利用黄秋葵转录组信息挖掘SSR标记及用于种质分析.pdf

p园艺学报， 2018， 45 3 579– 590. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0848； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;579 收稿日期 2018– 01– 19； 修回日期 2018– 03– 01 基金项目 福建省属公益类科研院所基本科研专项（ 2015R1026-9） ；福建省农业科学院蔬菜科技创新团队项目（ STIT2017-1-2）；福建省农业科学院 “青年科技英才百人计划 “项目（ YC2017-5）；国家特色蔬菜产业技术体系项目（ CARS-24-G-07） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ， ） nbsp;利用黄秋葵转录组信息挖掘 SSR 标记及用于种质分析 nbsp;李永平，刘建汀，陈敏氡，张前荣，朱海生*，温庆放*（福建省农业科学院作物研究所 /福建省农业科学院蔬菜研究中心 /福建省蔬菜工程技术研究中心，福州 nbsp;350013） nbsp;摘 nbsp;要 通过对黄秋葵（ Hibiscus esculentus L.）转录组信息分析，共获得 74 600 条 unigene，全部序列有 52 976 011 bp；有 3 191 条 unigene 包含 SSR 的序列，从中鉴定出 3 448 个 SSR 位点，其中有 235 条序列包含 1个以上 SSR， 复合 SSR有 123个。 优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸， 分别占总 SSR的 60.79和 21.43。二核苷酸重复基元中以 AG/CT 为优势重复基元，占总位点的 11.02，三核苷酸重复基元以AGA/TCT 为主，占总位点的 19.61。利用 Primer 3.0 共设计出 8 088 对 SSR 引物。从 87 对有效扩增引物中随机选择 60 对用于 32 份黄秋葵种质的多态性验证分析，其中 36 对（占 60）引物表现稳定可重复的多态性。利用 UPGMA 作图，将 32 份供试材料分为 2 类。利用黄秋葵转录组数据进行 SSR 标记开发，能获得较高频率的 SSR 位点，且类型丰富，为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。 nbsp;关键词 黄秋葵；转录组； SSR；多态性 nbsp;中图分类号 S 649 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 03-0579-12 SSR Markers Excavation and Germplasm Analysis Using the Transcriptome Ination of Hibiscus esculentus nbsp;LI Yongping， LIU Jianting， CHEN Mindong， ZHANG Qianrong， ZHU Haisheng*， and WEN Qingfang*（ Crops Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences； Vegetable Research Center， Fujian Academy of Agricultural Sciences； Fujian Engineering Research Center for Vegetables， Fuzhou 350013， China） nbsp;Abstract A total of 74 600 unigenes were obtained by transcriptome sequencing analysis from Hibiscus esculentus. The whole sequence was 52 976 011 bp and a total of 3 448 SSR loci were identified from 3 191 unigenes. 235 sequences contained more than one SSR locus and compound SSR loci sequences were 123. The major types such as trinucleotide and dinucleotide were accounted for 60.79 and 21.43，respectively. Furthermore， the AG/CT was the predominant dinucleotide repeat type（ 11.02） ， and the AGA/TCT was the predominant trinucleotide repeat type（ 19.61） . 8 088 pairs of SSR primers were found by Primer 3.0 and 60 pairs of primers were randomly selected from 87 pairs of effective amplification primers for polymorphism analysis of 32 Hibiscus esculentus samples. 36 primers（ 60） showed stable and Li Yongping， Liu Jianting， Chen Mindong， Zhang Qianrong， Zhu Haisheng， Wen Qingfang. SSR markers excavation and germplasm analysis using the transcriptome ination of Hibiscus esculentus.. 580 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 579– 590. repeatable polymorphism. According to the UPGMA analysis， 32 samples were divided into 2 groups. These results indicated that high frequency and various types of SSR markers could be acquired in Hibiscus esculentus by transcriptome sequencing analysis and abundant SSR markers would provide more reliable markers for genetic diversity analysis and genetic mapping construction in Hibiscus esculentus. Keywords Hibiscus esculentus； transcriptome； simple sequence repeat； polymorphism 黄秋葵（ Hibiscus esculentus L.）原产于非洲东北部，现世界各地均有栽培，以热带及亚热带地区种植最为普遍，中国主要在台湾和福建等地栽培。黄秋葵是极具保健价值的蔬菜（李建华和陈珊，2004；单承莺 nbsp;等， 2012；王维婷 nbsp;等， 2015） ，具有很大的发展潜力。 nbsp;黄秋葵种质资源丰富， 分布地域广， 栽培品种和变种较多。 据国际植物遗传资源委员会 （ IBPGR）报道，黄秋葵种质资源主要集中于印度、科特迪、尼日利亚、美国等国家。中国栽培黄秋葵的历史悠久，明代的本草纲目中已有述著。 20 世纪 80 年代，中国积极引进优良品种，目前中国热带作物研究院收集保存黄秋葵种质资源 50 多份（宫慧慧 nbsp;等， 2013） 。关于黄秋葵遗传多样性的研究报道较少。 Aladele 等（ 2008）利用 RAPD 技术对来自于亚洲及西非的 93 份黄秋葵资源进行聚类分析，Gulsen 等（ 2007）利用 SRAP 技术对来自于土耳其不同黄秋葵资源进行鉴定，张绪元等（ 2009）和Yuan 等（ 2014）分别利用 ISSR 分子标记对黄秋葵资源进行评价。目前尚未见 SSR 标记运用于黄秋葵资源鉴定、多样性评价等研究的报道，分子标记研究仍很薄弱，有必要在深度和广度上进一步拓展。 nbsp;微卫星序列即简单重复序列（ Simple sequence repeat， SSR）分子标记，广泛存在于真核和原核生物基因组中（ Kalia et al.， 2011），因其位点特异、复等位、呈共显性、在基因组序列中分布广泛等优点已经成为最为广泛的分子标记之一（ Kumar et al.， 2015），已成功应用于遗传多样性分析（ Daniela et al.， 2013；赵树琪 nbsp;等， 2016） 、品种鉴定（李丽和郑晓鹰， 2009；石星星 nbsp;等， 2015） 、遗传图谱建立（江锡兵 nbsp;等， 2015；高天翔 nbsp;等， 2016）等。 EST-SSR 标记来源于 DNA 序列的转录区，比基于基因组序列开发的 SSR 标记种间通用性更高，也更经济方便。 EST-SSR 标记在一些主要蔬菜作物中都有一定的开发与应用，如番茄（韩明利 nbsp;等， 2011） 、黄瓜（胡建斌和李建吾， 2008） 、油菜（李小白 nbsp;等， 2007） 、大白菜（忻雅 nbsp;等， 2006） 、甘蓝（陈琛 nbsp;等， 2010） 、萝卜（崔娜 nbsp;等， 2012）和辣椒（ Toru et al.， 2013）等。本研究中应用转录组测序获得的数据进行 SSR 标记搜索，分析其分布及组成特征，并进行可用性评价，以期为黄秋葵的种质资源多样性分析、品种鉴定、核心种质建立和分子标记辅助育种奠定基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;转录组数据来源 nbsp;从福建省农业科学院作物研究所黄秋葵种质资源库中选取绿色黄秋葵资源（全株及嫩果均为绿色，果实六棱至八棱，以六棱为主） ， 2017 年 4 月中旬播种， 5 月上旬定植于福建省农业科学院蔬菜中心基地， 6 月 5 日采花后 6 d 的嫩果，液氮速冻，– 80 ℃保存备用。测序时每个单株构建 1 个文库，委托广州基迪奥生物科技有限公司采用 Illumina HiSeqTM2500 PE125 系统进行 RNA-Seq 转录组测序（无参），采用 Trinity 进行序列组装，经过滤（去除含 adaptor、 N 的比例大于 10、质量值 Q≤20 的碱基数占整个 read 的 40以上的 reads）获得 3.87 G 的有效数据。 nbsp;李永平，刘建汀，陈敏氡，张前荣，朱海生，温庆放 . 利用黄秋葵转录组信息挖掘 SSR 标记及用于种质分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 579– 590. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;581 1.2 nbsp;材料及其 DNA 提取 nbsp;用于 SSR 引物筛选和可用性评价的材料为本人收集于亚蔬世界蔬菜中心、中国热带农业科学院、福建省农业科学院蔬菜中心资源库的 32 份种质资源（表 1） 。基因组 DNA 提取采用 CTAB 法进行。 nbsp;表 1 nbsp;黄秋葵 SSR 多态性分析材料 Table1 nbsp;List of tested Hibiscus esculentus L. materials for SSR polymorphism analysis nbsp; 来源 nbsp;Source 编号 nbsp;Code 原产国 nbsp;Country of origin 果实性状特征 nbsp;Fruit characters nbsp;亚蔬世界蔬菜中心 nbsp;World Vegetable Center Ys01 马来西亚 nbsp;Malaysia 六棱形，绿色 nbsp;Six ribbed， green Ys04 马来西亚 nbsp;Malaysia 六棱形，绿白色 nbsp;Six ribbed， green white s06 坦桑尼亚 nbsp;Tanzania 六棱形，浅绿色 nbsp;Six ribbed， pale green s07 菲律宾 nbsp;Philippines 六棱形，浅绿色 nbsp;Six ribbed， pale green Ys08 马拉维 nbsp;Malawi 六棱形，绿色 nbsp;Six ribbed， green s10 印度 nbsp;India 八棱形，绿色 nbsp;Eight ribbed， green s11 印度 nbsp;India 六棱形，浅绿色 nbsp;Six ribbed， pale green Ys15 美国 nbsp;America 五棱形，浅绿色 nbsp;Star-shaped， pale green s18 中国台湾 nbsp;Taiwan， China 六棱形，绿白色 nbsp;Six ribbed， green white s19 中国台湾 nbsp;Taiwan， China 五棱形，绿色 nbsp;Star-shaped， green Ys21 赞比亚 nbsp;Zambia 五棱形，浅绿色 nbsp;Star-shaped， pale green s28 越南 nbsp;Viet Nam 六棱形，绿白色 nbsp;Six ribbed， green white s29 越南 nbsp;Viet Nam 六棱形，绿白色 nbsp;Six ribbed， green white Ys31 苏里南 nbsp;Surinam 五棱形，绿色 nbsp;Star-shaped， green s33 苏里南 nbsp;Surinam 五棱形，浅绿色 nbsp;Star-shaped， Pale green s34 柬埔寨 nbsp;Cambodia 五棱形，绿色 nbsp;Star-shaped， green nbsp;Ys35 澳大利亚 nbsp;Australia 八棱形，浅绿 nbsp;Eight ribbed， pale green s37 美国 nbsp;America 五棱形，浅绿色 nbsp;Star-shaped， pale green s40 孟加拉 nbsp;Bangladesh 五棱形，绿色 nbsp;Star-shaped， green Ys43 南斯拉夫 nbsp;Yugoslavia 六棱形，红色 nbsp;Six ribbed， red s46 孟加拉 nbsp;Bangladesh 圆，浅绿色 nbsp;Round， pale green s50 柬埔寨 nbsp;Cambodia 五棱形，浅绿 nbsp;Star-shaped， pale green Ys51 菲律宾 nbsp;Philippines 圆，浅绿色 nbsp;Round， pale green s53 坦桑尼亚 nbsp;Tanzania 五棱形，绿色 nbsp;Star-shaped， green s55 土耳其 nbsp;Turkey 五棱形，绿色 nbsp;Star-shaped， green Ys56 土耳其 nbsp;Turkey 六棱形，绿色 nbsp;Six ribbed， green 中国热带农业科学院 Chinese Academy of nbsp;Tropical Agricultural Sciences Hk12 中国 nbsp;China 六棱形，深红色 nbsp;Six ribbed， dark red Hk13 中国 nbsp;China 五棱形，深红色 nbsp;Star-shaped， dark red Hk06 中国 nbsp;China 六棱形，深绿色 nbsp;Six ribbed， dark green k07 中国 nbsp;China 六棱形，绿色 nbsp;Six ribbed， green 福建省农业科学院蔬菜中心 Vegetable Research Hk03 中国 nbsp;China 六棱形，红色 nbsp;Six ribbed， red Center of Fujian Academy of Agricultural Sciences Hk08 中国 nbsp;China 六到八棱形，绿色 nbsp;Six to eight ribbed， green 1.3 nbsp;转录组 SSR 位点鉴别及 SSR 引物设计 nbsp;使用 MISA 程序（ http //pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）进行 SSR 位点搜索，以二、三、四、五、六核苷酸最少重复次数分别为 6、 5、 5、 4 和 4 次为标准进行搜索。用 Primer 3.0 软件对 SSR 重复单元前后的序列进行引物设计及评价，每条 SSR 产生 3 条引物。引物序列长度 18 27 bp， GC 含量40 60，退火温度 57 63 ℃，上、下游引物的 Tm值相差 nbsp;≤ nbsp;2 ℃，预期扩增产物长度 100 280 bp，且无二级结构和二聚体。 nbsp;Li Yongping， Liu Jianting， Chen Mindong， Zhang Qianrong， Zhu Haisheng， Wen Qingfang. SSR markers excavation and germplasm analysis using the transcriptome ination of Hibiscus esculentus.. 582 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 579– 590. 1.4 nbsp;EST-SSR 引物筛选 nbsp;PCR 反应体系为 20 μL， 其中 10 mmol L-1dNTPs 0.4 μL， 5 U Taq 酶 0.3 μL， 100 ng DNA 1.5 μL，10 μmol L-1的上、下游引物各 1 μL， 10 Buffer（ Mg2） 2.5 μL，加 ddH2O 补至 20 μL。 PCR 扩增程序为 95 ℃预变性 5 min；然后进行 35 个循环，每个循环包括 94 ℃变性 30 s， 56 ℃退火 30 s（退火温度因不同引物而异） ， 72 ℃延伸 1 min；最后 72 ℃延伸 7 min。 PCR 扩增产物 6变性聚丙烯酰胺凝胶检测， 160 V 电压， 3 h，银染显色后观察拍照。 nbsp;1.5 nbsp;数据统计 nbsp;SSR 发生频率为 SSR 的 unigene 数量与总 unigene 数量之比， SSR 的出现频率为 SSR 的个数与总 unigene 的数量比， SSR 平均分布距离为 1 kb 以上的 unigene 的碱基数与 SSR 数量之比。采用人工读带的方法， 将电泳图上可重复的清晰条带记为“ 1”，同一位置无带或不易分辨的弱带记为“ 0” ，建立原始数据矩阵。利用软件 NTsys2.10 按系统聚类进行聚类绘图。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;转录组中 SSR 的分布及结构特点 nbsp;黄秋葵转录组经组装后共获得 74 600 条 unigene（序列总长约 52 976 011 bp），用 MISA 软件对 1 kb 以上的 unigene（ 16 257 条，序列全长为 26 945 574 bp）进行搜索，发现其中 3 191 条 unigene序列中含有 3 448 个 SSR 位点，其中 235 条 unigene 含有两个或两个以上的 EST-SSR 位点。 SSR 发生频率为 19.63，出现频率为 20.59，平均 7.81 kb 出现 1 个 SSR，其中复合 SSR 有 123 个，占3.57。 SSR 重复类型 5 种均有，即二核苷酸至六核苷酸重复。其中三核苷酸和二核苷酸重复出现频率占优势，分别占总 SSR 的 60.79和 21.43；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的 8.93、 3.54和 5.31（表 2）。 nbsp;黄秋葵转录组 SSR 重复单元的重复次数分布在 4 26 次之间，其中 4 10 次的 SSR 共有 3 358个，占总数的 97.39；其次为 11 26 次的 SSR，共有 90 个，占总数的 2.61。黄秋葵转录组 SSR的长度主要集中在 12 256 bp，其中长度在 12 18 bp 的 SSR 达 2 504 个，占总数的 72.62，长度在 18 bp 以上的 SSR 有 944 个，只占 27.38。 nbsp;表 2 nbsp;黄秋葵 SSR 的类型、数量及分布频率 nbsp;Table 2 nbsp;Type， number and frequency of SSRs in Hibiscus esculentus L. 重复基序长度 nbsp;Repeat motif length 重复次数 nbsp;Repeat number 总计 nbsp;比例 / 4 5 6 7 8 9 10 11 14 ≥ nbsp;15 Total Ratio 二核苷酸 nbsp;Di 0 0 329 172 89 53 36 44 16 739 21.43 三核苷酸 nbsp;Tri 0 1 341 472 198 38 11 9 9 18 2 096 60.79 四核苷酸 nbsp;Tetra 232 56 9 6 2 0 1 1 1 308 8.93 五核苷酸 nbsp;Penta 87 24 9 1 0 0 1 0 0 122 3.54 六核苷酸 nbsp;Hexa 145 32 4 0 1 0 0 0 1 183 5.31 总计 nbsp;Total 464 1 453 823 377 130 64 47 54 36 3 448 nbsp;比例 Ratio 13.46 42.14 23.87 10.93 3.77 1.86 1.36 1.57 1.04 nbsp;100 2.2 nbsp;转录组中 SSR 基序重复类型和频率特征 nbsp;黄秋葵转录组中 3 448 个 SSR 位点共含 181 种重复基序，二、三、四、五、六核苷酸重复分别李永平，刘建汀，陈敏氡，张前荣，朱海生，温庆放 . 利用黄秋葵转录组信息挖掘 SSR 标记及用于种质分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 579– 590. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;583 有 4、 10、 25、 43 和 99 种。从分布频率来看（表 3） ，以三核苷酸重复类型 AAG/CTT 出现最多，占总 SSR 的 19.61，占三核苷酸重复基序的总数的 32.25。其次是二核苷酸重复类型 AG/CT，占总 SSR 的 11.02，占二核苷酸总数的 51.42。四核苷酸、五核苷酸尤其是六核苷酸重复基序分布较为分散，出现的频率较低。 nbsp;表 3 nbsp;黄秋葵转录中不同微卫星重复基序（ motif）出现的频率 nbsp;Table 3 nbsp;Occurrence frequency of different microsatellites motifs of Hibiscus esculentus 重复基序类型 nbsp;Repeat type 重复基序 nbsp;Repeat motif 数量 nbsp;Number 发生频率 / nbsp;Frequency 所占比例 / nbsp;Proportion 二核苷酸 nbsp;Di AG/CT 380 11.02 51.42 AT/AT 236 nbsp;6.84 31.93 AC/GT 118 3.42 15.97 CG/CG nbsp; 5 nbsp;0.15 nbsp;0.68 三核苷酸 nbsp;Tri AAG/CTT 676 19.61 32.25 AGC/CTG 321 9.31 15.31 ATC/ATG 242 nbsp;7.02 11.55 ACC/GGT 229 6.64 10.93 AGG/CCT 198 nbsp;5.74 nbsp;9.45 AAC/GTT 161 nbsp;4.67 nbsp;7.68 AAT/ATT nbsp;92 nbsp;2.67 nbsp;4.39 CCG/CGG nbsp;86 nbsp;2.49 nbsp;4.10 ACG/CGT nbsp;54 nbsp;1.57 nbsp;2.58 ACT/AGT nbsp;37 nbsp;1.07 nbsp;1.77 四核苷酸 nbsp;Tetra AAAG/CTTT nbsp;76 nbsp;2.20 24.67 AAAT/ATTT nbsp;61 nbsp;1.77 19.81 AAAC/GTTT nbsp;40 nbsp;1.16 12.99 ACAT/ATGT nbsp;24 nbsp;0.70 nbsp;7.79 其他 nbsp;Other 107 nbsp;3.10 34.74 五核苷酸 nbsp;Penta AAAAG/CTTTT nbsp;34 nbsp;0.99 27.87 AAAAC/GTTTT nbsp;10 nbsp;0.29 nbsp;8.20 AAAAT/ATTTT nbsp; 7 nbsp;0.20 nbsp;5.74 AAAGG/CCTTT nbsp; 7 nbsp;0.20 nbsp;5.74 其他 nbsp;Other nbsp;64 nbsp;1.87 52.45 六核苷酸 nbsp;Hexa AACAGC/CTGTTG AAGAGG/CCTCTT 6 6 0.17 0.17 3.28 3.28 AAAAAG/CTTTTT AAGGAG/CCTTCT ACCAGC/CTGGTG AGATGG/ATCTCC AGGCGG/CCGCCT 5 5 5 5 5 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 2.73 2.73 2.73 2.73 2.73 其他 nbsp;Other 146 nbsp;4.23 79.78 2.3 nbsp;黄秋葵转录组 SSR 引物设计与筛选 nbsp;利用 Primer3.0 对含 SSR 位点的 3 191 条 unigene 序列进行引物设计，共设计出引物 8 088 对。随机挑选 100 对不同重复单元（二、三、四、五、六核苷酸）的引物对黄秋葵‘ Hk08’ DNA 进行SSR-PCR 扩增，以验证其有效性。结果表明 100 对引物实现有效扩增，有效率为 100，其中 87 对（ 87.00） PCR 扩增产物与预期大小相符，有 13 对（ 13）扩增产物长度超过预期，分别是引物HeSSR006、 HeSSR008、 HeSSR010、 HeSSR012、 HeSSR015、 HeSSR016、 HeSSR021、 HeSSR024、HeSSR025、 HeSSR026、 HeSSR027、 HeSSR032 和 HeSSR034（图 1）。 nbsp;Li Yongping， Liu Jianting， Chen Mindong， Zhang Qianrong， Zhu Haisheng， Wen Qingfang. SSR markers excavation and germplasm analysis using the transcriptome ination of Hibiscus esculentus.. 584 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 579– 590. 图 1 nbsp;引物 HeSSR001 HeSSR100 对黄秋葵‘ Hk08’的扩增结果 nbsp;Fig. 1 nbsp;Amplification result of primer HeSSR001– HeSSR100 for‘ Hk08’ Hibiscus esculentus M DNA marker； 1– 100 HeSSR001– HeSSR100. 2.4 nbsp;多态性分析 nbsp;从 87 对有效扩增引物中随机选取 60 对 EST-SSR 引物对 32 份黄秋葵种质资源进行扩增及多态性评价（图 2 为引物 HeSSR020 和 HeSSR033 的扩增情况） ，其 中 36 对引物存在多态性差异（表 4） ，占有效扩增引物的 60。每对引物产生的条带数在 2 7 之间，共得到 147 条条带，其中多态性片段 102 个，每对引物平均产生 2.83 个多态性片段。 36 对 EST-SSR 标记的 PIC 平均值为 0.73，仅HeSSR011 引物 PIC 值小于 0.5， HeSSR088 的 PIC 值达到 0.87，表明这些 SSR 标记含有高度多态信息。 36 对多态性引物中二核苷酸重复的 5 对，三核苷酸重复的 14 对，五核苷酸重复的 6 对，六核苷酸重复的 11 对。 nbsp;图 2 nbsp;引物 HeSSR020（ A）和 HeSSR033（ B）在 32 份黄秋葵种质资源（ 1 32）中的多态性 nbsp;M DNA marker；箭头标注部分为差异条带。 nbsp;Fig. 2 nbsp;Polymorphisms showed in 32 Hibiscus esculentus germplasms（ 1– 32） by nbsp;primer HeSSR020（ A） and HeSSR033（ B） nbsp;M DNA marker； The arrows indicate the different bands. 李永平，刘建汀，陈敏氡，张前荣，朱海生，温庆放 . 利用黄秋葵转录组信息挖掘 SSR 标记及用于种质分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 579– 590. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;585 表 4 nbsp;黄秋葵 36 对 SSR 引物信息 nbsp;Table 4 nbsp;Ination of 36 pairs of SSR primers developed from Hibiscus esculentus 引物编号 nbsp;Primer No. 引物序列（ 5′→ 3′） nbsp;Primer sequence SSR 基元 nbsp;SSR motif 产物长度 /bp Length of nbsp;product 多态性条带 nbsp;数 Number of polymorphic nbsp;bands 多态信息量PIC HeSSR002 CGCTGCTCCAGACATAACAATCTTTCTCTCCGAACCTCCA ACG9169 5 0.83 HeSSR003 GGCGATCAAATTAGAAACCAGGTCACGCTGTAGCTCTCGAA AGC11122 3 0.75 HeSSR009 GAAGAACAAGGCAAGGCAAGAACATCTCCAAGCTCCCTCA GAA10270 3 0.73 HeSSR011 TGCAGGCAAATCAACTGAAGGTTTCCATTCGACTCGGGTA TA8206 2 0.47 HeSSR017 ACTGCCACTCAACAGCAATGTGCGACAATATTTCCAGCAG CAG8270 4 0.81 HeSSR020 TTCTCACTGCAGCAACAAGGTGCCACTTCTCTGCCTCTTT AGG8147 7 0.86 HeSSR023 CAAGGAGACAATGCAGGGTTATTCGATACCCAAAGCTCCC AAC8243 3 0.72 HeSSR030 GAGATCAAGAACGTGTGGCAAATCTTCGTTGGTTTCGGTG AAC8223 2 0.63 HeSSR033 TAAGAGGCGTGAAAGGAAGCAAGCTCAACCTTTACGGCAA AT9163 5 0.76 HeSSR036 GTGGGTTCAAACTTTGGGTGAAGCAGCAAGGTTATTACACTTTACA AT12268 3 0.71 HeSSR037 ACGTCATCCTCATTAACGGCTTCCTTTCCGACAATTCGAC nbsp; AG16210 4 0.68 HeSSR040 CGTTTGAACGCTACCCCATACCCGAAACCACCTAACTCAA GTT7280 6 0.82 HeSSR041 GCGAATCTTTTGGTATCGGAATGGATGATTTGGTGGGATG CTG7264 2 0.53 HeSSR043 GCTGCAGCTAAAACGCTTCTCGTAGTCCATGAGGGCAAAT TC12272 3 0.63 HeSSR046 GAATGGAAGCCAAAGGATCATGGAATGAATTTTATGATGATGG TTC7202 3 0.70 HeSSR051 AACTGGACCCGAGTGTTGTCAAGTATGGTGCCCATCATCG CTG7183 2 0.62 HeSSR054 TGGCAATGATCCATCTGAAACTTGCCATCGGAATCGTAAT GAA7208 3 0.64 HeSSR055 ATTCGATGCTGCTTCTTCGTCTGCGTTGTTTGTTCAGGTG AGA7113 3 0.72 HeSSR057 CTTCCGCATCTTCACCAAGTTTTCAACACGTGGATGTCGT AGA7210 3 0.59 HeSSR060 GGCAGTGGCTGATTGTTGTACAAAGCAGGACAGGAAAAGC CTAGC4227 4 0.77 HeSSR063 CGAGGTAGCCCCATCTATCATTCTTTCCGTCCAACCAATC ATTGA4196 6 0.85 HeSSR064 GCAGGAAGCTCTAGGGTCAAGACCCAACCAACTGGAGAAA AAAAG4196 5 0.70 HeSSR067 CAAAACAAACAATAAGGAACCCATGGCTTTACCTCAAACCCAG CAAAA4134 6 0.81 HeSSR068 TCACTCCTGAATCCTGGTCCGGCTTTGTCCGTGCTTATGT CTTCCC4167 4 0.76 HeSSR071 TCGTCCCTTTTAACAATCCGAATTCCCCCTACAATCCCAG TTCTTG4212 5 0.75 HeSSR074 TACTAGAGGGCAACGCCACTGGAGGAGGAAGAGGGAAATG GTGTT5205 4 0.71 HeSSR075 TATGGGCGAAAAATGACTCCCTTATTTTCATCGCCCCTGA CTCAT7177 4 0.73 HeSSR077 TGTCTCCGAGTGTTGTCTGCAACCCTAAACTTGGAGGGGA CTATAC4211 5 0.78 HeSSR078 CGTCGTCTTCATTTTCAGCAGATCGGCATCAGATCCACTT CTTCAG4182 4 0.69 HeSSR079 CGGCTGACTCATGACCACTATGCTTTCCAAGTGTTCCTCC AGGAGC4223 4 0.81 HeSSR081 GCGATTACATCAAAAACCCAGTCATTTCGCAAGGGAATGT GACTAG4233 4 0.76 HeSSR082 TTCTCCCCCTCCTCTTCAATTGACTCACTGGCACTTTGCT TCCATA4276 5 0.84 HeSSR087 GGACATTTTAATGCCGCTTCATCATGGTGGTGATGGGAGT TGCTGG4199 6 0.81 HeSSR088 TCAGGATTTGGGAATGAAGCGGCTCTGAATGTTTTGCCAT ACATGG4214 6 0.87 HeSSR094 TGACCTTGCTCGGGTACTTCCTAGGGT/p