番茄过表达SlMYB102对种子萌发及生长的影响.pdf

园艺学报， 2018， 45 8 1523– 1534. Acta Horticulturae Sinica doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0001； http //www. ahs. ac. cn 1523 收稿日期 2018– 03– 05； 修回日期 2018– 05– 11 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31672170） ；山东省泰山学者建设工程项目（ ts20130932） ；山东省“双一流”专项建设基金项目（ SYL2017YSTD06） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail ） 番茄过表达 SlMYB102对种子萌发及生长的影响 张 旭，陈丽琛，任仲海*（山东农业大学园艺科学与工程学院，山东果蔬优质高效生产协同创新中心 /农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018） 摘 要 番茄（ Solanum lycopersicum L.）基因组中已鉴定到 121 个 R2R3-MYB 转录因子，但其中绝大多数的生物学功能仍然未知。为探究 R2R3-MYB 转录因子基因 SlMYB102 的功能，从‘ Micro-Tom’番茄中，利用 PCR 技术克隆了 SlMYB102 的编码区，全长为 1 089 bp。保守结构域和系统进化树分析显示，SlMYB102 蛋白包含两个保守的 MYB 结构域，与马铃薯的 StMYB34 同源性最高。亚细胞定位结果显示，SlMYB102 编码的蛋白定位于细胞核中。 SlMYB102 在根、茎、叶、花和未绿熟、红熟果实中均有表达，在茎、叶、花中表达量较高。利用农杆菌介导，将 35SSlMYB102 转入番茄，获得了两个过表达株系。与野生型相比，过表达株系种子萌发速率明显升高，而植株高度、叶面积、地上部及地下部的鲜质量均显著降低。显微观察结果表明，与野生型相比，过表达株系叶片表皮细胞面积大小并没有变化，推测过表达 SlMYB102 是通过减少细胞分裂来抑制番茄植株的生长。 关键词 番茄； SlMYB102；过表达；生长发育 中图分类号 S 641.2 文献标志码 A 文章编号 0513-353X（ 2018） 08-1523-12 Effects of Overexpression of SlMYB102 on the Tomato Seed Germination and Growth ZHANG Xu， CHEN Lichen， and REN Zhonghai*（ College of Horticultural Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Shandong Collaborative Innovation Center of Fruit＆ Vegetable Quality and Efficient Production， Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in Huang-Huai Region， Ministry of Agriculture， State Key Laboratory of Corp Biology， Tai’an，Shandong 271018， China） Abstract A total of 121 R2R3-MYB transcription factors were identified in the tomato（ Solanum lycopersicum L.） genome. But the biological function for most of these transcription factors was not clear. To explore the function of SlMYB102， its coding region of 1 089 bp was cloned from‘ Micro-Tom’ tomato（ WT） by PCR. Conserved domain and phylogenetic analysis showed that SlMYB102 included two conserved domanins of MYB and shared the highest similarity with StMYB34. Subcellular localization analysis indicated that the protein encoded by SlMYB102 was located in the nucleus. SlMYB102 was expressed in all tissues， and relatively higher expression level was observed in stem， leaf and flower. Two transgenic tomato lines overexpressing SlMYB102 were obtained through Agrobacterium-mediated Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1524 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 8 1523– 1534. transation. The germination rate of the seeds from the transgenic lines was faster than that from WT，while the plant height， leaf area， fresh weight of shoot and root were all decreased. However， the leaf epidermal cell size did not change in the transgenic lines compared with WT. Therefore， the over- expression of SlMYB102 may negatively regulate plant growth by reducing cell division in tomato. Keywords tomato； SlMYB102； overexpression； development 番茄（ Solanum lycopersicum L.）是在世界范围内广泛种植的重要蔬菜作物，同时也是一种应用于科学研究的模式植物。基因组测序的完成，为番茄功能基因研究提供了广阔空间（ Tomato Genome Consortium， 2012） 。 R2R3-MYB 作为 MYB 转录因子家族中数量最多的一类，在调节植物生长发育过程中具有重要的作用（ Dubos et al.， 2010） 。如在拟南芥中， AtGL1 和 AtMYB23 可以调控叶表皮毛的形成（ Kirik et al.， 2005） ， AtMYB37/RAX1、 AtMYB38/RAX2/BIT、 AtMYB84/RAX3 可以调控腋生分生组织形成 （ Keller et al.， 2006； Muller et al.， 2006） ， AtMYB91/AS1 可以调节芽和叶的形成 （ Byrne et al.， 2000） ， AtMYB59可以调控根系的生长（ Mu et al.， 2009） ， AtMYB38 和 AtMYB18/LAF1 可以调节下胚轴的伸长（ Hong et al.， 2008； Yang et al.， 2009） ，过表达 AtMYB41 使植株矮化（ Cominelli et al.， 2008） ；在棉花中，GhMYB25 和 GhMYB109 可以调节纤维的发育（ Pu et al.， 2008； Machado et al.， 2009） ；在烟草中，过表达 NtMYB1、 NtAn2 可以促进花青素积累（ Pattanaik et al.， 2010； Meng et al.， 2014） ，将 NbPHAN沉默后影响叶片的发育（ Huang et al.， 2013） ；在苹果中， MdGAMYB 可以调控花芽发育（樊胜 等，2017） ；在茄子中， SmMYB 可以正调控花青素的合成（邵文婷 等， 2013） ；在番茄中， SlMYB12 可以调控果实果皮黄酮醇的合成（ Adato et al.， 2009； Fernandez-Moreno et al.， 2016） ，过表达SlMYB75/SlAN2 和 SlANT1 促进花青素的合成 （ Kiferle et al.， 2015； Meng et al.， 2015） ， SlMYB189/Blind和 SlMYB117/Trifoliate 可以调控侧生器官的发育和腋分生组织的形成 （ Schmitz et al.， 2002； Naz et al.，2013） 。 目前，在番茄中已鉴定到 121 个 R2R3-MYB 转录因子（ Zhao et al.， 2014）,但是绝大多数的功能亟待研究。转录因子 SlMYB102 功能未知，为确定其生物学功能，本研究中克隆了 SlMYB102，对比分析其与其他物种 R2R3-MYB 蛋白的同源性，并进行亚细胞定位。通过转基因分析初步发现SlMYB102 在调节番茄种子萌发及植株生长过程中发挥了重要作用，为揭示 R2R3-MYB 转录因子在调节植物的生长发育过程中的作用机制提供了理论支持。 1 材料与方法 1.1 植物材料 试验材料为矮生番茄（ Solanum lycopersicum L.） ‘ Micro-Tom’ （野生型， WT）及 SlMYB102 转基因株系 （ OE） 。 2017 年春季， 试验材料在山东农业大学作物生物学国家重点实验室植物生长室 （光照 18.5 klx，光照时长 16 h、昼夜温度 28 ℃ /18 ℃、湿度 80）中培养。取野生型幼苗的根、茎、叶、开花当天的花、绿熟期和成熟期的果实，用液氮速冻保存，用于 RNA 的提取。 1.2 进化树分析 在番茄基因组数据库（ https //）中获得 SlMYB102 的蛋白序列，然后在番茄、张 旭，陈丽琛，任仲海 . 番茄过表达 SlMYB102 对种子萌发及生长的影响 . 园艺学报， 2018， 45 8 1523– 1534. 1525 拟南芥、 水稻、 棉花、 马铃薯、 柑橘等 6 个物种基因组数据库中用 BLAST 进行分析， 参照分类 （ Zhao et al.， 2014）下载 R2R3-MYBC7 类的同源蛋白序列，利用 MEGA6.0 软件构建系统进化树。 1.3 SlMYB102-GFP 融合表达载体的构建及亚细胞定位 测序正确的质粒 pEASY SlMYB102 用 BamHⅠ、 KpnⅠ酶切后，连接到用相同酶酶切的亚细胞定位载体 pROKⅡ上，得到 SlMYB102-GFP 融合表达载体，将其转化农杆菌。以 pEASY-GFP 空载为阳性对照， 将阳性对照及融合表达载体通过农杆菌介导瞬时转化洋葱表皮,培养 48 h 后制片 （武丹 等， 2017） ，在 BX51 显微镜下观察。 1.4 番茄 RNA 的提取和 SlMYB102 表达水平分析 利用 Trizol 法提取番茄嫩叶总 RNA，采用 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（ Thermo 公司，中国上海）完成反转录 cDNA 第一链的合成。 qRT-PCR 采用 TransStart Tip Green qPCR SuperMix（ DyeⅡ） （全式金生物技术有限公司，中国北京） ，参照说明书进行操作。引物（表 1）的合成及目的基因测序均由华大基因公司（中国青岛）完成。 表 1 目的基因及荧光定量基因引物序列 Table 1 Primer sequences of target genes for cloning and qRT-PCR 用途 Use 引物名称 Primer name 序列（ 5′– 3′） Sequence SlMYB102 的克隆 Amplification of SlMYB102 转基因验证 PCR confirmation of the OE lines 定量内参引物 qRT-PCR primers for inner reference SlMYB102 定量引物 qRT-PCR primers for SlMYB102 SlMYB102-F GGATCCATGGGTAGAGCTCCTTGT SlMYB102-R1TCGACTTACATAAATTCATTAGT 35S-F AGCACGACACACTTGTCT SlMYB102-R2GCACATGGCCTAACAATC Actin-F CTGGATTGGAGGCTCTATActin -R GCATCTCTGGTCCAGTAGG qRT-SlMYB102-F GCTGGGCTTCAAAGATGT qRT-SlMYB102-R CTACCAGGTAAACGTGCA 1.5 过表达载体的构建与遗传转化 在番茄基因组数据库（ https //）中获得 SlMYB102（ Solyc02G079280.2）的 CDS序列，利用 Primer5 软件设计引物 SlMYB102-F/R1（表 1） ，并分别加入酶切位点 BamHⅠ、 KpnⅠ。以‘ Micro-Tom’番茄嫩叶的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。 PCR 反应程序为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s， 56 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 70 s， 32 个循环； 72 ℃后延伸 10 min。 PCR 产物用 1.2琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带，连接到克隆载体 pEASY 进行测序。测序正确的质粒 pEASY SlMYB102 用 BamHⅠ、 KpnⅠ酶切后，连接到以相同酶酶切的表达载体 pBI121 上，得到pBI121-SlMYB102 过表达载体，将其转化农杆菌。 将番茄野生型的种子置于超净工作台上用 75乙醇消毒 2 min， 4次氯酸钠消毒 15 min，灭菌水冲洗 3 4 次，将种子播在组培瓶中，暗培养至子叶长出后移至光下，培养条件为昼夜温度 28 ℃ / 18 ℃，光照 16 h，待子叶展开时用于目的基因的转化。参照付超等（ 2013）建立的番茄遗传再生体系并略有改动，经过共培养、筛选培养、生根培养等过程获得卡那霉素抗性植株。结合抗生素筛选、 PCR 和 qRT-PCR 检测目的基因的表达水平，鉴定过表达株系。 Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1526 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 8 1523– 1534. 图 1 SlMYB102 的扩增 Fig. 1 The amplification of SlMYB102 gene 1.6 转基因番茄叶片显微结构分析与生长指标测定 参照 DIC 显微分析方法 （ Han et al.， 2018） 并略有改动。 选取野生型及转基因株系 （ OE-1、 OE-2）完全展开的功能叶，用尖头镊子取叶表皮，将样品用 14冰醋酸和 84乙醇的混合液浸泡过夜，脱色， 然后用 75乙醇浸泡， 待脱色完全后用三氯水合乙醛溶液 （水合三氯乙醛 200 g， 甘油 15.84 mL，蒸馏水 50 mL）浸泡 30 min，用纯水清洗后制片，在微分干涉显微镜（ DIC）模式下观察叶片细胞并拍照。每个样品随机选取 3 处视野拍照，使用 Image J 软件统计细胞面积。将野生型及转基因纯和株系的种子置于超净工作台上用 75乙醇消毒 2 min， 4的次氯酸钠消毒 15 min，最后用灭菌水冲洗 3 4 次，用高温灭菌镊子将种子播在只含 MS 的播种板中。每个播种板中播种 30 粒种子，在28 ℃下暗培养。分别在播种 0、 40、 45、 50、 60 h 统计种子萌发情况（种子露白即认为已萌发） 。分别统计 6 周龄的株高和第 3 片真叶叶面积以及地上部、地下部的鲜样质量。 上述每个试验至少重复 3 次。使用 DPS 软件进行显著性分析。 2 结果与分析 2.1 SlMYB102 的克隆及同源性分析 从野生型番茄叶片 cDNA 中利用引物SlMYB102-F 和 SlMYB102-R1克隆 SlMYB102 的编码区， 扩增得到长度为 1 089 bp 的片段 （图 1） 。测序结果与目的序列完全一致。 对 SlMYB102 的基因结构进行分析。结果显示， SlMYB102 包含 3 个外显子， 2 个内含子（图2） 。 图 2 番茄 SlMYB102 的结构 Fig. 2 Gene structure of SlMYB102 通过氨基酸序列比对发现， SlMYB102 与 AtMYB102 的相似度为 57.14，具有 2 个保守 MYB结构域（图 3） 。 将番茄 SlMYB102 蛋白序列与其在番茄、水稻、拟南芥、棉花、马铃薯、柑橘等 6 个物种的同源蛋白进行序列分析并构建进化树。可见 SlMYB102 与马铃薯 StMYB34 同源性最高（图 4） 。 张 旭，陈丽琛，任仲海 . 番茄过表达 SlMYB102 对种子萌发及生长的影响 . 园艺学报， 2018， 45 8 1523– 1534. 1527 图 3 番茄 SlMYB102 及拟南芥 AtMYB102 的氨基酸序列比对 Fig. 3 Amino acid sequence alignment of SlMYB102 and AtMYB102 图 4 SlMYB102 及其同源蛋白进化树分析 Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of SlMYB102 in tomato and its homologies 2.2 SlMYB102 表达模式分析 将 GFP 和 SlMYB102-GFP 瞬时转化洋葱表皮，在 MS 培养基上培养 48 h，清水洗净后制片。通过 BX51 显微镜观察发现， SlMYB102-GFP 融合蛋白特异定位于细胞核内，而对照中 GFP 蛋白的荧光信号在细胞膜和细胞核上都存在，说明 SlMYB102 是一个核蛋白（图 5） 。 Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1528 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 8 1523– 1534. 图 5 SlMYB102 转录因子的亚细胞定位 Fig. 5 Subcellular localization of SlMYB102 transcription factor 采用 qRT-PCR 分析 SlMYB102 在‘ Micro-Tom’根、茎、叶、花、果中的表达情况，其在被检测的各组织中均有表达，在茎和花中的表达量较高（图 6） 。 图 6 SlMYB102 的组织表达特异性 Fig. 6 Tissue-specific expression profiles of SlMYB102 P 0.05. 2.3 过表达纯合株系的鉴定 利用农杆菌介导的番茄遗传转化获得 10 株再生植株。提取其 DNA，利用引物 35S-F、SlMYB102-R2进行 PCR 验证，结果显示，共有 6 株扩增出长度均为 894 bp 条带，与目的条带大小一致，即获得 6 株 T1代转基因植株（图 7， A） 。 为了防止植物组织培养过程对转基因植株的影响以及可能发生转基因不稳定遗传的现象，利用转基因株系 OE-1（图 7， B）和 OE-2（图 7， C）的 T3代纯合株系用验证引物（ 35S-F、 SlMYB102-R2）进行 PCR 验证，扩增出的条带长度均为 894 bp，与目的条带大小一致，并且后代不发生分离，表明成功获得转基因纯和株系。 为了进一步确定目的基因的表达水平，通过 qRT-PCR 分析 SlMYB102 在转基因纯和株系 OE-1、OE-2 的表达情况，发现其表达量均显著高于野生型，且在 OE-2 中最高（图 8） 。 张 旭，陈丽琛，任仲海 . 番茄过表达 SlMYB102 对种子萌发及生长的影响 . 园艺学报， 2018， 45 8 1523– 1534. 1529 图 7 转基因验证 M Marker（ DL2501） ； N阴性对照； P阳性对照； OE-1、 OE-2过表达 SlMYB102 的不同转基因株系； 1– 8 OE-1 的 T3代转基因植株； 9– 16 OE-2 的 T3代转基因植株。 Fig. 7 PCR confirmation of the OE lines M Marker（ DL2501） ； N Negative control； P Positive control； OE-1， OE-2 The overexpression lines of SlMYB102； 1– 8 The T3 transgenic plants of OE-1； 9– 16 The T3 transgenic plants of OE-2. 2.4 过表达 SlMYB102 提高了种子萌发率 分别将 OE-1、 OE-2 和野生型的种子播种在 MS 培养板上。播种后 40 h 转基因株系和野生型株系萌发情况见图 9，图 10。播种后 40、 45 和 50 h，过表达株系萌发率都高于野生型，且在播种后50 h 全部萌发；而 野生型 种子在播种后 60 h 才全部萌发，说明过表达 SlMYB102 提高了番茄种子萌发速率。 图 8 转基因植株（ OE-1 和 OE-2）表达量检测 Fig. 8 qRT-PCR confirmation of the OE lines P 0.05. 图 9 SlMYB102 过表达株系与野生型种子萌发率比较 Fig. 9 Seed germination rate of the wild type and SlMYB102 overexpression lines P 0.05. Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1530 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 8 1523– 1534. 图 10 转基因株系与野生型种子播种 40 h 萌发情况 Fig. 10 Seed germination of the wild type and SlMYB102 overexpression lines 2.5 过表达 SlMYB102 对植株生长的影响 在正常条件下观察了过表达 SlMYB102 在 6 周龄时对植株生长的影响。与野生型相比，转基因株系的株高显著降低， OE-1、 OE-2 的株高分别下降了 16.45、 21.01；同时，转基因株系的叶面积也显著低于野生型，分别下降了 38.35、 44.21（图 11） 。 图 11 SlMYB102 过表达株系与野生型株高及叶面积比较 Fig. 11 Height and leaf area of the SlMYB102 OE lines and wild type P 0.05. 与野生型相比，转基因株系 OE-1、 OE-2 地上部及地下部的鲜质量也显著降低，地上部鲜质量分别下降了 19.59、 23.65，地下部鲜质量分别下降了 26.78、 32.72（图 12） 。 张 旭，陈丽琛，任仲海 . 番茄过表达 SlMYB102 对种子萌发及生长的影响 . 园艺学报， 2018， 45 8 1523– 1534. 1531 图 12 SlMYB102 过表达株系（ OE-1 和 OE-2）与野生型地上部及地下部鲜质量比较 Fig. 12 Shoot and root fresh weight of the SlMYB102 OE lines and wild type P 0.05. 2.6 叶片亚细胞结构分析 与野生型相比， OE-1、 OE-2 的叶片细胞面积基本没有变化（图 13） 。所以推测在番茄中过表达SlMYB102 是通过减少细胞分裂来负调控植株的生长。 图 13 SlMYB102 过表达株系与野生型叶片细胞大小显微分析 Fig. 13 Leaf cell size analysis of SlMYB102 OE lines and wild type P 0.05. 3 讨论 植物基因的组织表达特性与其功能往往是相联系的。 例如， 拟南芥中 AtMYB117/AtLOF1 在节点、花梗中特异表达， 可以调控横向器官的分离及腋生分生组织形成 （ Lee et al.， 2009） ； 大豆中 Cry1Ac/Ab在根、茎、叶、籽粒中均有表达，且在叶片中的表达量最高，与过表达 Cry1Ac/Ab 增加大豆对食叶Zhang Xu， Chen Lichen， Ren Zhonghai. Effects of overexpression of SlMYB102 on the tomato seed germination and growth. 1532 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 8 1523– 1534. 性害虫的表型相一致（钱雪艳 等， 2016） 。本研究中发现番茄 SlMYB102 在各组织中均有表达，且在茎中表达量相对较高，与过表达 SlMYB102 抑制植株生长的表型一致。 前人对 R2R3-MYB 转录因子调控植物生长的研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物，对番茄植株生长的报道较少。通过氨基酸序列比对发现， SlMYB102 与 AtMYB102、 AtMYB41 具有较高的同源性，说明 SlMYB102 可能具有与拟南芥 AtMYB102、 AtMYB41 类似的功能。拟南芥中过表达AtMYB102 可以响应受伤及氧化胁迫，并且提高植株对虫害的抗性（ Denekamp Smeekens， 2003；de Vos et al.， 2014） ；拟南芥中过表达 AtMYB41 可以使细胞面积变小导致植株矮小、叶面积变小等表型（ Cominelli et al.， 2008） 。本研究中发现在番茄中过表达 SlMYB102 可以使植株变矮、叶面积变小，但叶片细胞面积无显著变化，因此推测过表达 SlMYB102 导致的叶面积和植株变小与其调控细胞分裂有密切关系。所以， SlMYB102 负调控番茄生长与 AtMYB41 负调控拟南芥生长可能是通过不同的作用机制实现的。 早期研究表明有些基因导致的植株矮小伴随着对干旱和盐胁迫抗性的提高。如在水稻中突变OsDSS1 以及在短柄草中沉默 BdBRI1 都会出现植株矮小， 同时显著提高了植株的抗旱性 （ Feng et al.，2015； Tamiruet al.， 2015） 。而在拟南芥中过表达 AtMYB41 以及在番茄中过表达 SlIPT3、 SlDREB2也观察到植株矮小和抗盐性提高的表型（ Cominelli et al.， 2008； Hoang et al.， 2012； Hichriet al.，2015； Žižkovet al.， 2015） 。本研究中发现番茄中过表达 SlMYB102 可以使植株矮小、叶面积减小，但 SlMYB102 具体是否参与对抗性的调控仍需进一步研究。未来将进行抗性试验，进一步研究SlMYB102 的生物学功能，为探究 R2R3-MYB 调节植物生长发育及抗性提供理论基础。 References Adato A， Mandel T， OronS M， Venger I， Levy D， Yativ M， Domınguez E， Wang Z H， Vos R C H D， Jetter R， Schreiber L， Heredia A，Rogachev I， Aharoni A. 2009. 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