甘蓝自交不亲和性相关基因BoPLL的克隆、定位与表达分析.pdf

p园艺学报， 2018， 45 1 85– 96. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0389； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 85 收稿日期 2017– 08– 12； 修回日期 2017– 11– 08 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31572127） ；西南大学基本科研业务费专项资金项目（ XDJK2016E079） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ） nbsp;甘蓝自交不亲和性相关基因 BoPLL 的克隆、定位与表达分析 nbsp;罗绍兰1，蒲 nbsp;敏1，曾 nbsp;静1，施松梅2，廉小平2，王玉奎1，白晓璟1，张贺翠1，朱利泉1,*（1西南大学农学与生物科技学院，重庆 nbsp;400716；2西南大学园艺园林学院，重庆 nbsp;400716） nbsp;摘 nbsp;要 对高度自交不亲和甘蓝柱头进行自花授粉和异花授粉处理后，取柱头进行蛋白质表达谱的比较研究，获得一种受自花授粉诱导下调表达，异花授粉诱导上调表达的蛋白，命名为 BoPLL。进一步分析转录组数据发现， BoPLL 在自花授粉 0 30 min 上调表达， 30 60 min 下调表达，而在异花授粉 0 60 min 一直上调表达。克隆获得 cDNA 为 1 212 bp，编码含 403 个氨基酸残基的蛋白质 BoPLL。序列分析发现 BoPLL 含有高度保守的 PASTA 结构域和 CMM-10 结构域、中度保守的 PbH1 结构域、低度保守的 HYDRO 结构域，说明该蛋白是典型的 PLL 家族蛋白。染色体定位结果表明，该基因与自交不亲和性相关基因不连锁。进化分析表明，甘蓝 BoPLL 与拟南芥 AtPLL 亲缘关系最近，与苜蓿 MtPLL 亲缘关系较远。 RT-PCR 发现， BoPLL 在甘蓝花粉和柱头中表达，且柱头中的表达量明显低于花粉，在叶片、花蕾、萼片和花瓣中均没有检测到表达信号。 荧光定量 PCR 结果显示， BoPLL 在自花授粉和异花授粉 15 60 min的表达变化趋势与转录组分析结果基本一致。根据上述结果推测 BoPLL 可能是一种参与甘蓝自交不亲和反应过程的基因。 nbsp;关键词 甘蓝； BoPLL 基因；基因克隆；定位；表达分析 nbsp;中图分类号 S 635 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 01-0085-12 Molecular Cloning ， Location and Expression Analysis of BoPLL in Self-incompatibility Brasscia oleracea LUO Shaolan1， PU Min1， nbsp;ZENG Jing1， SHI Songmei2， nbsp;LIAN Xiaoping2， WANG Yukui1， BAI Xiaojing1，ZHANG Hecui1， and ZHU Liquan1,*（1College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400716， China；2College of Horticulture and Landscape Architecture， Southwest University， Chongqing 400716， China） nbsp;Abstract The stigmas were from collected self-pollination and cross-pollination of Brassica oleracea L. var. capitata L. and were used to analyze protein expression profiles. We obtained a protein that was down-regulation expression in self-pollination and up-regulation in cross-pollination treatments， which was named BoPLL. Moreover， transcriptomic analysis also showed BoPLL was up-regulated at 0– 30 min and down-regulated at 30– 60 min in self-pollination process， while it was up-regulated in cross-pollination Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 86 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 85– 96. process. The CDS of BoPLL was 1 212 bp in length， encoding 403 amino acids of BoPLL. Sequence analysis found BoPLL contained a high conserved PASTA domain and a CMM-10 domain， moderate conserved PbH1 domain， and a low conserved HYDRO domain， indicating it was a typical PLL protein. Chromosomal location displayed that BoPLL is not linked with S locus genes. Phylogenetic tree analysis showed that Brassica oleracea L. BoPLL was more close to Arabidopsis thaliana AtPLL rather than Medicago truncatula MtPLL. RT-PCR analysis found BoPLL was predominantly expressed in pollen and stigma， with lower expression level of BoPLL in pistil than pollen， and no expression in leaf， flower bud，sepal and petal. qRT-PCR analysis revealed that the mRNA in 1560 min expression patterns of BoPLL was similar with the RNAseq analysis. Based on those results， we speculated that BoPLL was involved in SI response in B. oleracea. Keywords Brassica oleracea； BoPLL； gene cloning； location； expression analysis 自交不亲和性（ self-incompatibility， SI）甘蓝柱头能特异性识别、排斥自花花粉，接受异花花粉。甘蓝 SI 涉及柱头和花粉相互识别引发的信号传导途径。甘蓝自交不亲和性的产生不仅与 S 位点基因编码蛋白有关 （ Goring et al.， 1993； Nasrallah et al.， 1994） ， 同时还受其他蛋白的调控， 如 ARC1、THL1/THL2、 MLPK 等（朱利泉和 周燕 ， 2015） ，这些蛋白的编码基因虽然不与 S 位点连锁，但对于自交不亲和至关重要，它们也是 SI 的功能分子。目前对于这些蛋白元件在自交不亲和反应中的功能研究较多，而通过影响花粉管生长进而调控自交不亲和的分子机制尚不清楚。花粉在柱头上萌发过程中，降解果胶质的酶具有水解花粉和柱头细胞壁，促进花粉在柱头上萌发的作用（ Suen et al.，2003； Jiang et al.， 2014a） ；在花粉管生长过程中，这些酶具有破坏花粉管细胞壁结构，促进花粉管伸长的作用（ Suen amp; Huang， 2007； Jiang et al.， 2014b） 。但是这些降解果胶质的酶是否在甘蓝 SI过程中发挥作用，相互间是否存在联系，都值得深入研究。 nbsp;本试验中通过对 SI 甘蓝柱头进行蛋白质表达谱的比较研究， 克隆得到 BoPLL（ Brassica oleracea Pectate Lyase Like）基因，进一步进行转录组数据分析、生物信息学分析、染色体定位和 QRT-PCR分析，旨在为深入研究 SI 信号传导途径提供新的内容。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料 nbsp; nbsp;甘蓝自交不亲和系‘ A4’和‘ F1’由西南大学十字花科研究所提供，种植在实验基地隔离网内。2016 年 3 月底至 4 月初，选取长势一致的‘ A4’花蕾，于开花当天人工去雄，用成熟的‘ A4’和‘ F1’花粉对‘ A4’进行自花和异花授粉处理。分别取未授粉柱头和自花、异花授粉 3 5、 15、 30和 60 min 的柱头，立刻放入液氮速冻保存。同时取叶片、花蕾、萼片、花瓣、花药和柱头于 – 80 ℃保存备用。 nbsp; nbsp; nbsp;1.2 nbsp;蛋白质双向电泳及质谱鉴定 nbsp; nbsp; 利用非线性 IPG 固相胶条 （ 17 cm， pH 3 10） 对甘蓝 ‘ A4’ 自花授粉和异花授粉 3 5 和 60 min后柱头总蛋白质进行双向电泳。采用 TCA/丙酮法提取柱头总蛋白质（ Zou et al.， 2009） ，参照陈松等（ 2013）方法分离蛋白质，银染后扫描。选取 3 张重复性较好的 2-DE 图像，利用 PDQuest 8.0 软罗绍兰，蒲 nbsp; 敏，曾 nbsp; 静，施松梅，廉小平，王玉奎，白晓璟，张贺翠，朱利泉 . 甘蓝自交不亲和性相关基因 BoPLL 的克隆、定位与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 1 85– 96. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 87 件（ Bio-Rad 公司）分析和筛选差异表达蛋白质点，根据 PDQuest 软件中 Quantity table report 值统计 3 个生物学重复图像的平均值，计算相对变化量。从 SDS-PAGE 胶上切下差异表达蛋白质点送北京华大基因公司进行质谱鉴定。 nbsp; 1.3 nbsp;SI 甘蓝自花、异花授粉后柱头转录组数据分析 nbsp;根据蛋白质谱结果，进一步采用授粉处理 60 min 之内的柱头进行转录组分析。分别将未授粉柱头和自花授粉后 15、 30 和 60 min；异花授粉后 15、 30 和 60 min 的柱头提取总 RNA，送北京百迈克公司用 HiSeq 2000进行转录组测序， 利用 Trinity软件对各样品数据进行 Unigenes组装， 通过 RPKM值（ Reads per kilo bases per million reads，每百万 reads 中来自于某基因每千碱基长度的 reads 数）来反映 Uigenes 表达丰度， 使用 IDEG6 软件进行差异表达基因的检测， 以 log2（不同时期 RPKM 比值）绝对值大于等于 1 为标准统计差异表达基因，通过 Blast 软件将差异表达 Unigenes 序列与 NR、 NT、GO、 COG、 KEGG、 SwissProt 和 TrEMBL 数据库比对，获得 Unigenes 注释信息，通过检索芸薹属数据库（网址 nbsp;http //brassica.nbi.ac.uk/BrassicaDB/blast_.html）找到其同源基因序列，并在差异表达基因中找到 BoPLL 基因 ， 分析其在自花、异花授粉 0、 15、 30 和 60 min 的表达量变化情况。 nbsp;1.4 nbsp;BoPLL 的克隆 nbsp; nbsp;根据蛋白质双向电泳和转录组测序获得的 cDNA 序列， 结合芸薹属数据库 （网址 http //brassica. nbi.ac.uk/BrassicaDB/blast_.html） ，用 Primer primer6.0 软件设计引物 BoPLL-F、 BoPLL-R（表1） 。分别以甘蓝叶片 gDNA 和自花授粉 30 min 柱头 cDNA 为模板，利用 PrimerSTAR Max DNA Polymerase（ TaKaRa，北京） 25 L 反应体系 PCR 扩增 BoPLL 的编码序列。反应程序 98 ℃预变性 2 min； 98 ℃ nbsp;10 s， 60 ℃ nbsp;15 s， 72 ℃延伸 55 s， 35 个循环； 72 ℃终延伸 5 min。 PCR 产物经 1 104 mg L-1琼脂糖凝胶电泳，胶回收后与 pEASY-Blunt 克隆载体（全式金，北京）连接，产物转化大肠杆菌 DH5α，经菌落 PCR 鉴定后挑取阳性克隆送北京华大基因公司进行测序。 nbsp;表 1 nbsp;基因克隆及其荧光定量 nbsp;PCR 分析所用引物 nbsp;Table 1 nbsp;Primers used for gene cloning and analysis of real-time PCR 用途 nbsp;Use 引物名称 nbsp;Primer name 引物序列 nbsp;Primer sequence（ 5′– 3′） nbsp;扩增 cDNA 全长 nbsp;For the full length cDNA BoPLL-F ATGACTTGCATTGCTTCTGC BoPLL-R TCAGTTCAGGCAATGCTGAG 荧光定量 PCR 引物 nbsp;Primers for real-time PCR RT-PCR-F CTTCTCATCGTGTCTTAAACACAT RT-PCR-R CGTTCCTTTCGGTACGTAGAT 扩增内参基因 nbsp;For the internal control Actin3-F GAGTAGAAAATGGCTGATGGTGAAG Actin3-R TCATCTTCTCACGGTTAGCCTTTG 1.5 nbsp;BoPLL 的染色体定位 nbsp;将 BoPLL 中保守性较高的序列区段作为探针，在甘蓝全基因组进行扫描，查找是否有 BoPLL的靶结合序列，以此来判定该基因在染色体上的位置。进一步在该基因两侧寻找与之连锁的基因。用相同的方法依次寻找与 SI 相关的 S 位点糖蛋白（ S-locus glycoprotein， SLG） 、 S 位点受体激酶（ S-locus receptor kinase， SRK） 、 SCR/SP11（ S-locus cysteine-rich protein/S-locus protein 11） 、类硫氧还蛋白 1/2（ Thioredoxin-like protein 1/2， THL1/2） 、 M 位点蛋白激酶 （ M-locus protein kinase， MLPK） 、Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 88 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 85– 96. 臂重复蛋白 1（ Arm repeat containing 1， ARC1）和 Exo70A1 的靶结合序列，确定它们在染色体上的位置。以此来判断 BoPLL 基因是否与 SI 相关的基因连锁。 nbsp;1.6 nbsp;BoPLL 的生物信息学分析 nbsp; nbsp; 利用 GSDS 在线工具（ http // nbsp;ProtParam分析 BoPLL 基因编码蛋白质的理化性质；利用 Signalp 4.1 server 软件预测编码蛋白质的信号肽；利用 TMHMM Server v.2.0在线软件分析跨膜结构； 利用在线工具 SOPMA软件分析蛋白质的二级结构；运用 Netphos 2.0 server 软件预测磷酸化位点；运用 ProtScale 在线分析软件预测疏水性 /亲水性；利用 nbsp;SMART 网站（ http //smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白质的结构域；利用 Cell-PLoc 在线工具（ http/ / DNAMAN Version 6.0 软件将 BoPLL 与甘蓝型油菜 BnPLL（ XP 013681553.1） 、 白菜型油菜 BrPLL（ XP 009133429.1） 、 萝卜RsPLL（ XP 018475341.1） 的氨基酸序列比对分析； 用 MEGA6 软件结合 NCBI 网站 （ http //www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的蛋白质数据库构建 BoPLL 系统进化树。 nbsp;1.7 nbsp;BoPLL 的表达分析 nbsp; nbsp;通过 QRT-PCR 技术检测 BoPLL 在叶片、花蕾、萼片、花瓣、花粉和柱头等组织中的表达量，Samuel 等（ 2009）和 Chandna 等（ 2012）对候选内参基因的评价分析结果，以 Actin3 作为内参（表1） ， 具体操作按照高保真 DNA 聚合酶 PrimeSTAR 说明书进行。 PCR 扩增参数为 98 ℃预变性 2 min；98 ℃ nbsp;10 s； 56 ℃ nbsp;5 s； 72 ℃延伸 6 s； 30 个循环； 72 ℃延伸 5 min； 4 ℃保存。 PCR 扩增产物经 1 104 mg L-1琼脂糖凝胶电泳检测。 nbsp;根据获得的 BoPLL 序列设计荧光定量 PCR 特异性引物 RT-PCR-F、 RT-PCR-R（表 1） ，以未授粉柱头，自花授粉 15、 30 和 60 min 和异花授粉 15、 30 和 60 min 的柱头 cDNA 为模板， Actin3为内参。 Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix 为荧光定量 PCR 染料，反应体系为 10 L，在 Bio-Rad CFX-1000 荧光定量 PCR 仪上对目的基因进行荧光定量 PCR 反应。 反应参数 95 ℃ nbsp;30 s； 95 ℃ nbsp;10 s；57 ℃ nbsp;10 s； 72 ℃ 10 s； 40 个循环，每个循环结束时采集荧光信号。 40 个循环后 PCR 扩增产物进行溶解曲线分析。 nbsp;反应完成后利用 Bio-Rad CFX Manager Software 和 Excel 软件进行数据分析。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;甘蓝 BoPLL 蛋白的分离与质谱鉴定 nbsp;将蛋白质点 6324 肽指纹图谱与拟南芥数据库进行比对，发现与拟南芥 AtPLL（ LOC106333535）匹配性最高， 相似性为 40.2， 将该蛋白质命名为 Brassica oleracea Pectate Lyase Like（简称 BoPLL） 。双向电泳结果显示 BoPLL 蛋白的相对分子质量约 45 kD， pI 约为 8.9。 nbsp;PDQuest 软件统计 BoPLL 蛋白质相对表达量显示自花授粉 3 5 min 的平均值为 1 086.1， 60 min时为 331.9；异花授粉 3 5 min 的平均值为 430.7， 60 min 时为 1 009.1。 BoPLL 蛋白质在自花授粉后 60 min 的表达量相对于 3 5 min 的表达量明显减少， 而在异花授粉后 60 min 的表达量相对于 3 5 min 的表达量显著增加，与自花授粉后的变化趋势刚好相反（图 1） 。 nbsp;罗绍兰，蒲 nbsp; 敏，曾 nbsp; 静，施松梅，廉小平，王玉奎，白晓璟，张贺翠，朱利泉 . 甘蓝自交不亲和性相关基因 BoPLL 的克隆、定位与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 1 85– 96. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 89 图 2 nbsp;甘蓝柱头内 BoPLL 响应自花和异花授粉后表达模式 nbsp;Fig. 2 nbsp;Expression pattern of BoPLL in stigmas in response to self-pollination and cross-pollination 图 3 nbsp;甘蓝 BoPLL gDNA 和 cDNA PCR 产物电泳图 nbsp;Fig. 3 nbsp;The agrose gel electrophoresis of gDNA and cDNA PCR product of Brassica oleracea BoPLL 图 1 nbsp;BoPLL 蛋白双向电泳图（左）和自花、异花授粉诱导甘蓝柱头 BoPLL 蛋白差异表达（右） nbsp;箭头所指为 BoPLL 蛋白所在位置。 nbsp;Fig. 1 nbsp;The 2-DE electrophoresis of BoPLL protein（ left） and differential expression of protein BoPLL in nbsp;Brassica oleracea stigma after self-pollination and cross-pollination（ right） nbsp;The arrows indicated the location of protein BoPLL. nbsp;2.2 nbsp;BoPLL 的转录水平分析 nbsp; 根据双向电泳结果， BoPLL 蛋白在自花和异花授粉后变化趋势相反，为了进一步验证BoPLL 蛋白响应自交不亲和反应过程，以甘蓝‘ A4’未授粉柱头和自花和异花授粉处理的柱头为材料进行转录组测序和分析。结果显示BoPLL 在自花授粉 0 30 min 持续显著上调表达，而在 30 60 min 急剧下降；在异花授粉0 15 min 也是显著上调表达， 15 30 min 无明显变化， 30 60 min 继续显著上调表达（图2） 。 nbsp;2.3 nbsp;BoPLL 的克隆 nbsp;对甘蓝 BoPLL 的克隆结果表明， BoPLL gDNA PCR 产物大小约 1 800 bp， cDNA PCR产物约 1 200 bp（图 3） 。 nbsp;测序结果表明 PCR 扩增所获得的 BoPLL gDNA 序列长度为 1 796 bp， cDNA 序列长度为1 212 bp，包含了 BoPLL 完整的编码框。 nbsp;2.4 nbsp;BoPLL 的染色体定位 nbsp;将 BoPLL 中保守性较高的序列区段作为探针，在甘蓝全基因组进行扫描，发现唯一的靶结合序列，表明该基因位于 3 号染色体上，与之紧密连锁的基因有 LOC106331600、LOC106328192、 LOC106331914、 LOC106335979、 LOC106336284、 LOC106331557、 LOC106332625、LOC106336028、 LOC106329208、 LOC106335956、 LOC106329557、 LOC106332152、 LOC106332233、Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 90 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 85– 96. LOC106332234、 LOC106335288、 LOC106329166、 LOC106328188、 LOC106335790、 LOC106330019、LOC106330020。 nbsp;芸薹属作物与 SI 相关的基因 SLG、 SRK、 SCR/SP11、 THL1/2、 MLPK、 ARC1 和 Exo70A1 在染色体上的位置如图 4 所示，只有 MLPK 与 BoPLL 同在 3 号染色体上，但是相距甚远，说明 BoPLL不与甘蓝 SI 相关的基因紧密连锁，表明其可能是参与 SI 过程的反式作用因子。 nbsp;图 4 nbsp;甘蓝 BoPLL 和 SI 相关基因在染色体上的分布 nbsp;Fig. 4 nbsp;Genomic distribution of BoPLL and SI releted gene in chromosomes of Brassica oleracea 2.5 nbsp;BoPLL 生物信息学分析 nbsp;Clustal 件比对分析 BoPLL gDNA 和 cDNA 序列，发现该基因由 4 个外显子（分别为 147、 310、519 和 232 bp）和 3 个内含子（分别为 82、 232 和 95 bp）组成（图 5） 。 nbsp;内含子剪切位点完全遵守经典的 GT-AG 法则。 BoPLL 的 ORF 全长 1 212 bp，编码 403 个氨基酸残基，相对分子量为 43.7 kD，理论等电点（ pI）为 8.87，与柱头总蛋白质双向电泳分析中蛋白质点 6324 的相对分子质量大小和等电点基本一致， 证明扩增的 BoPLL 就是蛋白质点 6324 的编码序列，BoPLL 的 Gene ID 106333535。 nbsp;图 5 nbsp;甘蓝 BoPLL gDNA 的结构图 nbsp;Fig. 5 nbsp;The gene structure of Brassica oleracea BoPLL gDNA 罗绍兰，蒲 nbsp; 敏，曾 nbsp; 静，施松梅，廉小平，王玉奎，白晓璟，张贺翠，朱利泉 . 甘蓝自交不亲和性相关基因 BoPLL 的克隆、定位与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 1 85– 96. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 91 由图 6 可以看出，在氨基酸组成中， Asn 和 Gly 出现频率较高，分别占氨基酸总数的 9.93和9.43，而氨基酸 Trp、 Tyr、 Met 和 Gln 分别仅占氨基酸总数的 1.0、 1.7、 1.7和 2.2。带负电荷的氨基酸（ Asp Glu）残基有 32 个，带正电荷的氨基酸（ Arg Lys）残基有 42 个。 nbsp;BoPLL 属于疏水性蛋白质。 BoPLL 蛋白质包含 5 个 N 糖基化位点， 9 个 N–豆蔻酰化位点， 5个蛋白质激酶 C 磷酸化位点， 3 个酪蛋白质Ⅱ磷酸化位点， 1 个 ATP/GTP 结合位点， 1 个多聚半乳糖醛酸酶活性位点。 nbsp;图 6 nbsp;甘蓝 BoPLL gDNA 结构图及其推导的氨基酸序列 nbsp;实线框为 N–糖基化位点，虚线框为 N–豆蔻酰化位点，椭圆为蛋白激酶 C 磷酸化位点， nbsp;虚线椭圆为酪蛋白Ⅱ磷酸化位点，下划线为 ATP/GTP 结合位点， nbsp;点线为聚半乳糖醛酸酶活性位点。 nbsp;Fig. 6 nbsp;The gene structure of Brassica oleracea BoPLL and its deduced amino acid sequence The box was N-glycosylation site， the dashed box for N-myristoylation site， the oval for protein kinase C phosphorylation site， nbsp;the dashed oval for casein kinaseⅡ phosphorylation site， the underline for ATP/GTP-binding site， nbsp;the spot for polygalacturonase active site. Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 92 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 85– 96. 通过分析发现 BoPLL 蛋白质 N–端有跨膜结构域和一段潜在的位号肽段，属于疏水性蛋白，定位于胞内近膜侧。二级结构分析发现含有 α–螺旋 6.95、无规则卷曲 53.35和延伸链 39.70。BoPLL 具有 PLL 基因家族典型的功能域，包含 4 个 PbH1 结构域、 HYDRO 结构域、 PASTA 结构域和 CMM-10 结构域。通过 GO 功能注释， PLL 基因家族蛋白主要作用是降解植物细胞壁、导致植物组织软化。在植物生殖发育过程中， PLL 基因家族蛋白与花粉壁生长相关，主要在植物花粉发育、授粉和受精过程中起作用。通过 NCBI 网站 Blast 检索表明 BoPLL 与 AtPLL 的核苷酸序列及氨基酸序列的一致性最高，分别为 85和 84（图 7）。 nbsp;利用 MEGA 软件构建 BoPLL 遗传进化树发现 BoPLL 与 AtPLL 亲缘关系最近， 与 EsPLL 亲缘关系次之，与 MtPLL 亲缘关系较远（图 8）。 nbsp;图 7 nbsp;BoPLL 蛋白与同源蛋白序列多重比对 nbsp;括弧代表 PbH1 结构域，圆点代表 HYDRO 结构域，方形点代表 PASTA 结构域，实线代表 CBM-10 结构域。 nbsp;Fig. 7 nbsp;The multiple sequence alignment of BoPLL with homologous proteins The PbH1-domain， HYDRO-domain， PASTA-domain and CBM-10-domain are marked with parentheses， dots， nbsp;square point and solid line， respectively. 罗绍兰，蒲 nbsp; 敏，曾 nbsp; 静，施松梅，廉小平，王玉奎，白晓璟，张贺翠，朱利泉 . 甘蓝自交不亲和性相关基因 BoPLL 的克隆、定位与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 1 85– 96. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 93 图 8 nbsp;甘蓝 BoPLL 及其同源氨基酸序列关系分析 nbsp;Fig. 8 nbsp;The phylogenetic relationship of amino acid sequences between Brassica oleracea BoPLL with its homologous proteins 2.6 nbsp;BoPLL 的表达分析 nbsp;半定量 RT-PCR 分析结果（图 9）表明， BoPLL 主要在甘蓝花粉和柱头中表达，在柱头中的表达量明显低于花粉中表达量。而在叶片、花蕾、萼片以及花瓣中均没有检测到表达。 nbsp;图 nbsp;9 nbsp;甘蓝 BoPLL 在不同组织中的表达检测 nbsp;Fig. 9 nbsp;Expression analysis of BoPLL in different organs of Brassica oleracea 另外一方面，在自花和异花授粉后不同时间的表达结果（图 10）表明，该基因在自花授粉过程中， 0 15 min 下调表达，在授粉 30 min 时表达量达到最高，随后表达量一直下降；在异花授粉过程中， 0 15 min BoPLL 也是下调表达，在授粉 15 min 时表达量达到最低，随后上调表达。即在自花和异花授粉 30 min 以后 BoPLL 基因表达趋势完全相反，该结果与转录组分析结果基本一致。 nbsp;图 10 nbsp;甘蓝柱头内 BoPLL 响应自花和异花授粉后表达模式 nbsp;Fig. 10 nbsp;Expression pattern of BoPLL in stigmas in response to self-pollination and cross-pollination of Brassica oleracea nbsp;Luo Shaolan， Pu min， Zeng Jing， Shi Songmei， Lian Xiaoping， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zhang Hecui， Zhu Liquan. Molecular cloning， location and expression analysis of BoPLL in self-incompatibility Brasscia oleracea. 94 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 85– 96. 3 nbsp;讨论 nbsp;甘蓝是典型的孢子体型自交不亲和植物（ Whitehouse， 1978） 。花粉和柱头相互作用的过程包括花粉粘附、水合、萌发及随后花粉管穿入柱头等过程/p