转Cry1Ac青花菜回交后代鉴定方法研究.pdf

p园艺学报， 2018， 45 1 97– 108. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0617； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 97 收稿日期 2017– 10– 19； 修回日期 2017– 12– 01 nbsp; 基金项目 “十二五”国家科技支撑计划课题项目（ 2013BAD01B04）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（ CARS-23-A）；中国农业科学院科技创新工程项目（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ） nbsp;转 Cry1Ac 青花菜回交后代鉴定方法研究 nbsp;李占省，张黎黎，张小丽，舒金帅，苏彦宾，孙继峰，刘玉梅*，方智远，杨丽梅，庄 nbsp;木，张扬勇，吕红豪 nbsp;（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 nbsp;100081） nbsp;摘 nbsp;要 转 Bt 基因青花菜在遗传分离后代中的鉴定方法，对于准确筛选阳性单株和抗虫材料具有重要影响。利用 5 份青花菜材料、 1 份阳性对照（转 Cry1Ac 基因纯合材料）和 5 份回交父本（阴性对照）为试验对象，在基因水平上对 Cry1Ac 进行普通 PCR 扩增，蛋白水平上采用 Bt-Cry1Ab/1Ac 转基因检测试纸条测定，表观上采用小菜蛾离体饲虫试验进行抗性鉴定，比较阐明了 3 种方法的鉴定效果和优缺点。结果表明， 3 种方法分别从 5 份青花菜回交材料的 159 个分离单株中检测到 82、 77 和 75 份阳性株，经卡方显著性检验，各材料阳性单株与非阳性单株分离后代均符合孟德尔遗传规律。分析表明，小菜蛾离体饲虫试验对于鉴定转 Cry1Ac 后代抗虫效果准确可靠，但需要很好地控制实验条件； Bt-Cry1Ab/1Ac 转基因检测试纸条灵敏度高，可快速观察到 Bt 毒蛋白的实际表达量，基本不受条件限制，但必须控制人为误差；普通 PCR 扩增能够鉴定阳性株，但不能反映实际抗虫效果，必须结合小菜蛾饲虫试验或 Bt 毒蛋白水平上的检测才能实现精准鉴定。 nbsp;关键词 青花菜；转基因； Cry1Ac；小菜蛾；遗传 nbsp;中图分类号 S 635.9 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 01-0097-12 Studies on Identification s in Backcross Generation of Cry1Ac- transgenic Broccoli nbsp; LI Zhansheng， ZHANG Lili， ZHANG Xiaoli， SHU Jinshuai， SU Yanbin， SUN Jifeng， LIU Yumei*，FANG Zhiyuan， YANG Limei， ZHUANG Mu， ZHANG Yangyong， and L Honghao nbsp;（ Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences； Key Laboratory of Biological and Genetic Improvement of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture， Beijing 100081， China） nbsp;Abstract It’s important for separation offspring in transgenic Bt gene broccoli to identify positive plant lines and resistant materials accurately by different s. In the study， five backcross materials based on four to five generations， one homozygous material as positive control and five inbred lines as negative controls were used for analysis of the insect-resistant effectiveness of Cry1Ac in transgenic broccoli from the levels of gene， protein and appearance. The gene of Cry1Ac was carried out by PCR amplification， protein was carried out by determination of Bt-Cry1Ab/1Ac test strip， and appearance was carried out by feeding test of diamondback moth in vitro. At the same time， the advantages of three Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， L Honghao. Study on identification s in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 98 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 97– 108. s were uated and stated. The result showed that a total of 82， 77 and 75 positive strains were divided from 159 strains of five backcross materials. According to chi-square test at the level of 5， the positive and none positive strains of 1︰ 1 were calculated and in accordance with mendelian inheritance. By comparisons of three s， we found that the feeding trial of diamondback moth in vitro was accurate and reliable， but the experimental conditions must to be well controlled. The Bt-Cry1Ab/1Ac test strip was sensitive， fast and can observe the actual Bt protein expression， but it must control human errors. The normal PCR amplification could be used to identify the positive strains， but it can not reflect the actual anti-insect effect， so it needs to be together with the test of feeding diamondback moth or the test of Bt protein， which could provide an accurate result. Keywords broccoli； transgene； Cry1Ac； diamondback moth； heridity nbsp;青花菜（ Brassica oleracea var. italica）的害虫主要是小菜蛾（ Plutella xylostella L.）和菜粉蝶（ Pieris rapae L.） 。转 Bt 基因作物作为现代技术的一种产物，兼顾杀虫效果和减少环境污染，广泛受到重视和普遍应用。 1987 年，第 1 个转 Bt 基因烟草出现以后， Bt 基因相继被转入其它作物中（ Barton， 1995） 。 2013 年，全球转 Bt 作物种植面积在 7 000 万 hm2以上，占转基因作物总面积的26，中国棉花种植中 90以上为 Bt 抗虫棉，种植面积为 420 万 hm2（李晨和刘博林， 2015） 。 nbsp;目前使用的主要有苏云金芽孢杆菌（ Bt）基因、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因，其中 Bt基因（ Cry1Ab/Ac、 Cry2A、 Cry3A、 Cry1C、 Cry1Ia8、 Cry1Ba3、 cry9C/Bar 等）是应用最广泛的抗虫基因，现已在棉花、水稻、大豆和玉米等大田作物育种上成功应用（ Shah et al.， 2017； Wang et al.，2017） 。 Cry1Ac 是转 Bt 基因作物中应用最广泛的基因，在玉米、水稻、棉花、大豆、茄子、番茄和白杨等作物中成功转育，在部分国家已获得商业化许可（ James， 2008） 。 nbsp;Bt 基因即苏云金芽胞杆菌（ Bacillus thuringiensis， Bt）基因，该基因的表达能够使得植物体内生成一种毒蛋白 δ 内毒素，为 130 160 kD 的多肽（ Liu et al.， 2016） ，对鳞翅目和鞘翅目害虫有杀伤作用，具有高效、安全等优点。其杀虫原理为当害虫吞食转 Bt 基因的植物后，在伴孢晶体内以原毒素形式存在的毒蛋白，在体外碱性条件下或在害虫肠道内被水解成 55 75 kD 或更小的多肽，这些多肽能够与昆虫体内中肠上缘刷状细胞上的特异受体位点结合，破坏上皮细胞渗透压平衡，造成细胞裂解，最终杀死害虫（ Sayyed et al.， 2000） 。 nbsp;外源基因能够在转基因作物中高频整合、稳定遗传和高效表达是转基因技术运用的关键。外源基因在宿主内往往会出现片段丢失、重排和异常重组等现象（ Guo et al.， 2001） 。但多数转基因作物证实 Bt 基因在宿主内符合孟德尔遗传规律。 Cooley 等（ 1995）证实了外源基因可以整合到宿主基因组两个不同位点上，作为两个不连锁的显性基因，在转基因单株自交后代中表现出 15︰ l 的孟德尔遗传规律（ Cooley et al.， 1995） 。 Wang 等（ 2002）通过转 Bt 基因水稻分析了其在回交后代和 F2代中的分离比，发现回交群体符合 1︰ 1 的分离比， F2符合 3︰ 1 的分离比，证实了转基因植株后代同样符合孟德尔方式遗传（ Wang et al.， 2002） 。 Fabrick 和 Tabashnik（ 2012）和 Campagne 等（ 2017）通过多年观察，表明转 Bt 基因作物能够稳定遗传，保持抗虫性，转 Bt 基因的遗传规律在甘蓝、辣椒和玉米等作物上也得到了证实（ Jin et al.， 2001； Dutta et al.， 2012； Chen et al.， 2016； Guo et al.，2016） 。 nbsp;转 Bt 基因后代材料在利用过程中往往存在分离现象，因其多数符合孟德尔遗传规律，所以在材料创新过程中往往存在回交转育和分离的问题， 而准确鉴定分离单株是否带有 Bt 基因和具有稳定的李占省，张黎黎，张小丽，舒金帅，苏彦宾，孙继峰，刘玉梅，方智远，杨丽梅，庄 nbsp;木，张扬勇，吕红豪 . 转 Cry1Ac 青花菜回交后代鉴定方法研究 . 园艺学报， 2018， 45 1 97– 108. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 99 杀虫效果就成了问题的关键。本试验中以青花菜 5 份回交分离材料分离后代为研究对象，从基因、蛋白和表观水平上对 PCR 扩增， Bt 毒蛋白表达量和小菜蛾离体饲虫试验 3 种方法进行了抗虫效果比较，阐明了各方法的准确性和优缺点，为有效筛选转 Bt 基因分离单株提供依据和方法，保证回交后代和新品种选育后的植株抗虫效果。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;试验材料 nbsp;试验于 2016 年 8 月 2017 年 2 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。青花菜回交材料 5份（ B801 B805） ，是分别由 5 份自交 14 代以上纯合自交系 B1 B5 先与转 Bt Cry1Ac 纯合系 B800杂交获得 F1代， F1材料再分别与 5 份纯合自交系材料（父本）连续回交获得的回交 4 5 代材料（表1） ，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。转 Bt 原始亲本为转 Cry1Ac 青花菜纯合材料，为阳性对照，由华中农业大学李汉霞老师惠赠； B1 B5 为纯合自交系材料（回交父本） ，为阴性对照，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。 nbsp;所有材料于 2016 年 8 月中旬定植于温室内，每份材料设置 3 次重复，每重复种植 12 株，行间距为 40 cm 50 cm。 2016 年 10 月初花球成熟时对试验材料的叶片进行取样提取 DNA、 PCR 扩增、Bt 蛋白鉴定和小菜蛾离体饲虫试验。 nbsp;小菜蛾由中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室昆虫组惠赠。 nbsp;1.2 nbsp;饲虫试验鉴定 nbsp;利用叶片采集器采集叶片，每重复采样 10 11 株，放置于直径为 6 cm 的培养皿中进行抗虫性鉴定每片叶接种 10 头 2 龄小菜蛾，培养皿内放置滤纸，并滴入少量蒸馏水保持湿度，用封口膜封口，置于（ 25 1） nbsp;℃光照培养箱内进行培养，光照 /黑暗为 16 h/8 h，相对湿度为 65。分别在 1、3 和 5 d 后调查小菜蛾生长情况和叶片损伤程度（李汉霞 nbsp;等， 2010） 。 nbsp;死亡率（ ） 死亡数 /（死亡数 nbsp; 活虫数） 100；校正死亡率（ ） （处理死亡率–对照死亡率） /（ 1–对照死亡率） 100；化蛹率（ ） 化蛹数 /（化蛹数 nbsp; 活虫数） 100。当对照组死亡率超过 20时视为无效，需再次进行测定。 nbsp;叶片损伤程度分为 4 级。 0 级叶面积几乎无损伤； 1 级约 1/4 叶面积损伤； 3 级 1/4 1/2叶面积损伤； 5 级 1/2 3/4 叶面积损伤； 7 级大于 3/4 叶面积损伤。 nbsp;虫态分为以下几种健硕发育正常，运动能力较强；活泼发育正常，能够正常运动；慵懒发育延缓，不爱运动；萎靡发育受阻，几乎不运动；死亡身体发黑或变色，无生命。 nbsp;1.3 nbsp;Bt 基因鉴定 nbsp;青花菜成株期后，采用 CTAB 法提取幼嫩叶片基因组 DNA（李占省 nbsp;等， 2012） 。 nbsp;Bt 基因扩增引物采用李汉霞等 （ 2010） 报道的双向引物 （上海生工生物工程技术服务有限公司） ，Cry1Ac-FW （ 5′– 3′） ATGGACAACAACCCAAACAT； Cry1Ac-RW （ 5′– 3′） TAAACTCGGGCCCG CTGAAT。 nbsp;反应体系（ 20 μL） Taq 2X Master Mix（北京全式金生物技术有限公司） 10 μL，正向引物（ 10 μmol L-1） 0.5 μL，反向引物（ 10 μmol L-1） 0.5 μL， DNA 模板（ 60 ng） 1 μL，双蒸水 8 μL。 nbsp;Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， L Honghao. Study on identification s in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 100 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 97– 108. PCR 扩增条件 95 ℃预变性 5 min；循环反应参数为 95 ℃ nbsp;30 s， 72 ℃ nbsp;45 s； 72 ℃ nbsp;45 s， 35个循环； 72 ℃延伸 10 min， 4 ℃终止。 nbsp;PCR 扩增结果采用 1的琼脂糖凝胶电泳分离，电泳仪（北京六一生物科技有限公司）恒定电压为 120 V，电泳时间 25 min 后，伯乐凝胶成像系统（美国 Bio-Rad）采集和编辑图片。 nbsp;1.4 nbsp;Bt 毒蛋白鉴定 nbsp;采用 Bt-Cry1Ab/1Ac 转基因检测试纸条鉴定 Bt 毒蛋白[美德华生（北京）检测技术有限公司]。在饲虫试验取样单株上采集叶片，用打孔器采集，大小为 0.5 cm2圆片，放入 1.1 mL 8 联排管中（ Simport，加拿大） ，最后放入 96 孔板中，加入用酒精清洗过的钢珠（直径 0.4 cm） 2 粒，加入适量提取液（试剂盒配带） 0.5 mL，打样机震荡 30 s，按照要求将试纸条放入匀浆中，液体高度不超过指示线， 1 min 左右可查看结果，双带（质控线和检测线）为 Bt 毒蛋白阳性株，只有一条带（质控线）为非阳性株。 nbsp;1.5 nbsp;数据处理 nbsp;采用 Excel 2003 进行基本数据处理，方差分析和卡方检验采用 SPSS 10.0 软件，试验结果为平均值 nbsp; 标准误（ mean SD， n 3） ， one-way ANOVA 用于显著性检验，多重比较采用 Duncan’s 新复极差法分析（ P lt; 0.05） 。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;转 Cry1Ac 青花菜回交后代的基因 PCR 鉴定 nbsp;经 PCR 扩增， Cry1Ac 阳性株可扩增出 1 200 bp 的片段（图 1） 。转 Bt 青花菜原始亲本（阳性对照）后代遗传率达到了 100，表明该基因能够稳定遗传。 5 份转 Bt 基因（ Cry1Ac）青花菜材料在回交转育后代中阳性株所占比例为 46.8 56.2（表 1） ，经卡方检验，阳性株和非阳性株分离比不显著，符合孟德尔 1︰ 1 的遗传分离规律。 nbsp;表 1 nbsp;转 Cry1Ac 青花菜回交后代和对照 PCR 鉴定结果 nbsp;Table 1 nbsp;The PCR results of gene Cry1Ac in the backcross offspring and the control lines of broccoli 品系 nbsp;Strain 总株数 nbsp;Total plant 阳性株 nbsp;Positive plant 阳性株比例 / Proportion of positive plant 卡方检验（ χ2） nbsp;Chi-squared test P 值 nbsp;P value 显著性 nbsp;Significance B800 Cry1Ac 32 32 100 7.02 0.008 ** B1 32 0 0 8.51 0.003 B2 8. 0.003 ** B3 32 0 0 8.51 0.003 B4 8. 0.003 ** B5 32 0 0 8.51 0.003 B801 （ B1 Bt Cry1Ac） B1 32 17 53.1 0.04 0.832 nbsp;B802（ B2 Bt Cry1Ac） B2 32 17 53.1 0.04 0.832 nbsp;B803 （ B3 Bt Cry1Ac） B3 31 15 48.4 0.02 0.896 nbsp;B804 （ B4 Bt Cry1Ac） B4 32 15 46.8 0.02 0.896 nbsp;B805 （ B5 Bt Cry1Ac） B5 32 18 56.2 0.15 0.702 nbsp;注 B1 B5 为纯合自交系， **代表极显著差异（ P lt; 0.01） 。 nbsp;Note B1 to B5 represented inbred lines， and ** showed extreme significance at the level of 1. 李占省，张黎黎，张小丽，舒金帅，苏彦宾，孙继峰，刘玉梅，方智远，杨丽梅，庄 nbsp;木，张扬勇，吕红豪 . 转 Cry1Ac 青花菜回交后代鉴定方法研究 . 园艺学报， 2018， 45 1 97– 108. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 101 图 1 nbsp;转 Cry1Ac 青花菜原始亲本 B800 和与 B1 回交后代（ B801）单株 PCR 扩增结果 nbsp;B800 为阳性对照 Bt 原始亲本； B1 为阴性对照。 nbsp;Fig. 1 nbsp;The PCR result of transgenic broccoli（ Cry1Ac） of initial parent B800 and backcross generation B801 B800 was the positive control standing for the initial Bt parent； B1 was the negative control. 2.2 nbsp;转 Cry1Ac 青花菜回交后代对小菜蛾的离体抗性鉴定 nbsp;调查显示， 5 份转 Cry1Ac 青花菜回交材料在转育后代中均出现了分离，转 Bt 材料和对照材料喂食小菜蛾结果呈现出显著的差异，阳性株抗虫效果明显优于对照（图 2） 。 nbsp;图 2 nbsp;转 Cry1Ac 青花菜回交材料 B801、 B802 和 B803 阳性株与相应对照材料 B1、 B2 和 B3 在小菜蛾离体饲喂 5 d 时的表现 nbsp;Fig. 2 nbsp;The perance of feeding test of diamondback moth in vitro happened to transgenic broccoli of backcross generation B801，B802 and B803 and corresponding control of inbred lines B1， B2 and B3 after 5 days 从表 2 可以看出，转 Cry1Ac 青花菜喂食 1 d 后的小菜蛾多数发育迟缓或未发育（保持 2 龄幼虫体态） ，叶片未受损伤或损伤极少；阴性对照喂食的材料则发育正常，已经生长至 3 龄，叶片受损明显，达到了 1 级。 3 d 时，转 Cry1Ac 青花菜喂食后的小菜蛾表现毒害反应，多数死亡，而对照则发Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， L Honghao. Study on identification s in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 102 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 97– 108. 育正常，已成为 3 4 龄幼虫，叶片受损达到了 3 级。 5 d 时，转 Cry1Ac 青花菜喂食后小菜蛾全部死亡，叶片轻微受损或无损伤，而阴性对照则生长为 4 龄以上幼虫或化蛹，叶片受损严重，达到了5 7 级。 nbsp;表 2 nbsp;各青花菜材料小菜蛾离体饲虫试验表现 Table 2 nbsp;The perance of all broccoli materials in feeding test of diamondback moth in vitro 饲虫 / d Feeding nbsp;days 品系 nbsp;Strain 叶片损伤程度 nbsp;Damage of leaves 校正死亡率 / Corrected nbsp;mortality 虫态 nbsp;Insect status 虫龄 nbsp;Insect size 化蛹率 / Pupation nbsp;rate 1 B800 Cry1Ac 0 0 b 0 0 a 活泼或慵懒 nbsp;Living or languid 2 0 b 0 0 a B1 1 0 a 0 0 a 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3 0 a 0 0 a B2 1 0 a 0 0 a 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3 0 a 0 0 a B3 1 0 a 0 0 a 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3 0 a 0 0 a B4 1 0 a 0 0 a 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3 0 a 0 0 a B5 1 0 a 0 0 a 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3 0 a 0 0 a B801（ B1 Bt ry1Ac） B1 0 0 b 0 0 a 活泼或慵懒 nbsp;Living or languid 2 0 b 0 0 a B802（ B2 Bt ry1Ac） B2 0 0 b 0 0 a 活泼 nbsp;Living 2 0 b 0 0 a B803（ B3 Bt ry1Ac） B3 0 0 b 0 0 a 慵懒 nbsp;Languid 2 0 b 0 0 a B804（ B4 Bt ry1Ac） B4 0 0 b 0 0 a 活泼 nbsp;Living 2 0 b 0 0 a B805（ B5 Bt ry1Ac） B5 0 0 b 0 0 a 活泼或慵懒 nbsp;Living or languid 2 0 b 0 0 a 3 nbsp;B800 Cry1Ac 0 0 c 100 0 a 死亡 nbsp;Death 2 0 c 0 0 a B1 3 0 a 0 0 d 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3.3 0.6 b 0 0 a B2 3 0 a 0 0 d 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3.7 0.6 a 0 0 a B3 3 0 a 0 0 d 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3.7 0.6 a 0 0 a B4 3 0 a 0 0 d 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3.7 0.6 a 0 0 a B5 3 0 a 0 0 d 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3.7 0.6 a 0 0 a B801（ B1 Bt ry1Ac） B1 0 0 c 100.0 0 a 死亡 Death 2 0 c 0 0 a B802（ B2 Bt ry1Ac） B2 1 0 b 86.7 11.5 c 死亡或萎靡 nbsp;Death or weak 2 0 c 0 0 a B803（ B3 Bt ry1Ac） B3 0 0 c 100.0 0 a 死亡 nbsp;Death 2 0 c 0 0 a B804（ B4 Bt ry1Ac） B4 1 0 b 93.3 5.8 b 死亡或萎靡 nbsp;Death or weak 2 0 c 0 0 a B805（ B5 Bt ry1Ac） B5 0 0 c 100.0 0 a 死亡 Death 2 0 c 0 0 a 5 nbsp;B800 Cry1Ac 0.0 0 e 100 0 死亡 Death nbsp;2 0 c 0 0 d B1 5.7 1.2 c 0 活泼或健硕 nbsp;Living or strong 3.7 0.6 b 0 0 d B2 6.3 1.2 b 0 活泼 Living 4.0 0 a 16.7 5.8 aB3 7.0 0 a 0 活泼 Living 4.0 0 a 13.3 5.8 bB4 7.0 0 a 0 活波 Living 4.0 0 a 0 0 d B5 6.3 1.2 b 0 活泼 Living 4.0 0 a 6.7 5.7 cB801（ B1 Bt ry1Ac） B1 0.0 0 e 100 死亡 Death 2 0 c 0 0 d B802（ B2 Bt ry1Ac） B2 0.7 0.1 d 100 死亡 Death 2 0 c 0 0 d B803（ B3 Bt ry1Ac） B3 0.0 0 e 100 死亡 Death 2 0 c 0 0 d B804（ B4 Bt ry1Ac） B4 0.7 0.6 d 100 死亡 Death 2 0 c 0 0 d B805（ B5 Bt ry1Ac） B5 0.0 0 e 100 死亡 Death 2 0 c 0 0 d 注 B1 B5 为纯合自交系，数值呈现为平均值 nbsp; 标准误（平均 nbsp; SD， n 3） ，不同小写字母表示各材料间的显著性检验（ P lt; 0.05） 。 nbsp;Note B1 to B5 represented inbred lines， and the value was presented as mean standard error（ n 3） ， and different lowercase letters indicated the significance test of each material at the level of 5. 李占省，张黎黎，张小丽，舒金帅，苏彦宾，孙继峰，刘玉梅，方智远，杨丽梅，庄 nbsp;木，张扬勇，吕红豪 . 转 Cry1Ac 青花菜回交后代鉴定方法研究 . 园艺学报， 2018， 45 1 97– 108. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 103 经卡方检验，转 Cry1Ac 青花菜回交后代阳性株与非阳性株比例符合 1︰ 1 孟德尔遗传分离规律（表 3） 。统计数据（表 3）显示，经小菜蛾离体饲虫试验鉴定转 Cry1Ac 原始亲本表现出对小菜蛾幼虫的抗性，阴性对照（ B1 B5）均不抗小菜蛾，转 Cry1Ac 回交材料（ B801 B805）阳性株均表现出抗性，阳性株所占比例为 43.7 53.1。 nbsp;表 3 nbsp;青花菜离体饲虫试验统计结果（ 5 d） nbsp;Table 3 nbsp;The statistical result of all broccoli materials in feeding test of diamondback moth in vitro after five days 品系 nbsp;Strain 总株数 nbsp;Total plant 阳性株 nbsp;Positive plant阳性株比例 / Proportion of positive plant卡方检验（ χ2） nbsp;Chi-squared test P 值 nbsp;P value 显著性 nbsp;SignificanceB800 Cry1Ac 32 32 100 7.02 0.008 ** B1 32 0 0 8.51 0.003 B2 8. 0.003 ** B3 32 0 0 8.51 0.003 B4 8. 0.003 ** B5 32 0 0 8.51 0.003 B801（ B1 Bt Cry1Ac） B1 32 17 53.1 0.04 0.832 nbsp;B802（ B2 Bt Cry1Ac） B2 32 14 43.7 0.05 0.823 nbsp;B803（ B3 Bt Cry1Ac） B3 31 15 48.4 0.02 0.896 nbsp;B804（ B4 Bt Cry1Ac） B4 32 13 40.6 0.22 0.636 nbsp;B805（ B5 Bt Cry1Ac） B5 32 16 50.0 0 0.968 nbsp;注 B1 B5 为纯合自交系， **代表极显著差异（ P lt; 0.01） 。 nbsp;Note B1 to B5 represented inbred lines， and ** showed extreme significance at the level of 1. 2.3 nbsp;转 Cry1Ac 青花菜回交后代的 Bt 毒蛋白鉴定 nbsp;Bt-Cry1Ab/1Ac 转基因检测试纸条鉴定结果表明， 该方法能够在 50 60 s 内检测出 Bt 毒蛋白阳性条带（检测线）是否出现（图 3） 。 nbsp;图 3 nbsp;B802 材料 Bt 毒蛋白鉴定部分结果 Fig. 3 nbsp;The partial result of backcross material B802 by Bt toxin protein test Li Zhansheng， Zhang Lili， Zhang Xiaoli， Shu Jinshuai， Su Yanbin， Sun Jifeng， Liu Yumei， Fang Zhiyuan， Yang Limei， Zhuang Mu，Zhang Yangyong， L Honghao. Study on identification s in backcross generation of Cry1Ac-transgenic broccoli. 104 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 97– 108. 将回交分离材料的试纸条鉴定结果（表 4）与 PCR 扩增结果（表 1）相比， B801 和 B803 与 PCR扩增结果一致， B802、 B804 和 B805 阳性株数量分别比 PCR 扩增结果少 2、 2 和 1 个。经卡方检验，5 份回交材料 B801 B805 的分离后代 B/p