安徽省甜查理草莓红叶病病原菌的分离与鉴定.pdf

分子植物育种 Molecular Plant Breeding ISSN 1672-416X,CN 46-1068/S 分子植物育种网络首发论文 题目 安徽省甜查理草莓红叶病病原菌的分离与鉴定 作者 宁志怨，伊兴凯，兰伟，黄锡桂，张殿兴，董玲，钱小强 网络首发日期 2018-10-18 引用格式 宁志怨，伊兴凯，兰伟，黄锡桂，张殿兴，董玲，钱小强．安徽省甜查理草莓红叶病病原菌的分离与鉴定[J/OL]．分子植物育种. http// 网络首发在编辑部工作流程中，稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定，且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式（包括网络呈现版式）排版后的稿件，可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合出版管理条例和期刊出版管理规定的有关规定；学术研究成果具有创新性、科学性和先进性，符合编辑部对刊文的录用要求，不存在学术不端行为及其他侵权行为；稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准，正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性，录用定稿一经发布，不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容，只可基于编辑规范进行少量文字的修改。 出版确认纸质期刊编辑部通过与中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有限公司签约，在中国学术期刊（网络版）出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版，以单篇或整期出版形式，在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为中国学术期刊（网络版）是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版。 研究报告Research Report安徽省甜查理草莓红叶病病原菌的分离与鉴定宁志怨 1 伊兴凯 1 兰伟 2* 黄锡桂 1 张殿兴 1 董玲 1 钱小强 11 安徽省农业科学院园艺研究所, 合肥, 230031; 2 阜阳师范学院生命与食品工程学院, 阜阳, 236037*通讯作者, 摘 要 红叶病的主要危害甜查理草莓的叶片，造成死苗现象，发病速度非常快，严重时可造成整行或整个大棚草莓死亡。病原菌的鉴定是病害防控的基础，本研究对来源于皖北地区的草莓红叶病的病原菌进行了分离、纯化、形态观察以及分子生物学鉴定。研究结果显示该病原菌在 PDA 平板上呈放射状，菌丝的颜色逐渐从白色变为黑色，菌丝体具有分枝的和隔膜。分生孢子是梭形，并且由五个细胞组成。使用 PCR法扩增该病原菌的 ITS 和 18S rDNA 的序列并进行 DNA 测序。根据测序的结果，对病原菌的 ITS 和 18SrDNA 序列的 BLAST 同源性对比和系统进化树分析。根据病原菌的外部特征和分子鉴定的结果证明引起安徽省甜查理草莓红叶病的病原菌为 Pestalotiopsis clavispora。本研究为草莓红叶病的病害防控提供科学依据。关键词 草莓红叶病, rDNA-ITS 序列 , 拟多盘鞭毛菌 , 进化树分析Isolation and identification of the Pathogen of Red Spot Leaf Diseasein “Sweet Charlie“ Strawberry inAnhui ProvinceNing Zhiyuan 1 Yi Xingkai 1 Lan Wei 2* Huang Xigui 1 Zhang Dianxing 1 Dong Ling 1Qian Xiaoqiang11 Horticultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, 230031; 2 College of Biotechndogy and FoodEngineering, Fuyang Teachers College, Fuyang, 236037* Corresponding author, Abstract This kind of disease mainly infect the strawberry leaves, and eventually caused the phenomenon ofdead plants with very fast the incidence rate. In serious cases, the strawberry plants in whole line or the wholegreenhouse can be destroyed. The identification of pathogenic bacteria is the basis of disease prevention andcontrol. In this study, the pathogens of strawberry red leaf disease originating from northern Anhui were isolated,purified, morphologically and molecularly identified. The results showed that the pathogen was radial on the PDAplate, and the color of the hyphae gradually changed from white to black, and the mycelium had branches and theconidia are were fusi and five-celled. The sequences of the ITS and 18S rDNA of the pathogen wereamplified by PCR amplification and sequenced by Shanghai Sangon Cooperation. According to the sequenceresult, the BLAST homology comparison and phylogenetic tree analysis were conducted based on the cloned ITSand 18S rDNA sequences of isolated pathogen. Finally, the pathogen causing “Sweet Charlie“ strawberry red leafdisease was identified as Pestalotiopsis clavispora based on the external characteristics and molecularidentification. This study pay the way for the prevention and control of strawberry red leaf disease.Keywords Strawberry red leaf disease, rDNA-ITS sequence, Pestalotiopsis clavispora, Phylogenetic treeanalysis草莓 Fragaria ananassa Duch.属蔷薇科草莓属植物，具有产量高、经济效益好等特点，是冬季时令的水果之一。近年来，随着农业产业结构的调整，草莓种植已经逐渐发展到全国各地 联合国粮农组织统计数据 Kurze et al., 2001。尤其是草莓品种甜查理，该品种休眠期浅、开花早、丰产、抗逆性强、大果型，植株生长势强，因此在中国广泛种植。但是随着生产发展、种植面积扩大、连作年限增加以及长期的无性繁网络首发时间2018-10-18 105205网络首发地址http// ， 近 年 来 在 湖 北 、 山 东 、 安 徽 和 江 苏 等 省 北 部 大 量 种 植 的 甜 查 理 草 莓 红 叶 病 经 常 发 生 ， 严 重 时 造 成 整 行或 整 棚 甜 查 理 草 莓 苗 死 亡 ， 并 呈 现 逐 年 加 重 的 趋 势 ， 给 农 户 造 成 了 极 大 的 损 失 ， 已 成 为 制 约 中 国 草 莓 产 业发 展 的 重 要 障 碍 之 一 。 2017 年 对 安 徽 省 北 部 的 多 个 草 莓 种 植 基 地 进 行 病 害 调 查 ， 结 果 发 现 甜 查 理 草 莓 红 叶病 在 这 些 地 区 时 有 发 生 。 发 病 植 株 症 状 表 现 为 叶 片 下 部 由 外 缘 向 内 缘 变 灰 色 ， 叶 片 上 面 呈 现 红 色 斑 点 状 ，严 重 时 整 个 叶 片 枯 死 ， 而 根 茎 结 合 部 剖 面 未 见 有 明 显 的 变 色 ， 最 终 导 致 整 个 植 株 枯 萎 死 亡 。 该 病 害 具 有 较强 的 传 染 性 ， 导 致 附 近 的 草 莓 苗 表 现 出 类 似 的 症 状 ， 给 生 产 上 带 来 较 大 的 损 失 图 1。 导 致 该 病 害 难 以 控制 的 主 要 原 因 是 草 莓 红 叶 病 的 病 原 菌 不 清 楚 ， 针 对 这 一 现 状 ， 本 试 验 在 对 该 我 省 北 部 地 区 甜 查 理 草 莓 红 叶病 病 原 分 离 的 基 础 上 ， 进 行 了 形 态 学 、 分 子 生 物 学 鉴 定 和 致 病 性 检 测 ， 旨 在 确 定 该 地 区 草 莓 红 叶 病 的 病 原菌 ， 为 草 莓 红 叶 病 的 防 治 提 供 理 论 依 据 。图 1“甜 查 理 ”草 莓 红 叶 病 的 发 病 照 片注 A 草 莓 红 叶 病 的 田 间 表 现 ; BC 红 叶 病 的 发 病 初 期 叶 片 正 面 和 反 面 的 照 片 ; D 病 斑 的 显 微 照 片 ; E 病 症 扩 大 时 导 致 叶片 干 枯 卷 曲 ; F 感 病 植 株 的 根 茎 结 合 部 剖 面 未 见 明 显 的 变 色Figure 1 Photographs of red leaf disease in “Sweet Charlie“ strawberryNote A field perance of strawberry red leaf disease; BC front and back pictures of leaves at the onset of strawberry red leafdisease; D the micrograph of lesion; E when lesions enlarge and eventually leading to dry and curl leaves; F Obviously nodiscoloration in the section of roots and stems of disease plants1 结 果 与 分 析1.1 病 原 菌 的 分 离 和 病 原 体 的 特 征在 采 样 点 附 近 不 同 地 点 ， 随 机 选 取 的 12 株 具 有 上 述 红 叶 病 发 病 特 征 的 草 莓 病 株 。 经 过 叶 片 冲 洗 和 表面消毒后，在实验室中切取上述感染的叶片的病健交界处用于病原菌的分离。 25℃下培养 5 d 后，三个平板被霉菌污染，一个平板未能分离出任何病原体。最后，从感病的叶片中分离出 8 种病原菌。然后将分离的 病 原 体 转 移 到 新 的 PDA 培 养 基 中 并 通 过 单 孢 子 分 离 法 进 行 纯 化 。 在 PDA 培 养 基 上 产 生 的 这 些 菌 落 是 白色 放 射 状 ， 边 缘 不 规 则 ， 表 面 粗 糙 ， 随 着 培 养 时 间 的 延 长 ， 菌 落 的 颜 色 逐 渐 由 白 色 转 变 为 黑 色 图 2。 在形 态 学 物 种 鉴 定 中 ， 将 这 些 分 离 物 在 PDA 培 养 基 平 板 上 培 养 ， 并 置 于 连 续 荧 光 下 的 培 养 箱 中 。 收 获 孢 子并 用 显 微 镜 进 行 观 察 。 这 些 培 养 物 覆 盖 有 黑 色 和 球 状 的 孢 子 ， 直 径 为 100200 mol/L。 每 个 分 生 孢 子 的 基部略显肿胀和球状。这些分离株的成熟的分生孢子呈纺锤形并且由五个细胞组成，测量大约为17.026.56.18.2 mol/L，并且五细胞中的二个中间细胞颜色且比两端细胞更深。顶端细胞呈透明三角状图 2。上述研究表明这些分离物在外观上和形态学鉴定与 Pestalotiopsis sp.相似。图 2 草 莓 红 叶 病 的 病 原 菌 的 形 态 学 研 究注A B 分 离 出 的 病 原 菌 PDA培 养 基 上 的 形 态 特 征; C 菌 丝 体 在 显 微 镜 下 的 形 态 特 征 研 究 ; D 梭 型 的 五细胞 组 成 的 成 熟 的孢 子Figure 2 Morphological examination of the isolate from infected strawberry leavesNote AB the morphological characteristics of the isolated pathogen on PDA medium; C morphological study of mycelia in themicroscope; D the mature fusi conidia with five-celled1.2 致 病 性试验通过上述方 法 用 每 种 分 离 物 的 分 生 孢 子 对 健 康 的 甜 查 理 草莓嫩叶进行 重 接 种 试 验 ， 三 次 重 复 。 接 种 7 d后 ， 接 种 叶 片 上 的 症 状 逐 渐 出 现 ， 并 且 与 之 前 在 田 间 采 集 的 病 株 叶 片 上 的 症 状 基 本 相 似 图 3a; 图 3b。 用无 菌 水 模拟接 种 的 对 照 植 物 未 显 示 出任何 症 状 图 3c; 图 3d。从 接 种 后 发 病 的 叶 片 上 将病原 菌 按 照 上 述 方法 进 行 重 新 分 离 、 培 养 和鉴定 为 Pestalotiopsis clavispora。 重 新 分 离 出 的 病 原菌培 养 物 的 外 部 形 态 也 和 先前从 田 间 植 物 中 分 离 的 病 原 菌 基 本 一 致 。图 3 利用病原菌的孢子悬浮液对甜查理草莓叶片进行重接种试验注 AB 使用孢子悬浮液接种; CD 使用无菌水接种对照Figure 3 Re-inoculation of “ Sweet Charlie “ strawberry leaves with spore suspension of isolated pathogenic bacteriaNoteAB stand for inoculation with a spore suspension of pathogen; CD stand for inoculation with sterile water as a control1.3 分 子 鉴 定从 PDA 培 养 基 收 集 分 离 物 的 菌 丝 体 并 冷 冻 干 燥 ， 在 液 氮 中 研 磨 成 细 粉 。 收 集 约 5070 mg 的 菌 丝 体 粉末 用 于 病 原 菌 基 因 组 DNA 的 提 取 。 提 取 的 基 因 组 DNA 经 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 ， 基 本 上 都 呈 一 条 亮 带 说 明提 取 的 DNA 可 以 满 足 PCR 扩 增 的 需 要 。 在 对 每 个 提 取 的 DNA 中 特 异 性 扩 增 ITS 和 18S-rDNA 序 列 后 ，从 这 些 扩 增 产 物 中 分 离 出 大 约 500 bp 和 1 300 bp 的 PCR 产 物 图 4。 在 对 这 些 特 异 性 DNA 条 带 进 行 回 收 、纯 化 和 测 序 后 ， 通 过 Clustal X 分 别 比 对 这 些 获 得 的 序 列 。 结 果 显 示 这 些 序 列 是 基 本 相 同 并 分 成 两 个 独 立 的组 IS102 和 IS126 序 列 。 然 后 将 这 些 序 列 提 交 给 NCBI 上 的 GenBank 数 据 库 进 行 登 录 基 因 登 录 号 分 别 为MF399813 和 MF399814， 并 与 已 经 登 录 在 NCBI 数 据 库 中 的 序 列 进 行 同 源 性 比 对 。 根 据 比 对 结 果 ， 分 离克 隆 出 的 18S rDNA 序 列 与 GenBank 登 录 号 AF34561.1 具 有 99.76同 源 性 ， ITS 序 列 与 GenBank 登 录 号KY810807.1 序 列 具 有 100同 源 性 ， 这 两 个 序 列 分 别 来 源 于 Pestalotiopsis sp.和 Pestalotiopsis clavispora。图 4 ITS 和 18S-rDNA 序 列 的 电 泳注 DNAMaker SM0337 上 海 生 工 ; IS126 为 ITS 序 列 ; IS102 为 18S-rDNA 序 列Figure 4 the electrophoresis pattern of ITS and 18S-rDNAsequenceNote DNA Ladder Mix maker SM0337 Sangon Co., Shanghai; IS126 and IS102 standed for ITS and 18S-rDNA sequence,respectively在 进 化 树 分 析 中 ， 从 GenBank 获 得 的 总 共 25 个 来 源 于 Pestalotiopsis sp.的 序 列 和 克 隆 的 18S rDNA 序列 和 ITS 序 列 IS102 和 IS126 序 列 来 用 于 构 建 进 化 树 。 使 用 MEGA6.0 软 件 分 析 核 苷 酸 序 列 用 于 进 化 树 分析。 18S rDNA 系统发育进化树分析结果表明分离出的病原菌与 Pestalotiopsis sp.的同源性较高。然而，在更进一步的 ITS 序列水平上分析结果显示，该病原菌被鉴定为 Pestalotiopsis clavispora 图 5。因此， DNA分子鉴定的结果表明分离的病原菌是 Pestalotiopsis clavispora。综上所述，根据病原菌的外部特征和 DNA分 子 鉴 定 的 结 果 都 证 明 引 起 “甜 查 理 ”草 莓 红 叶 病 的 病 原 菌 为 Pestalotiopsis clavispora。图 5 利用 MEGA 软件对病原菌的 ITS 和 18S rDNA 序列的进化树分析Figure 5 Phylogenetic tree constructed by MEGA software based on an alignment of ITS and 18S rDNA sequence data from isolatedpathogen2 讨 论虽 然 Chamorro 2016等 报 道 Pestalotiopsis clavispora 能 够 引 起 草 莓 病 害 ， 他 发 现 病 原 菌 只 会 导 致 冠 和根 的 变 色 或 坏 死 ， 但 不 会 在 叶 子 上 产 生 斑 点 。 然 而 ， 这 项 研 究 表 明 ， 这 种 新 型 的 Pestalotiopsis clavispora只 能 导 致 叶 片 感 病 ， 但 冠 和 根 中 没 有 变 色 或 棕 色 坏 死 区 域 图 1f。 因 此 ， 从 这 两 种 Pestalotiopsis clavispora之 间 的 主 要 症 状 ， 我 们 认 为 这 种 新 菌 株 可 能 由 于 病 菌 的 变 异 等 原 因 可 能 与 Chamorro 等 2016报 道 的 分 离 的Pestalotiopsis clavispora 不同。但是这项研究也存在一些局限性，例如缺乏β -微管蛋白和 tef 基因差异的分子 证 据 。 因 此 ， 下 一 步 是 在 这 个 新 菌 株 中 克 隆 和 测 序 这 些 特 定 基 因 。 该 研 究 表 明 该 菌 株 是 一 种 新 的Pestalotiopsis clavispora， 而 与 以 前 报 道 的 Pestalotiopsis clavispora 可 能 不 同 。 据 报 道 ， Pestalotiopsisclavispora 具 有 广 泛 的 地 理 和 寄 主 范 围 ， 并 且 已 经 报 道 了 芒 果 Ismail et al., 2013， 杨 梅 Lu et al., 2015， 月季 Feng et al., 2014， 蓝 莓 Gonzlez et al., 2012; Luan et al., 2008， 枇 杷 Palou et al., 2013和 美 国 山 核 桃Lazarotto et al., 2012; Shi et al., 2015等 。 然 而 ， 上 述 分 析 无 法 推 断 出 这 种 分 离 的 病 原 体 的 来 源 。 安 徽 省 位于 中 国 东 部 ， 该 地 区 广 泛 种 植 蓝 莓 、 杨 梅 、 枇 杷 和 月 季 等 ， 因 此 可 能 成 为 草 莓 红 叶 病 的 病 菌 来 源 。 因 此 ，在未来的工作中，有必要通过病原体接种试验寻找能够在附近被感染的植物的搜索来确定该病原菌的来源 。 它 还 为 我 们 更 好 地 理 解 Pestalotiopsis clavispora 感 染 的 分 子 适 应 机 制 提 供 了 依 据 。据 我 们 所 知 ， 这 是 国 内 首 次 报 道 Pestalotiopsis clavispora 可 以 在 “ 甜 查 理 ” 草 莓 上 引 起 红 叶 病 的 研 究 ，最 后 通 过 形 态 学 鉴 定 和 分 子 鉴 定 被 认 为 是 该 病 害 的 主 要 致 病 菌 。 由 于 Pestalotiopsis clavispora 在 世 界 范 围内的流行和广泛的寄主范围，这是一种有效的植物病原体，在很大程度上未被认识到。该病原菌有可能导致重要经济作物的产量严重损失，需要对其进行进一步研究。3 材 料 与 方 法3.1 病 样 采 集 和 病 原 菌 的 分 离 和 形 态 学 鉴 定2017 年 11 月在皖北地区的阜阳、宿州和淮北等地进行“甜查理”草莓红叶病的发病情况调查，共随机采集草莓病株 12 份，在病株的病叶的病健交界处切取 810 mm2的组织块，首先用流水冲洗感染的叶片组 织 30 min， 然 后 用 表 面 灭 菌 的 [0.5％ w/v]次 氯 酸 钠 处 理 35 min， 然 后 在 无 菌 水 中 漂 洗 三 次 。 然 后 用 无菌剪刀将组织切成 23 mm 的正方形，以确保每个样品来自叶片的病健交界处。将组织置于 PDA 平板，在28℃下培养 35 d。一旦病原菌在 PDA 培养基上生长起来，在菌块的边缘处挑取菌丝并转移到新的 PDA中。将新 PDA 培养基置于 28℃恒温培养箱中 5 d，从每种分离物中分离出单个分生孢子。培养物在 PDA上 于 25℃培 养 ， 进 行 DNA 提 取 和 形 态 学 鉴 定 。 选 择 代 表 不 同 位 点 的 分 离 物 进 行 形 态 学 物 种 鉴 定 。 将 这 些分 离 物 在 PDA 培 养 基 上 于 黑 暗 中 于 25℃培 养 5 d。 从 菌 落 的 生 长 边 缘 取 出 菌 丝 体 盘 5 mm并 转 移 到 新 的PDA 培 养 基 平 板 上 。 将 新 板 置 于 25℃连 续 荧 光 灯 下 的 培 养 箱 中 。 14 d 后 ， 在 新 的 PDA 培 养 基 平 板 上 收 获产 生 的 分 生 孢 子 。 将 孢 子 置 于 水 中 ， 使 用 Olympus 光 学 显 微 镜 检 查 尺 寸 和 形 状 。 在 25℃下 ， 12 h 光 照 和12 h 黑 暗 交 替 循 环 的 条 件 下 ， 在 PDA 上 7 d 后 测 定 菌 落 颜 色 。3.2 病 原 菌 的 致 病 性 鉴 定为 了 确 定 分 离 的 病 原 菌 是 否 能 在 “ 甜 查 理 ” 草 莓 上 引 起 红 叶 病 ， 本 研 究 通 过 在 健 康 的 叶 片 上 滴 注 并 接种 病 原 菌 孢 子 悬 浮 液 进 行 重 接 种 ， 三 次 重 复 。 首 先 ， 用 灭 菌 水 对 甜 查 理 草 莓 植 株 上 的 嫩 叶 片 进 行 流 水 冲 洗30 min。 待 叶 片 干 燥 后 ， 将 叶 片 分 成 两 个 独 立 的 试 验 组 阴 性 对 照 组 和 病 原 菌 侵 染 组 ， 每 个 试 验 组 包 含 36株 甜 查 理 草 莓 叶 片 。 在 病 原 菌 侵 染 试 验 组 中 ， 在 叶 片 表 面 接 种 每 种 分 离 物 的 孢 子 悬 浮 液 2106个 分 生 孢 子/mL， 重 复 三 次 。 作 为 对 照 ， 用 无 菌 水 模 拟 接 种 草 莓 叶 片 的 表 面 ， 重 复 三 次 。 将 两 组 接 种 的 叶 子 分 别 置 于透 明 塑 料 袋 中 包 好 并 在 25℃的 生 长 室 中 在 光 照 下 孵 育 16 h， 在 19℃下 在 黑 暗 中 孵 育 8 h。 34 d 后 取 出 塑料 袋 ， 将 植 物 保 持 在 相 同 的 温 湿 度 条 件 下 ， 相 对 湿 度 为 7080， 直 至 叶 片 出 现 症 状 。3.3 分 子 鉴 定将真菌分离物在黑暗中于 25℃培养 67 d。使用灭菌的小铲子从 PDA 培养基表面收获菌丝体并冷冻干燥 ， 在 液 氮 中 研 磨 成 细 粉 末 ， 然 后 在 -70℃冰 箱 中 储 存 。 将 约 5070 mg 菌 丝 体 粉 末 移 入 无 菌 的 1.5 mL 的离 心 管 中 ； 通 过 CTAB 方 法 收 集 基 因 组 DNA Cubero et al., 1999。 然 后 ， 在 溴 化 乙 锭 染 色 后 ， 将 基 因 组DNA 置 于 1 w/v 琼 脂 糖 凝 胶 中 进 行 电 泳 验 证 。 内 部 转 录 间 隔 区 ITS 侧 翼 的 引 物 ITS15-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3, ITS4 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 Gardes and Bruns, 1993;Glass and Donaldson, 1995; Pereira et al., 2010; 郑 秋 霞 等 , 2015 和 18S rDNA 基 因 NS15-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 和 NS6 5-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3 Noda and Kodama,1996用 于 从 单 孢 子 培 养 物 提 取 的 DNA 中 扩 增 ITS 和 18S rDNA 序 列 。 聚 合 酶 链 反 应 PCR扩 增 在 总 体 积50 μL 中 进 行 ， 含 有 40 mmol/L 的 Tris-HCl pH 8.4， 100 mmol/L 的 KCl， 3 mmol/L 的 MgCl2， 200 μmol/LdNTP， 每 种 引 物 1 μmol/L， 和 0.5U Taq DNA 聚 合 酶 Sangon Co., Shanghai, China。 使 用 PTC-200 MJResearch Corp.,America进 行 PCR 扩 增 。 在 95℃初 始 变 性 4 min 后 ， 将 DNA 模 板 扩 增 35 个 循 环 。 每 个 循环 包 括 95℃变 性 步 骤 45 s， 55℃退 火 步 骤 45 s， 72℃延 伸 步 骤 1.5 min。 最 后 包 括 最 后 的 延 伸 步 骤 72℃, 10min。 将 等 份 的 4 μL 扩 增 产 物 在 1 w/v琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 ， 随 后 用 溴 化 乙 锭 染 色 PCR 产 物 。 使 用 PCR纯化试剂盒 Sangon Co., Shanghai, China根据说明纯化单个 DNA 条带的 PCR 产物。纯化的 PCR 产物交给上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 进 行 DNA 片 段 的 双 向 测 序 。 在 组 装 和 编 辑 序 列 文 件 时 使 用 DNAMAN 4.0Lynnon-BioSoft, Ontario, Canada构 建 共 有 序 列 。 将 ITS 和 18S rDNA 序 列 提 交 至 NCBI 上 的 GenBank 数 据库 。 为了研究分离病原菌的进化关系。将保存在 GenBank https//www.ncbi.nlm.nih.gov/中的序列，并使用BLAST 搜索与已在 NCBI 数据库中找到的序列进行比较。从 GenBank 数据库下载参考已分离出病原菌的ITS 和 18S rDNA 序 列 。 使 用 Clustal X Thompson et al., 1997比 对 序 列 。 使 用 MEGA6.0 Tamura et al., 2013通 过 neighbor-joining 法 www.me-进 行 系 统 进 化 树 分 析 。 Bootstrap 值 从 1 000 次bootstrap 重 复 获 得 。 为 了 比 较 本 研 究 中 所 获 得 的 真 菌 序 列 ， 来 自 NCBI 数 据 库 中 不 同 物 种 的 25 个Pestalotiopsis sp.的被用于此次分析。作 者 贡 献宁 志 怨 和 兰 伟 是 本 研 究 的 实 验 设 计 和 实 验 研 究 的 执 行 人 ； 伊 兴 凯 和 董 玲 完 成 数 据 分 析 和 论 文 初 稿 的 写作 ； 黄 锡 桂 和 钱 小 强 参 与 实 验 设 计 ， 试 验 结 果 分 析 ； 兰 伟 是 项 目 的 构 思 者 及 负 责 人 ， 指 导 实 验 设 计 ， 数 据分 析 ， 论 文 写 作 与 修 改 。 全 体 作 者 都 阅 读 并 同 意 最 终 的 文 本 。致谢 本研究由安徽省科技厅国际科技合作项目 1604b0602013、安徽省 2017 年公益性技术应用研究联动计划项目 1704f0704071和安徽省农业科学院特色小浆果资源研究与利用创新团队 18C0308共同资助资助。参 考 文 献Chamorro M., Aguado A., and De los Santos B., 2016, First report of root and crown rot caused by Pestalotiopsis clavisporaNeopestalotiopsis clavispora on strawberry in Spain, Plant Disease, 1007 1495Cubero O.F., Crespo A., Fatehi J., and Bridge P.D., 1999, DNA extraction and PCR amplification suitable for fresh,herbarium-stored, lichenized, and other fungi, Plant Syst. Evol., 2163-4 243-249Feng Y.R., Liu B.S., and Sun B.B., 2014, First report of leaf blotch caused by Pestalotiopsis clavispora on rosa chinensis in China,Plant Disease, 987 1009-1009Gardes M., and Bruns T.D., 1993, ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-Application to the identification ofmycorrhizae and rusts, Molecular Ecology, 22 113Glass N.L., and Donaldson G.C., 1995, Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes fromfilamentous ascomycetes,Appl. Environ. Microb., 614 1323-1330Gonzlez P., Alaniz S., Montelongo M.J., Rauduviniche L., Rebellato J., Silveraprez E., and Mondino P., 2012, First report ofPestalotiopsis clavispora causing dieback on blueberry in Uruguay, Plant Dis., 966 914Ismail A.M., Cirvilleri G., and Polizzi G., 2013, Characterisation and pathogenicity of Pestalotiopsis uvicola and Pestalotiopsisclavispora causing grey leaf spot of mango Mangifera indica L. in Italy, Eur. J. 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