芹菜NAC转录因子基因AgNAC1的克隆及其对非生物胁迫的响应.pdf

园艺学报， 2018， 45 6 1125– 1135. Acta Horticulturae Sinica doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0071； http //www. ahs. ac. cn 1125 收稿日期 2018– 03– 13； 修回日期 2018– 06– 04 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31272175） ；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（ NCET-11-0670） ；江苏省自然科学基金杰出青年基金项目（ BK20130027） ；江苏高校优势学科建设项目（ PAPD） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail ） 芹菜 NAC 转录因子基因 AgNAC1 的克隆及其对非生物胁迫的响应 段奥其，冯 凯，刘洁霞，徐志胜，熊爱生*（南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，南京 210095） 摘 要 通过 RT-PCR 方法，从芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’中分别克隆获得编码 NAC 转录因子的基因 AgNAC1。利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等，采用荧光定量 PCR 技术检测基因在不同非生物胁迫下的表达水平。结果表明 ‘六合黄心芹’和‘文图拉’ AgNAC1 开放阅读框长度均为 957 bp，编码 318 个氨基酸，其蛋白质相对分子量分别为 36.89和 36.77 kD，理论等电点分别为 5.94 和 5.78。 AgNAC1 蛋白与不同植物中 NAC 家族成员同源性比对和进化树分析表明，其与胡萝卜 DcNAC 属于同一个分支，进化距离最近。蛋白功能域预测显示， AgNAC1有多个 α 螺旋和 β 转角二级结构单元。荧光定量 PCR 结果表明， AgNAC1 在芹菜叶中表达量最高，具有组织特异性，同时对高温、低温、干旱和盐胁迫均有响应。 ‘六合黄心芹’中 AgNAC1 的表达水平在高温处理 24 h 达到最高。 ‘文图拉’中 AgNAC1 的表达水平在高温、低温及盐处理后 2 h 和 8 h 高于对照，呈现先下降后上升的趋势，在干旱处理 4 h 时表达水平最高。 关键词 芹菜； NAC 转录因子；表达分析；叶；非生物胁迫 中图分类号 S 636.3 文献标志码 A 文章编号 0513-353X（ 2018） 06-1125-11 Cloning and Response to Abiotic Stress of NAC Transcription Gene AgNAC1 in Apium graveolens DUAN Aoqi， FENG Kai， LIU Jiexia， XU Zhisheng， and XIONG Aisheng*（ State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China） Abstract An AgNAC1 gene encoding NAC transcription factor was cloned from Apium graveolens‘ Liuhe Huangxinqin’ and‘ Ventura’ by RT-PCR ， respectively. The amino acid sequences， protein physicochemical properties， phylogenetic relationships and spatial structures of AgNAC1 were analyzed. The relative expression levels of AgNAC1 under different abiotic stresses were detected by quantitative real-time PCR. The results showed that the lengths of open reading frame of AgNAC1 genes in‘ Liuhe Huangxinqin’ and‘ Ventura’ were both 957 bp and encoded 318 amino acids. The relative molecular masses Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1126 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1125– 1135. of AgNAC1 were 36.89 and 36.77 kD， with theoretical pI about 5.94 and 5.78， respectively. The homologous alignment and phylogenetic analysis of AgNAC1 with other NAC TFs in different plants revealed that AgNAC1 and DcNAC of Daucus carota belong to the same branch of evolutionary distance. AgNAC1 had the closest genetic relation with DcNAC. The prediction of protein functional domain showed that AgNAC1 protein contains multiple α-helix and β-turn secondary structure units. Quantitative real-time PCR analysis indicated that the AgNAC1 was tissue-specific in celery， and it mainly expressed in leaf. In addition， AgNAC1 responded to heat， cold， drought and salt stresses. The expression levels of AgNAC1 in‘ Liuhe Huangxinqin’ peaked at 24 h under high temperature treatment. The expression levels of AgNAC1 in‘ Ventura’ were higher than that of the control at 2 h and 8 h under high temperature treatment， low temperature and salt treatments， showing a trend of first decrease and then increase. The expression level of AgNAC1 was the highest at 4 h under drought treatment. Keywords Apium graveolens； NAC transcription factor； expression analysis； leaf； abiotic stress 非生物胁迫因素影响植物生长发育，如干旱、盐胁迫等都会使植物细胞受损，进而使产量降低，品质下降（孙利军 等， 2012） 。研究发现， NAC 转录因子家族成员参与植物对非生物胁迫的响应，能直接或间接调控一些应答基因在低温、干旱、高盐胁迫下的表达，在增强植物抗寒、抗旱、抗盐碱、耐热方面有重要作用（ Olsen et al.， 2004；孙利军 等， 2012；王瑞芳 等， 2014） 。 NAC 转录因子还参与植物生长发育的调控，包括细胞次生壁的产生、茎尖分生组织、花器官、侧枝和侧根的形成、胚的生长代谢及形态建成以及植物激素的控制和防御（ Olsen et al.， 2004， 2005； Delessert et al.，2005； Kubo et al.， 2005； Guo Gan， 2006） 。例如，转基因技术验证了苹果愈伤组织中超表达的MdNAC029 能够促进花青苷积累（安建平 等， 2018） 。研究证实 NAC1 转录因子参与植物对非生物胁迫逆境的响应（ Wang et al.， 2018） 。 自从首次从矮牵牛（ Petunia hybrida）中分离出了 NAC（取基因 NAM、 ATAF1/2、 CUC2 第一个字母命名）转录因子后，水稻（ Oryza sativa） 、拟南芥（ Arabidopsis thaliana） 、大 豆（ Glycine max） 、小麦（ Triticum aestivum Linn）等植物中的 NAC 转录因子也接连被发现（ Souer et al.， 1998； Rhoades et al.， 2002； Hu et al.， 2008） 。 NAC1 不但能够调控植物的生长发育，而且也能增强植物在逆境胁迫下的防御和耐受能力（申玉华 等， 2015） 。水稻 NAC 转录因子家族中第Ⅲ亚类含有与逆境相关的成员，受非生物胁迫诱导表达（方玉洁， 2013） 。小麦 NAC 转录因子基因 TaNAC47 和 TaNAC62均能增强转基因拟南芥的耐盐、耐旱及耐冻的能力（张丽娜， 2014） 。 芹菜（ Apium graveolens）是伞形科（ Apiaceae）芹属重要的叶菜类蔬菜作物，具有较强的抗寒性，相对不耐高温，在中国南北地区广泛种植，基本实现周年生产（方智远， 2011； Li et al.， 2018） 。本试验中以‘六合黄心芹’和‘文图拉’芹菜为材料，克隆出芹菜 NAC 转录因子基因 AgNAC1，对其进行了生物信息学分析，检测和分析其在不同非生物胁迫下的响应，为进一步研究芹菜对非生物胁迫的响应机制提供基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 ‘六合黄心芹’ （ A. graveolens‘ Liuhe Huangxinqin’ ）是南京市六合区的地方优良品种，叶心黄，段奥其，冯 凯，刘洁霞，徐志胜，熊爱生 . 芹菜 NAC 转录因子基因 AgNAC1 的克隆及其对非生物胁迫的响应 . 园艺学报， 2018， 45 6 1125– 1135. 1127 口味清香，生长速度快。 ‘文图拉’ （ A. graveolens‘ Ventura’ ）原产美国，品质脆嫩，耐寒耐热，生长势强，春季栽培不易先期抽薹。芹菜种子均保存于南京农业大学伞形科蔬菜作物遗传与种质创新实验室。 以芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’为试材， 2017 年 2 月 3 日将种子播种于人工气候生长室中，各 100 株，待 3 月龄时，进行不同逆境条件处理分别置于 4 ℃和 38 ℃生长室进行低温和高温处理，分别用 200 g L-1的 PEG6000 溶液和 200 mmol L-1NaCl 溶液浇灌进行干旱和盐胁迫处理，设置 ddH2O 处理作为对照（田畅 等， 2014） 。分别在处理 1、 2、 4、 8 和 24 h 时，取植株顶部第 3 4片叶，同时取对照组的叶片、叶柄的 1/2 处上、下 2 cm 左右及根，立即用液氮速冻后保存于– 80 ℃冰箱。每个处理设置 3 次生物学重复。 1.2 AgNAC1 的克隆 利用 RNA 提取试剂盒（ RNA simple total RNA Kit，北京 Tiangen 公司）提取芹菜总 RNA，利用反转录试剂盒 （ Prime Script RT Reagent Kit， 大连 TaKaRa 公司） 将提取的总 RNA 反转录成 cDNA。 基于本课题组芹菜转录组数据库（ Jia et al.， 2015） ，检索获得芹菜 AgNAC1 基因。根据基因序列设计 AgNAC1 的正向引物 5′-ATGAAGAACAGCGGCAGTGAGA-3′，反向引物 5′-CTAAAAGGGC TTTTGTGTGAAC-3′。 PCR 扩增采用 20 μL 体系 10 μL PrimeSTAR Max Premix（大连 TaKaRa 公司） ，7 μL ddH2O， 1 μL cDNA 模板，上、下游引物各 1 μL。反应条件为 94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 30 s， 54 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 1 min， 35 个循环； 72 ℃延伸 10 min。委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。 1.3 AgNAC1 的序列分析 利用 BioXM 2.6 获得 AgNAC1 核苷酸及编码的氨基酸序列；利用 NCBI 数据库 BLAST 工具，获得不同物种相关基因及氨基酸序列；用 Prot-Param 软件对蛋白质相对分子质量、氨基酸构成成分和理论等电点等进行分析；利用 Prot Scale 软件获得蛋白质亲疏水性图、用 DNAMAN 6.0 软件获得多序列结构域比对图；利用 NCBI 网站上 BLAST 进行同源性分析；利用 MEGA 5.2 软件构建蛋白系统进化树；利用 NCBI CDD 数据库对芹菜转录因子进行保守域预测；利用 SignalP 软件进行信号肽分析预测；利用 SOPMA 软件对芹菜 AgNAC1 转录因子蛋白进行二级结构预测及分析；利用Swiss-Model 通过同源建模建立三级模型。 1.4 AgNAC1 的表达分析 使用 Real-Time PCR 检测系统（ Bio-rad， CFX96， USA）在 96 孔板中进行实时定量 PCR 反应。选用芹菜 Actin 作内参基因（ Jia et al.， 2015） ，正向引物 5′-AGAAGTCCTGTTCCAGCCGTCTT-3′，反向引物 5′-CGAACCACCACTGAGCACTATGTT-3′。根据扩增的 AgNAC1 序列设计表达检测引物，正向引物 5′-TTCATCCGACAGACGAGGAGTTAGT-3′ ，反向引物 5′-TCACCATACAGAGCCA TTTCAGGAAG-3′。实时定量 PCR 使用 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（大连 TaKaRa 公司） ，按操作说明书进行。采用 20 μL 体系，每个 PCR 反应体系中包含 2.0 μL cDNA， 0.4 μL 正反向荧光定量引物， 10 μL SYBR Green I mix 和 7.2 μL ddH2O。使用 Microsoft Excel 软件进行不同组织内表达水平的分析。通过公式 2-ΔΔCt转换为相对转录值（ Pfaffl， 2001； Li et al.， 2016） 。 Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1128 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1125– 1135. 2 结果与分析 2.1 AgNAC1 的克隆与序列分析 分别以芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’的 cDNA 为模板， PCR 扩增得到 2 个 1 000 bp 左右的目的片段，片段大小与预期一致。测序结果表明‘六合黄心芹’和‘文图拉’中的 AgNAC1 均含有1 个 957 bp 的开放阅读框（ ORF） ，编码 318 个氨基酸（图 1） 。 图 1 ‘ 六合黄心芹 ’ AgNAC1 核苷酸及编码的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide and amino sequences of AgNAC1 gene from A. graveolens‘ Liuhe Huangxinqin’ ‘六合黄心芹’和‘文图拉’的核苷酸差异表现在 4 个碱基位点，分别为第 133 位 A/G（ ‘六合黄心芹’ /‘文图拉’ ，下同） ，第 354 位 G/A，第 361 位 A/G 和第 579 位 G/A。 保守域预测得出转录因子在 11 134 氨基酸位点含有 NAC 家族典型的 NAM 保守结构域， 表明得到的转录因子 AgNAC1 属于 NAC 家族（图 2） 。 图 2 芹菜 AgNAC1 保守域预测 Fig. 2 Prediction of the conserved domain of AgNAC1 from celery 段奥其，冯 凯，刘洁霞，徐志胜，熊爱生 . 芹菜 NAC 转录因子基因 AgNAC1 的克隆及其对非生物胁迫的响应 . 园艺学报， 2018， 45 6 1125– 1135. 1129 2.2 AgNAC1 与其他植物 NAC 蛋白的多重比对与系统进化分析 利用 DNAMAN 6.0 软件进行 AgNAC1 与胡萝卜（ XP_017243840.1） 、可可（ EOX92686.1） 、榴莲（ XP_022740811.1） 、芝麻（ XP_011099683.1） 、柿子（ AJF38901.1） 、洋蓟（ KVH92730.1） 、海榄雌（ ABS80935.1） 、菠菜（ XP_021863783.1） 、向日葵（ XP_022025321.1） 、番薯（ ACT55332.1） 、橡胶树（ XP_021649171.1） 、毛葡萄（ ALM02085.1） 、辣椒（ PHU19421.1） 、黄花蒿（ AQU15092.1） 、蓖麻（ EEF39462.1） 、绿豆（ XP_014509424.1） 、番木瓜（ XP_021900375.1） 、紫苜蓿（ AGJ76628.1） 、大豆（ AGO14650.1） 、拟南芥（ NP_172690.1）的 NAC 蛋白进行序列比对（图 3） ，并绘制系统进化树。结果表明 AgNAC1 与伞形科胡萝卜 DcNAC 同属于一个分支，与海榄雌科的海榄雌进化距离较近，其次是十字花科的拟南芥（图 4） 。 图 3 芹菜与其他植物 NAC 氨基酸序列的多重比对 Fig. 3 The alignment of amino acid sequences of NAC from celery and other plants Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1130 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1125– 1135. 图 4 芹菜 AgNAC1 与其他植物 NAC 类蛋白系统构象树 Fig. 4 The phylogenetic tree of AgNAC1 of celery and some other NAC proteins 2.3 AgNAC1 转录因子氨基酸组分及理化性质分析 对芹菜‘六合黄心芹’和‘文图拉’两个品种的 AgNAC1 转录因子进行蛋白序列和理化性质分析，两者相似度较高。对 AgNAC1 转录因子蛋白与不同植物 NAC 类转录因子进行氨基酸组成成分及理化性质分析。 结果显示， 两个芹菜品种 AgNAC1 的蛋白质相对分子量分别为 36.89 和 36.77 kD，理论等电点分别为 5.94 和 5.78。两个品种和 20 种植物 NAC 蛋白氨基酸数在 274 395 之间，酸性氨基酸比例大于碱性氨基酸，表现为酸性蛋白。 ‘六合黄心芹’中芳香族氨基酸比例总体大于脂肪族氨基酸比例， ‘文图拉’中脂肪族氨基酸比例大于芳香族氨基酸比例（表 1） 。 ‘六合黄心芹’和‘文图拉’ AgNAC1 蛋白由 20 种氨基酸组成，其中，丝氨酸（ Ser）含量最高，为 8.8，半胱氨酸（ Cys）含量最低， 为 1.3； 脂肪系数分别为 50.03 和 49.72； 不稳定系数 （ instability index） 为 52.50 和 52.32；亲水性平均系数（ GRAVY）分别为– 0.853 和– 0.841，表现为较强的亲水性（图 5） 。 图 5 ‘ 六合黄心芹 ’ （ A） 和 ‘ 文图拉 ’ （ B） AgNAC1 氨基酸序列亲水性 /疏水性分析 Fig. 5 Predicted hydrophobicity and hydrophilicity of deduced amino acid sequence of AgNAC1 from ‘ Liuhe Huangxinqin’（ A） and‘ Ventura’（ B） celeries 段奥其，冯 凯，刘洁霞，徐志胜，熊爱生 . 芹菜 NAC 转录因子基因 AgNAC1 的克隆及其对非生物胁迫的响应 . 园艺学报， 2018， 45 6 1125– 1135. 1131 表 1 不同植物来源的 NAC 蛋白氨基酸组成成分及理化性质分析 Table 1 The comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid sequences of NAC protein from different plant species 来源植物 Source plant 登录号 GenBank accession 氨基酸数 No. of amino acid分子量 / kD Molecular mass pI 比例 / Ratio 碱性氨基酸Basic aminoacid 酸性氨 基酸 Acid amino acid 脂肪族 氨基酸 Aliphatic amino acid 芳香族 氨基酸 Aromatics amino acid 芹菜 Apium 六合黄心芹 Liuhe Huangxinqin 318 36.89 5.94 14 25 12 13 文图拉 Ventura 318 36.77 5.78 14 25 27 10 胡萝卜 Daucus sativus XP_017243840.1 315 36.52 6.03 14 24 14 13 可可 Theobroma cacao EOX92686.1 294 33.64 6.01 13 23 16 12 榴莲 Durio zibethinus XP_022740811.1 296 33.93 6.60 14 24 15 11 芝麻 Sesamum indicum XP_011099683.1 293 33.90 5.80 15 24 16 12 柿子 Diospyros kaki AJF38901.1 293 33.50 6.27 15 20 14 13 洋蓟 Cynara scolymus KVH92730.1 284 32.78 6.31 16 21 16 12 海榄雌 Avicennia marina ABS80935.1 303 34.50 5.70 14 21 16 12 菠菜 Spinacia oleracea XP_021863783.1 299 34.33 7.81 15 21 15 12 向日葵 Helianthus annuus XP_022025321.1 274 31.60 6.59 16 22 15 12 番薯 Ipomoea batatas ACT55332.1 280 32.39 7.04 15 23 16 13 毛葡萄 Vitis quinquangularis ALM02085.1 292 33.17 8.31 14 21 15 12 橡胶 Hevea brasiliensis XP_021649171.1 278 31.71 8.18 15 20 15 12 辣椒 Capsicum chinense PHU19421.1 286 32.92 8.16 16 21 17 11 黄花蒿 Artemisi annua AQU15092.1 284 32.81 6.36 15 22 15 12 蓖麻 Ricinus communis EEF39462.1 298 33.88 5.79 15 23 17 11 绿豆 Vigna radiata XP_014509424.1 293 33.73 6.03 15 24 15 12 番木瓜 Carica papaya XP_021900375.1 274 31.44 6.83 16 22 18 11 紫苜蓿 Medicago sativa AGJ76628.1 285 32.72 8.23 16 21 16 12 大豆 Glycine max AGO14650.1 292 33.19 6.04 14 21 16 11 拟南芥 Arabidopsis thaliana NP_172690.1 395 45.84 5.83 15 29 15 10 2.4 芹菜 AgNAC1 转录因子二级和三级结构预测与分析 以‘六合黄心芹’为例用 SOPMA 软件和 SignalP 进行分析， AgNAC1 转录因子是由 27.67的α 螺旋（ Alpha helix） ， 15.72的延伸主链（ Extended strand） ， 9.12的 β 转角（ Beta turn）和 47.48的无规则卷曲（ Random coil）构成。总体上看， AgNAC1 转录因子蛋白主要的二级结构是 α 螺旋和无规则卷曲。此外，通过对‘六合黄心芹’ AgNAC1 转录因子序列信号肽的分析发现，该蛋白序列不存在信号肽。利用 Swiss-Model 软件预测 AgNAC1 蛋白的三级结构，以水稻 OsNAC1 转录因子的A 链（ PDB ID 3ULX）为模板对‘六合黄心芹’和‘文图拉’ AgNAC1 蛋白进行同源构建， AgNAC1与模板的一致性均大于 70，存在多个二级结构单元。三级结构均含有 11 个 β 折叠，但 α 螺旋数量不同， ‘六合黄心芹’含有 3 个 α 螺旋， ‘文图拉’含有 2 个 α 螺旋。 2.5 AgNAC1 在芹菜不同组织的表达分析 通过实时定量 PCR 检测 AgNAC1 在芹菜根、叶柄、叶片中的相对表达水平。结果（图 6）表明，AgNAC1 在两个品种的根、 叶柄、 叶片中均有表达， 在叶片中的表达量最高， 在叶柄中最低； AgNAC1在‘六合黄心芹’叶片中的表达量分别为叶柄和根中的 57.29 和 3.68 倍； AgNAC1 在‘文图拉’叶片中的表达量为叶柄的 14.43 倍，与根中的无显著差异。 Duan Aoqi， Feng Kai， Liu Jiexia， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and response to abiotic stress of NAC transcription gene AgNAC1 in Apium graveolens. 1132 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 6 1125– 1135. 图 6 AgNAC1 在芹菜不同组织部位的表达情况 不同字母在 0.05 水平上有显著差异。 Fig. 6 Expression analysis of AgNAC1 in different tissues of celery Different letters indicate significant difference at 0.05 level. 2.6 AgNAC1 对不同非生物胁迫的响应 由图 7 可见，高温、低温、干旱及盐胁迫处理下 AgNAC1 表达水平具有差异。 图 7 AgNAC1 在芹菜不同非生物逆境下的表达 Fig. 7 Expression analysis of AgNAC1 in celery under different treatments 38 ℃高温、 4 ℃低温、盐处理（ NaCl）条件下‘六合黄心芹’中 AgNAC1 表达量在处理后 4 h和 8 h 比对照显著降低， 38 ℃高温处理至 24 h 时达到对照的 13.64 倍； 38 ℃高温条件下， ‘文图拉’中 AgNAC1 表达量在处理后 1 h 显著增加， 2 h 时表达量最高，是对照的 2.23 倍， 4 h 时显著减少。段奥其，冯 凯，刘洁霞，徐志胜，熊爱生 . 芹菜 NAC 转录因子基因 AgNAC1 的克隆及其对非生物胁迫的响应 . 园艺学报， 2018， 45 6 1125– 1135. 1133 4 ℃低温条件下， ‘六合黄心芹’中 AgNAC1 表达量在处理后 24 h 表达量与对照无差异； ‘文图拉’中 AgNAC1 表达量在处理后 2 h 显著增加，表达量均高于对照，尤其在处理 8 h 后达到对照的 7.96倍。干旱（ PEG6000）条件下， ‘六合黄心芹’中 AgNAC1 表达量在处理 8 h 时达到最高，是对照的1.17 倍； ‘文图拉’中 AgNAC1 表达量在处理后 4 h 显著增加，是对照的 10.19 倍。盐（ NaCl）胁迫条件下‘六合黄心芹’中 AgNAC1 表达量在处理后 4 h 和 8 h 比对照显著降低，在其他处理时间差异不显著； ‘文图拉’ 中 AgNAC1 表达量在处理后 2 h 和 8 h 差异显著， 分别是对照的 15.03 倍和 16.88倍。 3 讨论 试验中选用地域来源不同的两个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为材料，从中克隆得到与非生物胁迫相关的转录因子基因 AgNAC1。 ‘六合黄心芹’和‘文图拉’ AgNAC1 蛋白序列一致性较高，在 11 134 氨基酸位点均含有 1 个 NAC 家族典型的 NAM 保守结构域，这表明该转录因子属于 NAC 家族（ Olsen et al.， 2005） 。多 数 NAC 转录因子的 NAM 保守结构域具有核定位序列（ Paul et al.， 2012） 。通过 ProtComp 软件预测 表明 芹菜 NAC 转录因子也定位于细胞核中， AgNAC1 蛋白是核蛋白。跨膜结构分析的结果显示 AgNAC1 蛋白序列不存在信号肽，说明不是膜结合蛋白。进化树分析显示 AgNAC1 转录因子与同属伞形科的胡萝卜亲缘关系最近，而同属菊科的向日葵、洋蓟和黄花蒿进化关系较远， 这可能与前期的品种驯化和栽培地的气候条件差异相关 （ Soltis Soltis， 2004；李岩 等， 2015） 。 NAC 转录因子是高等植物特有的功能性转录因子， 在植物生长发育和抗逆调控过程中发挥重要作用（申玉华 等， 2015） 。非生物胁迫下的表达分析显示， AgNAC1 在 4 种逆境处理下均有响应。‘六合黄心芹’ AgNAC1 在高温胁迫 24 h 时表达最强，而对盐胁迫的响应相对不敏感，表达变化较慢。 ‘文图拉’ AgNAC1 对低温、干旱和盐胁迫的响应较敏感，在 4 ℃低温胁迫 4 h 后随时间推移呈现上升的趋势。不同品种中的 NAC 转录因子在逆境处理下表达量不同，说明 AgNAC1 对非生物胁迫的响应与品种特性相关。 实时定量 PCR 结果显示 AgNAC1 在芹菜叶片和根中的表达量明显高于叶柄，具有明显的组织特异性（蒋倩 等， 2012；冯凯 等， 2016；李静文 等， 2018） 。有研究表明 NAC转录因子基因在不同植物组织中表达差异显著，一些 NAC 基因的表达模式具有组织特异性，如在根和叶中优先表达（ Karanja et al.， 2017） 。其中拟南芥 AtNAC1 在根中表达水平最高，在叶片中表达水平较低（ Xie et al.， 2000；王国东 等， 2017） ；半定量 RT-PCR 组织表达谱分析表明， SlNAC1主要在番茄根、花和绿色的果实中表达（ Yang et al.， 2011） ； GmNAC20 参与大豆根的生长和发育过程（ Hao et al.， 2011） 。 NAC 转录因子在拟南芥和水稻两种模式植物中的研究较为成熟， 在其他作物中大多处于基因克隆分析层面上， NAC 转录因子在调控机制上的研究取得了一定的进展，但仍不完善。芹菜分子遗传研究较为缓慢，在分子水平上对芹菜 NAC 转录因子进行分析并进一步验证其功能具有深远的意义（ Olsen et al.， 2004；李小兰 等， 2013） 。 References An Jianping， Song Laiqing， Zhao Lingling， You Chunxiang， Wang Xiaofei， Hao Yujin. 2018. Overexpression of MdNAC029 promotes anthocyan