洋葱光周期途径转录因子基因AcCOL7的克隆及功能鉴定.pdf

p园艺学报， 2018， 45 3 493– 502. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0810； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;493 收稿日期 2018– 01– 11； 修回日期 2018– 03– 01 基金项目 黑龙江省自然科学基金面上项目 （ C2015017） ； 农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 （ NEU-HC-UADS- 201616） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ） nbsp;洋葱光周期途径转录因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鉴定 nbsp;盛 nbsp;洁，杨翠翠，吴小旭，袁巧玲，陈 nbsp;典，张东源，王 nbsp;勇*（东北农业大学园艺园林学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 nbsp;150030） nbsp;摘 nbsp;要 以洋葱品系‘ SA2’为材料，克隆到 1 个光周期途径重要转录因子 CONSTANS-like 基因，命名为 AcCOL7， 其 cDNA 序列全长 1 101 bp， 编码 366 个氨基酸。 多序列比对和结构域分析表明， AcCOL7蛋白包含 1 个 B-box 型锌指结构和 1 个 CCT 结构域；系统发育分析结果显示它与水稻 OsCOL13 亲缘关系较近；实时荧光定量 PCR 分析显示， AcCOL7 的表达量在抽薹前幼叶中最高，幼嫩花茎次之。为了解AcCOL7 的功能，构建了其过表达载体，转化拟南芥 co 突变体。与突变体植株相比，转化株表现为早花，且突变体的其他变异性状也得到了一定程度的恢复，表明 AcCOL7 与拟南芥的 AtCOL5 具有相似的功能，即在光周期诱导开花途径中具有显著的促进开花作用。 nbsp;关键词 洋葱； AcCOL7；基因表达模式；拟南芥 co 突变体；过表达载体；抽薹开花 nbsp;中图分类号 S 633.2 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 03-0493-10 Molecular Cloning and Functional Identification of Photoperiod Pathway Transcription Factor Gene AcCOL7 in Allium cepa SHENG Jie， YANG Cuicui， WU Xiaoxu， YUAN Qiaoling， CHEN Dian， ZHANG Dongyuan， and WANG Yong*（ College of Horticulture and Landscape Architecture， Northeast Agricultural University； Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（ Northeast Region） ， Ministry of Agriculture， Harbin 150030， China） nbsp;Abstract In this study， we cloned a CONSTANS-like transcription factor gene that is involved in the photoperiod pathway from the Allium cepa L.‘ SA2’ . The full-length cDNA of the gene， designated as AcCOL7， is 1 101 bp long and encodes 366 amino acids. Sequence alignment and motif analysis show that AcCOL7 contains a B-box zinc finger motif near the amino terminus and a conserved CCT domain near the carboxy terminus. Phylogenetic analysis shows that it has close relationship with OsCOL13. Real-time quantitative PCR reveals that AcCOL7 is expressed in different tissues， with higher expression level found in tender leaf and stem before bolting. To investigate the function of AcCOL7， we constructed an AcCOL7 over-expression vector and transed it into an Arabidopsis co mutant. We found that the transgenic plants exhibited earlier bolting and flowering compared with the mutant plants， and that other characters of the mutant plants were also recovered to some degree. These observations suggest that AcCOL7 has similar Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 494 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 493– 502. functions with the Arabidopsis AtCOL5， and that AcCOL7 likely plays a significant role in promoting flowering. nbsp;Keywords Allium cepa； AcCOL7； gene expression pattern； Arabidopsis co mutant； nbsp;over-expression vector； bolting 洋葱（ Allium cepa L.）是典型的 2 年生植物，其形态建成受光周期的严格调控。植物光周期调控涉及到诸多元素，如光敏色素（ PHY A， PHY B）和隐花色素（ Cry C） ，时钟节律元件（ CDF）及信号输出元件 CO 等（ Seaton et al.， 2015） 。其中 CONSTANS（ CO）基因是开花途径的重要模式元件，其表达变化在光周期诱导途径中发挥最核心的功能（付建新 nbsp;等， 2010） 。 nbsp;在拟南芥的光周期开花途径中， GI-CO-FT 是主要的信号通道。首先， GI 整合外部环境信号与自身内部信号并输出到下游的开花整合基因 CO， 该基因最终促进开花素基因 FT的表达来起始开花 。CO 在长期的进化过程中分化出了适应不同光周期的家族成员拟南芥 AtCOL3（ CO 同源基因） 、AtBBX32（ CO 同源基因） 、 AtCOL13（ CO 同源基因）均在开花途径中担任活化子的作用，促进 FT表达并使拟南芥提前开花（ Tripathi et al.， 2016） ；较为特殊的是 AtCOL9 及 AtCOL10，它们在拟南芥的开花时间调控上扮演一个抑制因子的角色 Cheng amp; Wang et al.， 2005，且与所对应到的同源基因阿拉伯芥 OnCOL9/10 的功能呈现相反情况（陈俊忠， 2012。 AtBBX19（ CO 同源基因）也是一个开花抑制子，它可以和 CO 相互作用，且在不影响 CO 表达丰度的情况下通过抑制 FT 转录水平来抑制开花（ Wang et al.， 2014） 。此外， AtBBX19 在拟南芥晚花突变体 upf1-5 和 upf3-1 中表达量升高，也表明其作为抑制信号的作用（ Nasim et al.， 2017） 。 nbsp;对于光周期诱导途径的研究发现，多数植物的光周期调控比双子叶拟南芥更为复杂，一些物种中的 CO-FT 模型在非诱导环境下可能作为抑制信号。在短日植物水稻中， OsCOL4 和 OsCOL9 通过阻遏 Ehd1（ CO 同源基因， 促进开花） 的表达来抑制开花 （ Lee et al.， 2010； Liu et al.， 2016） ； OsCOL16通过上调开花阻碍基因 Ghd7 来抑制开花（ Wu et al.， 2017） 。 nbsp;洋葱当年形成鳞茎，经冬贮春化后，第 2 年再经适合光周期成花结实，从而完成生命周期。已有的研究表明，洋葱中 GI 与 FKF1 基因相对保守，在昼夜表达模式上与拟南芥相似，是控制光周期开花的关键基因（ Taylor et al.， 2010） 。此外，开花素基因 FT，花序分生组织特异基因 LFY 都决定了洋葱是否成花（ Lee et al.， 2013； Yang et al.， 2016） 。但在洋葱中， GI 接收的信号是如何传递到FT 的，光信号的响应和传递途径中其他基因的作用如何，目前研究得较少。本研究中利用转录组测序结果，克隆洋葱的 CO 同源基因 COL7 全长序列；构建过表达载体转化拟南芥 co 突变体，观察基因对开花时间的作用，推测基因的功能。以便了解洋葱 COL 基因对成花的影响，进而丰富洋葱成花机理，为人工调控洋葱开花奠定基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料 nbsp;洋葱‘ SA2’为高世代长日型黄皮洋葱品系，由本课题培育。 2016 年下旬播种， 4 月 25 日定植，8 月 15 日采收，在此营养生长时期于叶片 7 叶时取假茎和鳞茎冻存，用于后续试验。 2017 年 4 月15 日将采收的种球定植于露地， 5 月中旬开花，开花前后取样。拟南芥，包括哥伦比亚生态型野生拟南芥（由本课题组提供）和 co 突变体拟南芥 SALK-096361C（购自于 TAIR 公司，遗传背景为哥盛 nbsp; 洁，杨翠翠，吴小旭，袁巧玲，陈 nbsp; 典，张东源，王 nbsp; 勇 . 洋葱光周期途径转录因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 3 493– 502. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 495 伦比亚野生型） ，突变基因为 COL5， 突变方式为 T-DNA 插入，表现为晚花表型。 nbsp;TA 克隆载体 1250-3301， LBA4404 农杆菌菌株和 DH5α 大肠杆菌菌株，皆由本课题组提供。 nbsp;引物（表 1） 均由上海生物工程技术服务有限公司合成。 nbsp;表 1 nbsp;试验所用引物序列 Table 1 nbsp;Primer sequences for cloning and qRT-PCR 用途 nbsp;Use 名称 nbsp;Name 序列 nbsp;Sequence（ 5′– 3′） nbsp;全长序列扩增，转化株检测 nbsp; nbsp;Full length amplification and identify of transed plants AcCOL7-1250-S AcCOL7-1250-A ATGAAAGAAGAGGAGCAGTT GGTTTGAGACAGTAAAAAGTCA AcCOL7 qRT-PCR AcCOL7-F AcCOL7-R ACAAAGCAAACACGGTCTCC ACGCTAACGTGAGCCTCATA 扩增内参基因 For reference gene amplification AcActin-F AcActin-R ACACGGCCTGGATAGCAACAT AGAGCAGTATTCCCAAGCATT 1.2 nbsp;试验方法 nbsp;1.2.1 nbsp;洋葱总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成 采用 Trizol 法（上海联硕 Invitrogen TRIZOL15596026）提取洋葱 RNA。 cDNA 第一链合成按照TOYOBO 公司的 ReverTra Ace qPCR RT Kit（ Code No.FSQ-101） 反转录试剂盒说明书操作。 nbsp;1.2.2 nbsp;AcCOL7 的克隆及生物信息学分析 nbsp;以营养生长时期的叶片总 RNA 反转录所得的 cDNA 为模板，以 AcCOL7-1250-S 和 AcCOL7- 1250-A 为引物克隆 AcCOL7（ 1 101 bp）基因的全长。反应体系包括 10 Taq 缓冲液 2 μL， dNTP（ 2.5 mmol L-1） 2 μL，引物（ 10 μmol L-1）各 0.5 μL， Taq DNA 聚合酶（ 5 U L-1） 0.2 μL，模板 cDNA 1 μg，水补足至 20 μL，反应条件为 94 ℃ nbsp;5 min； 94 ℃ nbsp;30 s， 52 ℃ nbsp;30 s， 72 ℃ nbsp;1 min， 30 个循环；72 ℃ nbsp;10 min。 nbsp;利用 DNAMAN 6.0.3 对 AcCOL7 进行同源序列比对，利用 MEGA5.2.2 软件构建进化树分析。 nbsp;1.2.3 nbsp;AcCOL7 表达模式分析 nbsp;为探讨 AcCOL7 在洋葱营养生长和生殖生长阶段各器官的表达特性，选取洋葱的营养生长 7 叶期假茎、7 叶期鳞茎，抽薹前幼叶、幼嫩花茎、花序，盛花期花茎、假茎、鳞茎、叶片、花苞，计10 个不同生长部位或器官材料，提取 RNA，均衡浓度后反转录，进行实时荧光定量检测。反应体系同上。反应条件为 95 ℃预变性 3 min； 95 ℃变性 10 s， 56 ℃退火 20 s， 72 ℃延伸 20 s， 30 个循环； 72 ℃延伸 10 min。 3 次重复，表达量计算方法为 2-ΔΔCt。 nbsp;1.2.4 nbsp;载体构建 nbsp; 利用 1250-3301 载体上的 XcmI 酶切位点，经 TA 克隆方式构建 AcCOL7 的过表达载体pAcCOL7-1250，载体结构见结果与分析部分，载体构建成功后经冻融法（ Wang et al.， 2011） ，将其导入农杆菌菌株 LBA4404 中。 nbsp;1.2.5 nbsp;拟南芥转化及表型分析 nbsp;将突变体植株培养至开花，利用花序侵染法转化拟南芥（ Yang et al.， 2016） ，经除草剂筛选（ 50 mg mL-1）和 PCR 扩增获得转化阳性株，调查转基因拟南芥与突变体的性状差异，测量株高和叶片数量，并调查花期。 以上拟南芥培养的光周期皆为 16 h /8 h，培养温度 25 ℃。 Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 496 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 493– 502. 2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;AcCOL7 的克隆 nbsp;以 AcCOL7-1250-S， AcCOL7-1250-A（表 1）为引物，以洋葱营养生长时期叶片 cDNA 为模板，扩增得到 AcCOL7（ KX553871） 。基因的 CDS 区为 1 101 bp，编码 366 个氨基酸，正电荷氨基酸残基 （ Arg Lys） 数为 42， 负电荷氨基酸残基数 （ Asp Glu） 数为 57。 蛋白分子式为 C1804H2811N515O585S18，相对分子质量为 41 651.34，等电点为 5.15。 nbsp;2.2 nbsp;AcCOL7 的生物信息学分析 nbsp;为确定洋葱 AcCOL7 与其他作物中 COL 的相似性，选取拟南芥 AtCO，油菜 BnCOL13，亚洲棉 GaCOL13，烟草 NtCOL13，与 AcCOL7 进行同源性比对和功能域分析。比对结果显示它们具有COL 典型的功能域， 即 B-box 和 CCT 结构域 （图 1） 。 洋葱 AcCOL7 中 B-box 锌指结构为 C-X2-C-X8- C-R-X-D-X4-C-X2-C-X4-H，与拟南芥 CO 蛋白构型类似。 AcCOL7 在 B-box 锌指结构和 CCT 结构域处高度保守，虽中部区域保守性很低，但仍有少数氨基酸序列表现为高度保守。说明 AcCOL7 是具有生物功能的 CO 类似基因。 nbsp;图 1 nbsp;AcCOL7 同源性分析 nbsp;AtCO拟南芥（ NP182310） ； BnCOL13油菜（ XP013690401） ； GaCOL13 nbsp;亚洲棉（ XP017634815） ； NtCOL13烟草（ XP016495983） 。 nbsp;Fig. 1 nbsp;AcCOL7 sequence homology analysis AtCO Arabidopsis thaliana（ NP182310） ； BnCOL13 Brassica napus（ XP013690401） ； GaCOL13 Gossypium arboretum （ XP017634815） ； NtCOL13 Nicotiana tabacum（ XP016495983） . 为了探讨 COL 在进化过程中的特点，利用 MEGA5.2.2 软件对来自于洋葱、拟南芥和水稻的 17个不同的 COL 编码的氨基酸序列做了进化树分析。从结果（图 2）上看， COL 可聚类为 2 大类，洋盛 nbsp; 洁，杨翠翠，吴小旭，袁巧玲，陈 nbsp; 典，张东源，王 nbsp; 勇 . 洋葱光周期途径转录因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 3 493– 502. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 497 葱 AcCOL7 与水稻 OsCOL13 聚在一起，说明两者的亲缘关系较近。系统分析结果显示，在一个进化分支内存在单子叶双子叶共存的现象，说明 CO 是古老的光周期基因在系统发生上，出现于单双子叶植物的歧化之前。 nbsp;图 2 nbsp;基于 COL 的系统发育分析 nbsp;Fig. 2 nbsp;Phylogenetic analysis of COL 2.3 nbsp;AcCOL7 的表达模式分析 nbsp; nbsp;图 3 显示， AcCOL7 虽然在整个生长周期中均有表达，但明显在抽薹开花后的花序等器官的表达量更低，此外营养生长阶段中假茎和鳞茎中的表达量也都较低，而当洋葱的发育状态由营养生长向生殖生长转变时， AcCOL7 高表达于抽薹前叶片和抽薹伊始出现的细嫩花茎中。这个结果也说明了该基因是光周期途径中接收光信号传导的重要基因，对植株的发育转换具有重要作用。 nbsp;图 3 nbsp;洋葱 AcCOL7 基因的时空表达特性 nbsp;Fig. 3 nbsp;Spatial and temporal expression of AcCOL7 gene Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 498 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 493– 502. 2.4 nbsp;AcCOL7 对拟南芥 co 突变体的功能补偿分析 nbsp; 构建了 AcCOL7 的过表达载体 pAcCOL7-1250（图 4） ，转化拟南芥 co 突变体，通过转化株的表型变化鉴定基因的功能。 nbsp;经除草剂筛选和 PCR 检测后（图 5）获得转化株 48 株。去除最早抽薹和最晚抽薹的极端株，在生长状态较为一致的群体里随机选取 15 株，均分为 5 组，调查抽薹期及其他植物学性状。 nbsp;图 4 nbsp;过表达载体 AcCOL7-1250 结构图 nbsp;Fig. 4 nbsp;Structure block of overexpression vector AcCOL7-1250 图 5 nbsp;部分阳性植株的 AcCOL7 扩增鉴定 nbsp;M DL2000 marker； 1 6部分转基因植株 PCR 鉴定。 nbsp;Fig. 5 nbsp;Amplification and identification of AcCOL7 positive plants M DL2000； 1– 6 PCR amplification of the transgenic plants. 转入过表达载体的 co 突变体阳性植株突变性状，即晚花表型得到了一定程度的恢复，具体表现为 co 突变体（ co-mutant）在 34 37 d 开始抽薹，莲座叶数（图 6）平均为 11.8 片；转 AcCOL7的 co 突变体植株在 30 32 d 开始抽薹，莲座叶数为 8 11 片；但作为对照的同一培养条件下的野生型（ WT）植株在 28 30 d 开始抽薹，莲座叶数平均为 7.8 片，说明 AcCOL7 在长日照条件下可使拟南芥 co 突变体提早抽薹，但并不能恢复到野生状态。 nbsp;图 6 nbsp;抽薹时野生型（ WT） 、转 AcCOL7 的 co 突变体（ 1 5）与 co 突变体（ co-mutant）植株莲座叶数及其叶面积比较 nbsp;Fig. 6 nbsp;Comparison of rosette number of leaf and leaf area of wild type， transgenic nbsp;AcCOL7 co-mutant（ 1– 5） and co-mutant plants nbsp;盛 nbsp; 洁，杨翠翠，吴小旭，袁巧玲，陈 nbsp; 典，张东源，王 nbsp; 勇 . 洋葱光周期途径转录因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 3 493– 502. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 499 此外， co 突变体的其他植物学性状的改变也被过表达载体部分逆转。 co 突变体（ co-mutant）植株莲座叶叶面积（图 6）平均为 2.01 cm2，株高（图 7）平均为 16.23 cm，转基因 co 突变体（ AcCOL7 co-mutant）植株莲座叶叶面积为 2.03 2.15 cm2，株高平均为 23.2 cm，野生型植株莲座叶叶面积平均为 3.17 cm2，株高平均为 22.33 cm。 nbsp;co 突变体植株叶片边缘有少许缺刻，花荚较为粗壮短小且发芽率较低；转基因的 co 突变体叶片边缘没有缺刻或者缺刻很少，其花荚较为细长窄小（图 7） ，但种子收取后发芽率仍较低，发芽率为 40左右。 nbsp;图 7 nbsp;拟南芥野生型（ WT） 、 co 突变体（ co-mutant）与转 AcCOL7 的 co 突变体（ AcCOL7 co-mutant）植株表型比较 nbsp;a莲座叶片； b花荚； c、 d抽薹情况。 nbsp;Fig. 7 nbsp;Phenotypic analysis of WT， co-mutants and transgenic AcCOL7 co-mutants a Leaf； b Pod； c and d Bolting. 3 nbsp;讨论 nbsp;CONSTANS-like 是植物光周期开花途径中关键的调节因子，它们具有特殊的结构特征，在靠近C端含有保守的 CCT结构域， 在 N端有类锌指 B-box结构域。 核因子 NF-Y可与 CCT结构域的 CCAAT元件相结合，协同激活 FT 的表达（ Swain et al.， 2016） 。 B-box 作为昼夜时钟输出的关键，可以精准的调控 CO 及 FT 的表达（ Wang et al.， 2014） 。 AtCOL7 具有典型的 B-box 结构域和 CCT 结构域，推测它对开花的调控机理与上述类似。 nbsp;Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 500 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 493– 502. 虽然 COL 广泛地参与对开花时间的控制， 但是在不同物种中对日长的响应和对开花起促进或抑制作用的方面却发生了种内和种间的分化。以模式植物拟南芥为例，拟南芥 AtCO 在长日照下促进 FT 的表达并诱导开花，而过表达的 AtCOL5 在短日照情况下也可以诱导拟南芥开花（ Hassidim et al.， 2009） 。短日照植物水稻 OsCO3 短日条件抑制开花（ Kim et al.， 2008） ， OsCOL4 和 Osbbx14则不受光周期调节，无论长日还是短日照条件下均抑制或延迟水稻开花（ Lee et al.， 2010； Bo et al.，2016） 。在短日植物大豆中 GmCOL5 和 GmCOL8 促进开花（张清哲 等， 2010） ，而 GmCOL2 对开花时间无显著作用（ Fan et al.， 2014） ；过表达的国兰 CsCOL1 可使烟草提前开花（ Yang amp; Zhu，2015）；红掌中 AaCOL1 和 AaCOL2 分别受短日照和长日照调节开花（牛俊海 nbsp;等， 2014） ；牡丹PsCOL4 会合成较多的 nbsp;PsCOL4 蛋白， 促使下游基因 SOC1 的表达， 最终调控牡丹开花 （王顺利 nbsp;等，2014） 。洋葱在栽培过程中适应环境形成了长日生态型、短日生态型以及中日生态型的分化，AtCOL7 可促使拟南芥突变体在长日条件下开花， 但其在短日生态型洋葱上的功能还有待于进一步研究。 nbsp;目前在许多植物中都克隆到 CO 同源基因， 其调控和功能方面的研究思路和结果将为洋葱中 CO同源基因的研究提供一定的参考价值。在水稻中，过表达 OsCOL10 能延迟抽穗， OsCOL10-RNAi植株与野生型相比在长短日照下差别不大（ Tan et al.， 2016） 。过表达的 OsCOL9 无论在长、短日照下均抑制 EHD1、 Hd3a 和 RFT1 的表达从而延迟水稻开花，且除了 EHD1 通路外， OsCOL9 独立运作于其他开花途径。 过表达的 OsCOL16 抑制抽薹开花， 且上调开花阻碍物 Ghd7 的表达， 导致 EHD1，Hd3a 和 RFT1 的表达下调（ Wu et al.， 2017） 。过表达的 OsCOL13，无论长、短日照均负向调节水稻开花，并下调 OsphyB，上调 EHD1 的表达（ Sheng et al.， 2016） ，这也说明 COL 在开花调控方向上的多样性。除 AtCOL7，还得到了几个洋葱的 COL 基因，每个基因的作用特点，它们与上、下游基因间的相互关系也是下一步研究工作的重点。 nbsp;对于现有遗传转化体系尚未完善的作物来说，利用拟南芥突变体进行功能补偿试验是研究基因功能的一个行之有效的方法，如陆地棉 Ghcol1-A 和 Ghcol1-D 可以恢复晚花表型的拟南芥 co-2 突变体并促进开花（ Cai et al.， 2017） ；黑麦草 LpCO 基因也可以互补拟南芥 co-2 突变体的晚花表型（付建新 nbsp;等， 2010） 。在本试验中， AcCOL7 可一定程度恢复拟南芥 co 突变体的晚花表型，但仍比野生型拟南芥略晚，这可能是由于参与光周期诱导途径的多个 COL 基因间存在冗余现象所致。 nbsp;植物的开花是一个复杂的过程，涉及到多个途径多种因素的整合。目前，模式植物中光周期调控研究相对较为清楚，但洋葱中，光周期因子如何协同调控开花尚不明确。克隆光周期中其他基因，研究在单一及协同背景下信号的传递关系，将有助于了解洋葱的开花调控网络，进而为打破不同生态型洋葱的地域限制提供可能。 nbsp;References nbsp;Bo Bai， Jie Zhao， Yaping Li， Fang Zhang， Jinjun Zhou， Fan Chen， Xianzhi Xie. 2016. Osbbx14， delays heading date by repressing florigen gene expression under long and short-day conditions in rice. Plant Science， 247 25. nbsp;Cai D， Liu H， Sang N， Huang X. 2017. Identification and characterization of CONSTANS-like（ COL） gene family in upland cotton（ Gossypium hirsutum L.） . Plos ONE， 12 6 e0179038. Chen Jun-zhong. 2012. Molecular cloning and characterization of CONSTANS-like genes in regulating plant development from Arabidopsis thaliana[Ph. D. Dissertation]. 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