番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法.pdf

p园艺学报， 2018， 45 11 2254– 2264. Acta Horticulturae Sinica nbsp; 2254 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0153； http //www. ahs. ac. cn 收稿日期 2018– 04– 25； 修回日期 2018– 11– 20 基金项目 国家重点研发计划项目（ 2017YFD0200603） ；中国农业科学院科技创新工程项目（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室 nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ； ） nbsp;番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重 PCR 检测方法 nbsp;康华军1,2，柴阿丽1,*，石延霞1，谢学文1，袁军海2，李宝聚1,*（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 nbsp;100081；2河北北方学院，河北张家口 nbsp;075061） nbsp;摘 nbsp;要 针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（ Pseudomonas syringae pv. tomato， Pst）、溃疡病菌（ Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Cmm）、青枯病菌（ Ralstonia solanacearum， Rs）以及疮痂病菌（ Xanthomonas campestris pv. vesicatoria， Xcv），建立了四重 PCR 检测技术，为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据 gap1 基因设计 Pst 特异性引物 BW-F/BW-R，经 PCR 条件优化，扩增出了 375 bp 的特异性片段。将设计的引物与已报道的 3 种细菌特异性引物组合，通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间，探索影响四重 PCR 扩增的因素，优化了其反应体系。四重 PCR反应体系中的引物对 BW-F/BW-R、 Fan1/Fan2、 RS-1-F/RS-3-R 和 XCVF/XCVR 可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为 375、 146、 716 和 517 bp 的特异性目的片段，反应体系退火温度为 57.1 ℃， 4 对引物的终浓度分别为 0.24、 0.16、 0.16 和 0.08 μmol L-1，延伸时间 45 s， 35 个循环。该四重 PCR 反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌，灵敏度达到 10-1 ng μL-1。 nbsp;关键词 番茄；细菌性斑点病菌；溃疡病菌；青枯病菌；疮痂病菌；四重 PCR 中图分类号 S 641.2 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 文章编号 0513-353X（ 2018） 11-2254-11 Quadruple PCR Detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Infected Tomato Tissues KANG Huajun1,2， CHAI Ali1,*， SHI Yanxia1， XIE Xuewen1， YUAN Junhai2， and LI Baoju1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Science， Beijing 100081， China；2Hebei North University， Zhangjiakou， Hebei 075061， China） nbsp;Abstract In order to establish a rapid and specific detection for tomato diseases， a quadruple PCR assay was designed for identifing the pathogens including Pseudomonas syringae pv. tomato（ Pst），Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis（ Cmm） ， Ralstonia solanacearum（ Rs） and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria（ Xcv） . The specific primers（ BW-F/BW-R） of Pst were designed based on the gap1 gene sequence， which can amplify 375 bp specific fragment by optimizing the PCR conditions. Besides， three pairs of specific primers of Cmm（ Fan1/Fan2）， Rs（ RS-1-F/RS-3-R）， and Xcv（ XCVF/ 康华军，柴阿丽，石延霞，谢学文，袁军海，李宝聚 . 番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重 PCR 检测方法 . 园艺学报， 2018， 45 11 2254– 2264. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 2255 XCVR） used in this study were referenced previous studies. The primer concentration， the annealing temperature， amplification cycles， and the extension time were optimized to obtain the best ratio of primers and amplification conditions. Then， the rapid quadruple PCR detection of pathogens in tomato was established. The annealing temperature was 57.1 ℃， the extension time was 45 s and the number of cycles was 35. The final concentrations of BW-F/BW-R primers， Fan1/Fan2 primers， RS-1-F/RS-3-R primers and XCVF/XCVR primers were 0.24， 0.16， 0.16 and 0.08 μmol L-1， respectively. The expected sizes of amplification bands were 375， 146， 716 and 517 bp for BW-F/BW-R， Fan1/Fan2， RS-1-F/RS-3-R and XCVF/XCVR， respectively. The quadruple PCR can simultaneously detect Pst， Cmm， Rs and Xcv in infected plants tissue， with the detection limits of 0.1ng μL-1gDNA. This study indicated that quadruple PCR might be a useful tool for rapid and sensitive diagnosis and provided an effective technical support for pathogenic identification Keywords tomato ； Pseudomonas syringae pv. tomato ； Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis； Ralstonia solanacearum； Xanthomonas campestris pv. vesicatoria； quadruple PCR 番茄生产上重要的细菌性病害主要有由丁香假单胞菌番茄致病变种（ Pseudomonas syringae pv. tomato， Pst）引起的细菌性斑点病；由茄科雷尔氏菌（ Ralstonia solanacearum， Rs）引起的青枯病；由密执安棍状杆菌密执安亚种（ Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Cmm）引起的溃疡病；由黄单胞菌属（ Xanthomonas ssp）多个种（ X. campestris pv. vesicatoria， Xcv； X. euvesicatoria，Xe； X. axonopodis pv. vesicatoria， Xav； Xanthomonas perforans， Xp； X. gardneri， Xg） 侵染引起 （ Jones et al.， 2004）的疮痂病。这 4 种病害的病原菌都可以通过伤口侵入、雨水传播，在田间或棚内湿度大时极易扩展蔓延。细菌性斑点病与疮痂病在发病初期时症状较为相似，均可形成圆形或不规则形褐色小斑点，病斑周围产生黄色晕圈；溃疡病与青枯病均属于系统性病害，可导致维管束变褐腐烂，植株萎蔫，发病初期难以区分。以上 4 种病原菌均可侵染番茄叶片、茎和果实，引起产量和果实品质的下降。因此，迫切需要一种能够在番茄发病初期及时将病原菌检测出来的技术，以及时控制病害的蔓延。 nbsp;传统的对植物细菌性病害的诊断方法主要有田间症状观察、病菌分离培养、致病性测定等，但存在诊断周期长、病原菌培养过程易污染、需要较丰富的植物病害诊断知识等问题；运用生理生化试验以及免疫学等方法对细菌进行鉴定，也存在着稳定性低、易出现假阳性结果、不能直接检测植物材料中的病原菌等缺点 （尹燕妮 nbsp;等， 2006） 。 目前， 分子检测方法如普通 PCR、 巢氏 PCR、 RT-PCR以及环介导等温扩增（ LAMP）技术已经较为广泛的应用于番茄病原细菌快速、准确的检测。Zaccardelli 等（ 2005）根据 hrpZpst基因设计细菌性斑点病菌 Pst 的特异性引物并成功建立 PCR 检测技术，可从自然发病番茄的叶片、种子和果实中将 Pst 准确检测出来；夏明星等（ 2006）针对溃疡病菌 Cmm 建立了 RT-PCR 检测技术， 可以较快速地从发病植株以及种子中将 Cmm 检测出来； Pizano等（ 2016）建立了利用巢氏 PCR 检测植物组织和种子中 Cmm 的技术； Singh 等（ 2014）根据 hrp基因设计青枯病菌 Rs 的特异性引物，建立了基于 Bio-PCR 的检测技术，可将 Rs 从植物材料、灌溉水以及土壤中检测出来；黄雯等（ 2016）基于 lpxC 基因序列设计引物，建立了 LAMP 检测技术，可检测番茄发病组织中的 Rs； Park 等（ 2009）利用常规 PCR 技术扩增 rhs 基因家族特异性片段检测疮痂病菌 Xcv。 nbsp;多重 PCR 是在普通 PCR 基础上发展起来的一项检测技术，可一次性对多个病原菌（包括真菌、Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2256 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2255– 2264. 细菌和病毒）进行检测。 Chen 等（ 2015）建立了小麦秆锈病菌、叶锈病菌以及白粉病菌的多重 PCR检测技术；罗文彬等（ 2015）应用多重 PCR 技术检测侵染马铃薯的 5 种病毒。目前，已有部分学者针对番茄病原细菌建立了多重 PCR 检测技术。 Ozdemir（ 2005）利用双重 PCR 技术检测溃疡病菌Cmm 与疮痂病菌 Xav； Umesha 和 Avinash（ 2015）开发了可用于检测植物材料、种子以及土壤中的青枯病菌 Rs 和疮痂病菌 Xp 的双重 PCR 技术。在田间，细菌性病害发生条件比较相似，并且可能存在多种细菌同时侵染番茄的情况。而目前针对番茄病害的检测多为一个或两个的病原细菌，工作量大，成本高，难以在短时间内实现病害的快速诊断。 nbsp;本研究中拟以 4 种番茄细菌性病害病原菌为研究对象， 首先设计 Pst 的特异性引物， 并与 Cmm、Rs 和 Xcv 的特异性检测引物组合，筛选并优化四重 PCR 反应检测体系，开发出同时检测番茄 4 种病原细菌的多重 PCR 检测方法，大大提高病原菌检测效率，为病害的早期准确诊断提供技术支撑。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;供试菌株及其基因组 DNA 的提取 nbsp;供试菌株的种名，来源及数量见表 1。 nbsp; 挑取番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌以及疮痂病菌单菌落于 NA 液体培养基中，28 ℃、 180 r min-1振荡培养 18 h。分别参照细菌基因组试剂盒和植物基因组试剂盒（北京天根生化科技有限公司）说明书进行基因组 DNA 的提取。提取出的 DNA 于– 20 ℃保存。 nbsp;表 1 nbsp;供试菌株 nbsp;Table 1 nbsp;Isolates used for selection of specific primers in this study 种名 nbsp;Species 引物 Amplification with primers BW-F/BW-R RS-1-F/RS-3-R Fan 1/Fan 2 XCVF/XCVR丁香假单胞菌番茄致病变种 nbsp;Pseudomonas syringae pv. tomato， Pst nbsp; - - - 密执安棍状杆菌密执安亚种 nbsp;Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Cmm - - - 茄科雷尔氏菌 nbsp;Ralstonia solanacearum， Rs - 野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种 nbsp;Xanthomonas campestris pv. vesicatoria， Xcv - - - 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 nbsp;Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum， Pcc - - - - 菊苣假单胞 nbsp;Pseudomonas cichorii， Pc丁香假单胞菌黄瓜致病变种 nbsp;Pseudomonas syringae pv. lachrymans， Psl - - - - 胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种 nbsp;Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense， Pcb - - - - 野油菜黄单胞菌油菜致病变种 nbsp;Xanthomonas campestris pv. campestris， Xcc - - - - 西瓜嗜酸菌 nbsp;Acidovorax citrulli， Ac - - - - 胡萝卜软腐果胶杆菌气味亚种 nbsp;Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum， Pco - - - - 桃色欧文氏菌 nbsp;Erwinia nbsp;persicina， Ep - - - - 托拉斯假单胞 nbsp;Pseudomonas tolasii， Pt - - - - 注 “ ”表示单一条带； “ -” 表示无条带。 nbsp;Note “ ” A single PCR band； “ -” No PCR band. 1.2 nbsp;番茄细菌性斑点病菌特异性引物设计及四重 PCR 引物组合 nbsp;从 NCBI 网站下载 Pst 与表 1 中其他细菌的 gap1 基因序列，应用软件 MEGA 5.0 将所下载的序列进行同源性比对， 根据 Pst 序列与其他细菌的差异位点设计出 Pst 特异性引物 BW-F/BW-R（表 2） ，产物长度为 375 bp。 nbsp;查阅国内外关于溃疡病菌、青枯病菌以及疮痂病菌分子检测的文献，选取可能进行四重 PCR 反康华军，柴阿丽，石延霞，谢学文，袁军海，李宝聚 . 番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重 PCR 检测方法 . 园艺学报， 2018， 45 11 2254– 2264. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 2257 应的引物组合。 溃疡病菌引物选自吴兴海等 （ 2007） 根据 16s rRNA 基因设计的特异性引物 Fan1/Fan2，产物长度为 146 bp；青枯病菌采用 Pastrik 等（ 2002）根据 16s rRNA 基因设计的特异性引物RS-1-F/RS-3-R，产物长度为 716 bp；疮痂病菌采用 Park 等（ 2009）根据 Rhs family protein 基因设计的特异性引物 XCVF/XCVR，产物长度为 517 bp。 nbsp;通过 NCBI 网站对这 4 对引物进行 BLAST 比对，确定这 4 对引物之间相似度比较低，符合组成四重 PCR 的条件，因此设计试验进行组合验证。供试引物组合见表 2。 nbsp;表 2 nbsp;四重 PCR 所用引物 nbsp;Table 2 nbsp;The primers used for quadruple PCR in this study 物种 nbsp;Species 引物（ 5′– 3′） nbsp;Primer 产物长度 / bp Product length 退火温度 /℃ nbsp;Annealing temperature 参考文献 nbsp;Reference Pst BW-F CGTTTCGACACTGTACAC BW-R CGATACCCAGTTCACGGTG 375 60 nbsp;Xcv XCVF GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA XCVR AATGACCTCGCCAGTTGAGT 517 58 Park et al.， 2009 Cmm Fan1GCATGTGCACCTCTCCTCTGTA nbsp;Fan2 CCCCACAAGGAGGCGTACTA 146 57 吴兴海 nbsp;等， 2007 Rs RS-1-F ACTAACGAAGCAGAGATGCATTA RS-3-R TTCACGGCAAGATCGCTC 716 57 Pastrik et al.， 2002 1.3 nbsp;四重 PCR 反应体系及优化 nbsp;1.3.1 nbsp;退火温度 nbsp; 退火温度直接影响引物与模板的特异性结合。 根据对 4 对引物碱基数量分析， 选定在 55 64 ℃之间设置 64、 63.4、 62.3、 60.7、 58.6、 57.1、 55.9 和 55 ℃，对不同引物组合的退火温度进行探索。 nbsp;1.3.2 nbsp;引物浓度 nbsp;每对引物与各自模板结合的频率受引物浓度的影响。在 25 μL 反应体系中，设定引物BW-F/BW-R 的浓度为 0.24 和 0.16 μmol L-1， RS-1-F/RS-3-R 的浓度为 0.24 和 0.16 μmol L-1，Fan1/Fan2 的浓度为 0.24， 0.16 和 0.08 μmol L-1， XCVF/XCVR 的浓度为 0.16 和 0.08 μmol L-1。共设置 24 个组合（表 3） 。四 重 PCR 反应体系 25 μL 2Taq PCR Master Mix 12.5 μL， BW-F/BW-R（ 10 μmol L-1） 0.6/0.4 μL， RS-1-F/RS-3-R（ 10 μmol L-1） 0.6/0.4 μL， Fan1/Fan2（ 10 μmol L-1） 0.6/0.4/0.2 μL， XCVF/XCVR（ 10 μmol L-1） 0.4/0.3 μL，细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌及疮痂病菌基因组 DNA（ 10 ng μL-1）各 1 μL， ddH2O 补充至 25 μL。反应程序为 94 ℃预变性 4 min； 94 ℃变性 30 s， 57 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 45 s， 35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。 PCR 反应结束后，取 5 μL PCR 产物 1.5琼脂糖凝胶电泳检测结果。 nbsp;1.3.3 nbsp;延伸时间和循环次数 nbsp;延伸时间分别设定为 30、 45、 60 和 90 s ；循环次数分别设定为 25、 30、 35 和 40 次。 nbsp;1.4 nbsp;四重 PCR 特异性检测 nbsp;将丁香假单胞菌番茄致病变种 Pst、密执安棍状杆菌密执安亚种 Cmm、茄科雷尔氏菌 Rs 和野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种 Xcv 基因组 DNA 等量混合均匀。分别以胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（ P. carotovorum subsp. carotovorum， Pcc） 、菊苣假单胞（ P. nbsp;cichorii， Pc） 、丁香假单胞菌流泪致病变种（ P. nbsp;syringae pv. lachrymans， Psl） 、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种（ P. carotovorum subsp. brasiliense， Pcb） 、野油菜黄单胞菌油菜致病变种（ X. campestris pv. campestris， Xcv） 、西瓜嗜酸菌Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2258 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2255– 2264. （ A. citrulli， Ac） 、胡萝卜软腐果胶杆菌气味亚种（ P. carotovorum subsp. odoriferum， Pco） 、桃色欧文氏菌（ E. persicina， Ep） 、托拉氏假单胞菌（ P. tolasii， Pt）以及丁香假单胞菌番茄致病变种、密执安棍状杆菌密执安亚种、茄科雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种混合基因组 DNA 为模板， ddH2O 为阴性对照，利用优化好的四重 PCR 反应条件下进行四重 PCR 反应，检验反应体系的特异性。 nbsp;1.5 nbsp;四重 PCR 灵敏性检测 nbsp;分别设置 Pst、 Cmm、 Rs 和 Xcv 混合基因组 DNA 浓度为 10、 1、 10-1、 10-2和 10-3ng μL-1，在优化后的四重 PCR 反应条件下进行扩增，凝胶电泳检测该体系灵敏度。 nbsp;1.6 nbsp;四重 PCR 检测番茄发病叶片 nbsp;1.6.1 接种发病组织检测 nbsp;采集接种发病的番茄细菌性斑点病、溃疡病、青枯病及疮痂病病害组织并提取基因组 DNA；将4 种发病组织基因组 DNA 等量混匀以及两两和三三混匀，分别作为四重 PCR 特异性检测的模板，同时以 4 种细菌基因组 DNA 作为阳性对照，健康植物基因组 DNA 为阴性对照。以优化好的四重PCR 反应体系对 Pst、 Cmm、 Rs 及 Xcv 进行特异性检测，验证该四重 PCR 反应体系。 nbsp;为了检验所建立的四重 PCR 反应体系的稳定性以及可重复性， 另外使用了大连宝生物工程有限公司生产的 TaKaRa Taq 酶进行四重 PCR 反应。反应体系 TaKaRa Taq（ 5 units μL-1） 0.125 μL，10 PCR Buffer 2.5 μL， dNTP Mixture（各 2.5 mmol L-1） 2 μL，引物体积（浓度）为优化后的体积，细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌及疮痂病菌基因组 DNA（ 10 ng μL-1）各 1 μL， ddH2O 补充至 25 μL。反应程序按照优化后的反应程序进行。两种反应体系均分别使用 C1000 TouchTM型（赛默飞世尔科技有限公司）与 AerisTM型（新加坡艺思高科技有限公司）热循环仪进行扩增。 nbsp;1.6.2 nbsp;田间发病植株检测 nbsp;对 2017 年从浙江苍南（ 12 份） 、山东寿光（ 8 份）和新疆昌吉（ 21 份）等地采集的 41 份番茄细菌性病害样本进行发病组织 DNA 的提取，以优化后的四重 PCR 反应体系对病原菌进行检测。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;番茄细菌性斑点病病原菌引物特异性扩增 nbsp;根据 gap1 基因设计的 Pst 特异性引物 BW-F/BW-R 可从供试的 3 个番茄细菌性斑点病菌（ Pst）菌株 DNA 中扩增出 375 bp 的产物，而其他细菌及阴性对照均无任何扩增（图 1） 。 nbsp;图 1 nbsp;引物 BW-F/BW-R 特异性扩增 nbsp;Fig. 1 nbsp;Specific amplified products obtained using primers BW-F/BW-R 康华军，柴阿丽，石延霞，谢学文，袁军海，李宝聚 . 番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重 PCR 检测方法 . 园艺学报， 2018， 45 11 2254– 2264. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 2259 2.2 nbsp;四重 PCR 反应体系及条件 nbsp; 通过对 55 64 ℃之间 8 个不同温度的探索，发现当退火温度为 57.1 ℃时，番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌 DNA 模板均能得到最大程度的扩增（图 2） 。 nbsp;图 2 nbsp;四重 PCR 退火温度优化 nbsp;Fig. 2 nbsp;Optimization for the annealing temperature of quadruple PCR 通过对引物 BW-F/BW-R、 Fan 1/Fan 2、 RS-1-F/RS-3-R 和 XCVF/XCVR 浓度组合的优化，最终当4 对引物浓度分别为 0.24、 0.16、 0.16 和 0.08 μmol L-1时可以同时有效的扩增 4 个目的片段（图 3） 。 nbsp;图 3 nbsp;四重 PCR 引物浓度（ μmol L-1）优化 nbsp;Fig. 3 nbsp;Optimization for the concentration of primers used in quadruple PCR 将不同延伸时间及循环次数下的 PCR 扩增产物进行 1.5琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度确定最佳延伸时间为 45 s（图 4） ，循环次数为 35 次（图 5） 。 nbsp;图 4 nbsp;四重 PCR 延伸时间 nbsp;Fig. 4 nbsp;The extending time of the quadruple PCR 图 5 nbsp;四重 PCR 循环次数 nbsp;Fig. 5 nbsp;The cycling times of the quadruple PCR Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2260 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2255– 2264. 四重 PCR 反应体系 2 Taq PCR Master Mix 12.5 μL， BW-F/BW-R、 Fan1/Fan2、 RS-1-F/RS-3-R和 XCVF/XCVR 分别为 0.6、 0.4、 0.4 和 0.2 μL， DNA 模板各 1 μL，补加 ddH2O 至 25 μL。反应程序 94 ℃预变性 4 min； 94 ℃变性 30 s， 57.1 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环；最后72 ℃延伸 10 min。 nbsp;2.3 nbsp;四重 PCR 的特异性 nbsp;利用优化好的四重 PCR 反应体系对目的菌株和非目的菌株进行 PCR 扩增， 检测该体系特异性。结果（图 6）显示， Pst、 Cmm、 Rs 和 Xcv 分别扩增出了 375、 146、 716 和 517 bp 的特异性目的条带，而其他非目的菌株以及阴性对照均没有扩增。 nbsp;图 6 nbsp;四重 PCR 特异性检测 nbsp;Fig. 6 nbsp;Specific detection of quadruple PCR for pathogens 2.4 nbsp;四重 PCR 的灵敏性 nbsp;由图 7 可见，当 DNA 浓度为 10-2 ng μL-1时仅能检测到 Xcv，而检测不到其他病原菌，因此，四重 PCR 体系灵敏度为 10-1ng μL-1。 nbsp;图 7 nbsp;四重 PCR 灵敏性检测 nbsp;Fig. 7 nbsp;The sensitivity of quadruple PCR detection 2.5 nbsp;番茄发病叶片的四重 PCR 检测 nbsp;2.5.1 nbsp;接种发病叶片检测 nbsp;提取采集的番茄 4 种细菌病害组织的基因组 DNA，以其等量混合作为阳性对照，以健康组织作为阴性对照，进行四重 PCR 检测。结果（图 8）显示，均可以扩增出 4 种细菌的特异性目的片段，检测结果与接种病原菌一致，而健康番茄组织中没有扩增。 nbsp;康华军，柴阿丽，石延霞，谢学文，袁军海，李宝聚 . 番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重 PCR 检测方法 . 园艺学报， 2018， 45 11 2254– 2264. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 2261 采用了宝日医生物技术（北京）有限公司和天根生化科技有限公司生产的 Taq 酶， PCR 仪采用赛默飞世尔科技有限公司的 C1000 TouchTM热循环仪和新加坡艺思高科技有限公司的 AerisTM扩增仪。因此，本研究中建立的四重 PCR 反应体系可以对番茄细菌性斑点病、溃疡病、青枯病及疮痂病快速诊断。 nbsp;图 8 nbsp;四重 PCR 特异性检测番茄发病组织 nbsp;A Taq 酶采用 2 Taq Master PCR Mix（北京博迈德生物技术有限公司） ， PCR 扩增由 C1000 TouchTM热循环仪（赛默飞世尔科技有限公司）完成； B Taq 酶采用 TaKaRa Taq 酶（大连宝生物工程有限公司） ， PCR 扩增由 C1000 TouchTM热循环仪（赛默飞世尔科技有限公司）完成。C Taq 酶采用 2 Taq Master PCR Mix（北京博迈德生物技术有限公司） ， PCR 扩增由 AerisTM型热循环仪（新加坡艺思高科技有限公司）完成； D Taq 酶采用 TaKaRa Taq 酶（大连宝生物工程有限公司） ， PCR 扩增由 AerisTM型热循环仪（新加坡艺思高科技有限公司）完成。 nbsp;Fig. 8 nbsp;Specific amplification for the DNA mix of pathogen-infected tomato tissues by quadruple PCR A 2 Taq Master PCR Mix（ Biomed） was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was pered by C1000 TouchTM thermal cycler （ Thermo Fisher Scientific） ； B TaKaRa Taq was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was pered by AerisTMthermal cycler （ ESCO） ； C 2 Taq Master PCR Mix（ Biomed） was used in the quadruple PCR system and PCR amplification was pered nbsp;by C1000 TouchTM thermal cycler（ Thermo Fisher Scientific） ； D TaKaRa Taq was used in the quadruple PCR system and nbsp;PCR amplification was pered by AerisTMthermal cycler（ ESCO） . Kang Huajun， Chai Ali， Shi Yanxia， Xie Xuewen， Yuan Junhai， Li Baoju. Quadruple PCR detection of Pseudomonas syringae pv. tomato， Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis， Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in infected tomato tissues. 2262 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;/p