年代逐渐兴起，栽培区域主要集中在黄河以北，其中以山东、辽宁、河北省栽培面积最大，约占全国设施桃栽培总面积的７０％。据２０１５年统计数据，目前我国设施桃栽培总面积约２．０万ｈｍ２，年产值约４４．５亿元。对设施桃栽培而言，一般上市时间越早收益越高，而一直以来，在设施桃栽培中只有满足了不同品种的需冷量之后才能升温促生产，这是目前制约设施桃成熟期无法大幅提前的根本因素，致使设施桃的成熟期一直处于４５月。且随着设施桃栽培规模的逐年扩大，果品集中上市的现象越来越严重，栽培效益亦越来越低。ＦＵＣＨＩＧＡＭＩ等［１］把木本植物的休眠进程分成３个阶段“预休眠相”“内休眠相”和“环境休眠相”。ＦＡＵＳＴ等［２］研究表明在浅内休眠期，芽的休眠状态可通过人工摘叶或化学药剂处理等打破。高东升等［３］以２年生“曙光”油桃为试材，研ｇｒａｐｅ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＢａｃｉｌｌｕｓ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ａｎｄ ｔｗｏ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅｋｉｎｄｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｆｔｅｒ ｓｐｒａｙｉｎｇＹ２４ａｇｅｎｔ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ，ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｆｏｕｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｂａｎｄｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖａ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘ．Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｙ２４ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｏｆｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｎ２２ａｇｅｎｔｓ，ｂｕｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎ２２ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ ｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ ｒｅｍａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｒａｙｉｎｇｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔｓ．Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｓｅｄ ｔｈａｔ ｓｐｒａｙｉｎｇＹ２４ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ ｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ，ｗｈｉｌｅ Ｎ２２ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ ｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｇｒａｐｅ ｌｅａｖｅｓ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ；ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ/p