蔬菜幼苗叶面积快速测定方法筛选与优化.pdf

day in January，were 11.4 ℃ and 4.9 ℃ higher than that of outside greenhouse，respectively．These conditions could satisfy the growth of semi-cold tolerant vegetable varieties．In Wuhan cold air activities were frequent in early spring．During 50 years from 1951-2016 owing to fewer sunny days and more cloudy days，it was already late March or even late when the temperature was stably over 10 ℃．So it was very difficult to rise the temperature inside of the greenhouse．And it was also difficult to meet the requirement of warm-season vegetables for warm temperature．But in autumn，the sky was clear and air was crisp．And over 75 of the years from 1951-2016， owing to more sunny days and less cloudy days，winter set in basically later than November 16th．This condition was favorable for temperature rising in greenhouse and suitable for developing late autumn vegetable production． So we suggest that it is necessary to adjust the greenhouse vegetable production by reducing the ratio of warm- season vegetables proportion in spring and increasing the plantation of late autumn solanaceous vegetables. Key wordsWuhan region；Climate characteristics；Greenhouse vegetable；Vegetable cultivation 蔬菜幼苗叶面积快速测定方法筛选与优化 潘铜华 王云龙 杨俊伟 习林杰 丁娟娟 张 静 *邹志荣 （西北农林科技大学园艺学院，农业部西北设施园艺工程重点实验室，陕西杨凌 712100） 摘 要为得到一种快速且准确测定蔬菜幼苗叶面积的方法，以番茄幼苗为试材，以方格法为对照，研究扫描分析法、叶面 积仪法、打孔称重法测定叶面积的准确性、精确性与测定速度，然后采用黄瓜、辣椒叶片及纸片的面积对测定结果进行验证， 最后基于不同扫描分辨率对筛选出的方法进行优化。结果表明，相比叶面积仪法和打孔称重法，扫描分析法测定结果更接近 真实值，且精度更高，用时更短。扫描分析法不同分辨率下测定结果无显著差异，且扫描分辨率越低所需测定时间越短。扫 描分辨率50 dpi下的扫描分析法可作为一种快速准确测定蔬菜幼苗叶面积的方法。 关键词蔬菜幼苗；叶面积；扫描分析法；准确性；精确性；筛选；优化 前，测定叶面积的方法有很多种，如方格法、剪纸 称重法、公式回归法、叶面积仪法、光电法、数值 图像处理法、打孔称重法等（王颖 等，2016） 。不 同的方法各有利弊，需进行综合评判（高建昌 等， 2011；崔世钢和秦建华，2017） 。相比较而言，方 格法具有工作量大、耗时长的缺点，但是结果较接 近真实值，常用于对其他测定方法所得结果进行校 正（柳觐 等，2014；李乐 等，2016） 。剪纸称重法 测得结果受叶片形状及人为因素的影响较大，同时 受纸片均匀度影响（崔世钢和秦建华，2017） 。打 孔称重法操作比较简单，省时省力，但是结果重复 性较差，且误差较大（王留梅 等，2001） 。叶面积 仪法操作简单，但因其扫描方向与速度等受人为因 素影响很大，难以实现匀速，误差较大（孙岚和马 潘铜华，男，博士研究生，专业方向设施植物生理生态，E-mail *通讯作者（Corresponding author）张静，女，博士，高级实验师，专 业方向设施园艺，E- 收稿日期2018-04-27；接受日期2018-06-19 基金项目陕西省果业项目（2017GYZX11） ，国家林业局保护司项目 （K3130216011），陕西省科技计划项目（2017ZDXM-NY-057） 叶片是植物进行光合作用及蒸腾作用的重要场 所（曹仪植和宋占午，1998；乔宝营 等，2004；赵 滢 等，2012） ，叶面积大小是表征叶片光合能力、 蒸腾能力、逆境胁迫程度、植株生长状态以及预测 植株生产力的重要指标（Steinger et al.，2003；田 青 等，2008） 。叶面积大小的精准快速测定，对于 指导栽培管理、实现水肥管理优化、高产高效具 有重要意义（陈卓 等，2010；盛双 等，2011）。目 64 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 64 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（8）64 - 69 德伟，1985） 。光电法、数字图像处理法等操作较 简单，但对操作技术要求较高，对于叶缘不规则的 叶片难以捕捉其形状；同时，测定结果受拍照角 度、叶片大小、叶片形状等多因素以及拍照技术、 AutoCAD、Matlab、PS操作技术等的影响，且这些 软件操作对于较多叶片的测定比较费时（肖强 等， 2005；田青 等，2008；张万红 等，2017）。随着科 技的不断发展、仪器设备的不断改进，采用高端仪 器快速准确测定叶面积是今后的一种发展趋势（刘 关君 等，2004；孙雪文 等，2005）。 本试验采用EPSON平台扫描仪结合 WinRHIZO根系分析系统测定番茄幼苗叶面积，比 较其与常规叶面积测定法（方格法、打孔称重法、 叶面积仪法）测定结果的准确性、精确性与测定速 度，并用不同材料进行验证，最后对筛选出的最佳 方法进行优化。旨在得到一种准确、精度高且快捷 的蔬菜幼苗叶面积测定方法，为植物生理生态研究 及栽培管理提供理论参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验于2018年3～4月在西北农林科技大学北 校园艺场及人工气候室内进行。供试材料为金棚1 号番茄、早春2号黄瓜和碧螺6号辣椒，由杨凌裕 丰农业科技有限公司提供。蔬菜幼苗种植于西北农 林科技大学北校园艺场日光温室中，在四叶一心时 取样进行不同方法叶面积测定与综合评价。 1.2 主要仪器设备 爱普生扫描仪及WinRHIZO根系分析系统 （EPSON Perfection V700 Photo，Canada regent， Canada）、AM200叶面积测定仪（AM200，ADC BioScientific Ltd.，Hoddesdon，England） 、HYZ-71 计算纸（HYZ-712，上海顶峰绘图纸厂） 、千分之 一天平（JD100-3，沈阳龙腾电子有限公司）。 1.3 试验方法 分别剪取四叶一心的番茄、黄瓜及辣椒叶片若 干片放在托盘中，盖上湿润的纱布，防止叶片萎蔫 收缩。依次采取方格法、叶面积仪法、扫描分析法 及打孔称重法对随机选取的4片番茄叶片进行叶面 积测定，每个方法重复测定5次，计算平均值及标 准误。同时记录5次测定的总时间，比较4种方法 测定叶面积的用时长短。为尽量减少外界环境对试 验结果造成的影响，在测定过程中，通过空调、加 湿器控制，使室内温度控制在20℃左右，空气湿 度控制在60～70。 方格法测定前用吸水纸吸干叶片表面水分， 将叶片正面朝下平铺于25 cm35 cm大小的计算 纸上，然后用三角板压住一半，用铅笔小心绘制另 一半的边缘轮廓，绘制完毕后，用手固定，并用 三角板压住，绘制另一半的边缘轮廓。每两次测 定间隙用湿毛巾擦拭叶片保持叶片湿润，绘制完立 即用湿毛巾覆盖，以防叶片萎蔫。所有叶片统一进 行绘制。 叶面积仪法采用ADC公司生产的AM200型 便携式平板叶面积仪，将叶片正面朝上，夹在平板 叶面积仪的扫描区及透明压板之间，通过调节扫描 器左边的黑色旋钮，使测得叶片长度尽量接近叶片 实际长度，按住“start”，匀速缓慢扫描叶片，当整 个叶片扫描完毕，再按一次“start”停止扫描，得 出叶面积。 扫描分析法首先将叶片正面朝上平铺于扫 描区域，选择扫描像素为200 dpi（高建昌 等， 2011）；然后选择“preview”预扫描叶片，用适宜 大小的虚线框框住预扫描图，选择“scan”进行扫 描，扫描结果以JEPG图片格式保存。最后，插入 根系分析仪电子狗，双击WinRHZIO软件，打开扫 描图片，用虚线框框住图片，单击“OK” ，得出测 定结果，建立一个text文件保存结果。 打孔称重法采用直径1 cm的打孔器获得8 个小圆片，称取单个小圆片的质量，然后通过整片 叶片的质量与单个小圆片的平均质量相比，换算出 叶片的叶面积。 方法验证与优化采用方格法和扫描分析法对 黄瓜叶片、辣椒叶片及已知面积的长方形纸片进行 测定，试验设5次重复，验证扫描分析法测定结果 的准确性。对扫描分析法的不同分辨率（50、96、 150、200、300、400、600、800、1 200 dpi）下黄 瓜叶面积的单次测定结果进行比较分析，并对准确 性、精确性、所需时间等进行综合比较，筛选最佳 扫描分辨率。 1.4 数据处理 采用Excel 2007和DPS 7.05统计分析软件进行 65 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 65 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 图 1 不同叶面积测定方法对番茄叶片的测定结果比较 图柱上不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下图同。 1号叶 2号叶 3号叶 4号叶 叶面积／cm 2 40 30 20 10 0 方格法 b b b b b d b b c c c c a a a a 叶面积仪法 扫描分析法 打孔称重法 图 3 蔬菜幼苗叶面积扫描分析法测定结果验证 方格法 扫描分析法 a b a b 黄瓜 辣椒 50 40 30 20 10 0 叶面积／cm 2 数据处理、方差分析与显著性检验（Duncan新复 极差法），采用Excel 2007软件作图。 2 结果与分析 2.1 不同测定方法的准确性与精确性比较 由图1可知，与方格法相比，叶面积仪法 测定的数据显著偏低（平均降低12～16） ， 而打孔称重法测定值则显著升高（平均升高 4.2～12.9）。采用扫描分析法，除了2号叶的 测定值显著低于方格法以外，其余叶片测定值与方 格法无显著差异。通过分析测得的标准误可知，打 孔称重法测得值与平均值之间偏离程度最大，叶面 积仪法次之，而方格法与扫描分析法测定结果偏离 平均值程度较小，说明扫描分析法和方格法的精度 高，结果可重现性更好。同时，相比叶面积仪法和 打孔称重法，扫描分析法测定值更接近真实值，可 以用于准确测定叶面积。 2.2 不同测定方法的用时比较 不同叶面积测定方法5次测定所需时间差异 显著（图2） 。方格法所需时间最长（5 205 s） ，叶 面积仪法次之（690 s），而扫描分析法（498 s）和 打孔称重法（468 s）用时最少。综合比较测定结 果准确性（图1）和所需时间（图2） ，扫描分析 法是一种快速、准确且精度高的幼苗叶面积测定 方法。 2.3 叶面积测定方法验证 2.3.1 黄瓜与辣椒叶片验证 由图3可知，采用扫 描分析法，黄瓜和辣椒叶片叶面积测定值均显著低 于方格法，分别降低了2.59和5.56。扫描分析 法的标准误低于方格法，说明扫描分析法测得的数 图 2 不同叶面积测定方法 5次测定用时比较 方格法 叶面积仪法 扫描分析法 打孔称重法 cc b a 6 000 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 0 时间／s 据精度更高，结果比较可靠。 2.3.2 使用已知面积纸片验证 用信封随机剪取10 个不同面积的长方形纸片，用直尺准确测定长和宽 并计算面积，再用扫描分析法进行测定。由表1可 知，扫描分析法测定结果与直尺测定值之间的误差 为-2.14～3.02，处于5之间，数据可靠， 说明扫描分析法的测定结果接近真实值，可用于准 确、快速测定叶面积。 66 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 66 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2.4 扫描分析法中不同 dpi设置的测定时间及测定 结果比较 本试验结果表明，扫描分析法可以快速、准确 测定番茄、黄瓜及辣椒叶片的叶面积。以上结果是 在扫描分辨率为200 dpi的条件下所得（高建昌 等， 2011） 。扫描分辨率是决定扫描仪获得像素数量的 重要因素，分辨率的高低可能对测定面积存在影响 （李宝光 等，2006；高建昌 等，2011） 。不同扫描 分辨率条件下，扫描时间、扫描结果可能不同。由 图4-A可知，扫描分辨率越高，扫描及分析所需 时间越长，其中dpi为50与96时所需时间最短， 分别为40.9 s和44.5 s，二者无显著差异，而96 dpi 下测得的变异系数更大，50 dpi下的测定时间比较 稳定。150 dpi与200 dpi的所需时间显著高于前两 者。由图4-B可知，不同扫描分辨率下测定结果无 显著差异。因此，扫描分析法中50 dpi的扫描分辨 率即可快速、准确测定叶面积。 3 讨论 蔬菜幼苗叶面积大小是表征植株长势强弱的一 项重要指标（王颖 等，2016） 。通常情况下，由于 幼苗叶片较软较薄，且叶面不平，准确快速测定叶 面积难以实现。方格法作为一种经典的叶面积测定 方法，测定结果比较接近真实值，常用于对其他测 定方法的结果进行验证（柳觐 等，2014；李乐 等， 2016） 。因此，本试验选用方格法作为参考，比较 几种方法与方格法测定值间的差距。叶面积仪法 （宋 卫堂 等，2017；王京伟 等，2017）、打孔称重法（朱 艳 等，2017）是目前测定幼苗叶面积较为常用的 方法。本试验比较了叶面积仪法、扫描分析法和打 孔称重法测定叶面积的准确性与精确性，并比较了 这些方法的操作简便性，可为选择适宜的叶面积测 定方法提供参考。 本试验发现，采用叶面积仪法测定的结果显著 低于方格法，可能是由于幼苗叶面积较小，导致操 作平板叶面积仪时难以做到匀速，叶片难以完全扫 描的缘故（孙岚和马德伟，1985） 。而打孔称重法 测定的叶面积显著高于方格法，可能是由于幼苗叶 脉的密度显著高于叶肉密度，且越靠近叶脉，叶片 厚度增加，密度增大，使得小圆片的密度小于平均 叶密度。本试验还发现，叶面积仪法测定时间显著 高于扫描分析法，是因为叶面积仪法测定叶面积时 受主观因素影响更大，需要不断调整明暗程度及手 推速度以使测得叶长尽量接近实际叶长。本试验以 黄瓜和辣椒叶片为例，验证扫描分析法的可靠度。 结果发现，测得的辣椒叶片叶面积比方格法降低了 5.56，可能是由于辣椒叶片叶面积明显小于黄瓜 （前者叶面积约为后者的19.05） ，导致同样或较 小的绝对误差引起了更大的相对误差。由于采用方 格法测定叶面积也很难测得真实值，而纸片形状规 则、不易变形的特点更利于真实值的测定，因此， 表 1 基于不同面积纸片的扫描分析法测定结果验证 编号 直尺测定值/cm 2 扫描分析法测定值/cm 2 误差/ 1 31.16 30.87 -0.92 2 52.44 52.73 0.55 3 85.81 84.35 -1.69 4 105.64 104.69 -0.90 5 127.57 124.82 -2.14 6 132.60 134.08 1.12 7 146.31 150.72 3.02 8 192.50 191.20 -0.68 9 218.90 218.43 -0.21 10 240.90 238.95 -0.81 600 500 400 300 200 100 0 时间／s a a a a a a aaa a b f f g g e d c 40 30 20 10 0 黄瓜叶面积／cm 2 50 96 150 200 300 400 600 8001 200 图 4 不同扫描分辨率下单次测定所需时间（ A）及单个叶 片测定结果（B）比较 dpi设置 A B 67 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 67 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 本试验进行了基于不同面积纸片的扫描分析法结果 验证。测得结果与真实值间的误差小于黄瓜或辣椒 叶面积验证过程的误差，可能是由于方格法测定过 程中下压叶片的幅度远大于扫描时幅度，导致方格 法测得结果大于自然状态下叶片叶面积，从而使黄 瓜和辣椒验证得到的误差绝对值高于理论值，这也 从另一方面说明了扫描分析法结果的准确性。 在结果可靠的基础上，测定用时也是评价测定 方法优劣的一个重要指标。本试验发现，不同扫描 分辨率下的测定结果无显著性差异。随着扫描分辨 率的增加，所用时间逐渐增加，这可能是由于较大 的扫描分辨率使扫描图片所占磁盘空间更大，导致 电脑运行速度减慢，与前人的研究结果一致（李宝 光 等，2006） ，说明扫描分辨率设定越小越有利于 快速准确测定叶面积。 目前，测定植株叶面积的方法有多种（王颖 等，2016） 。受试验样品（如叶片大小、叶片是否 规则、是否野外操作等）（苑克俊和孙瑞红 1994）、 设备条件（设备价格、手持灵活性等） （宋英博 等， 2015） 、试验目的（高精度测定或粗略估计、是否 破坏性取样） （肖强 等，2005）等的影响，所选用 的叶面积测定方法不尽一致（柏军华 等，2005） 。 因此需要根据试验目的及试验设备的易得性，选取 合适的叶面积测定方法。通常，对于面积比较大的 叶片以及只需快速粗略测定叶片面积时，建议采取 打孔称重法（乌兰 等，2015） 。对于设备比较简陋 或是缺乏高端设备（如叶面积仪、高端数码仪器）、 样品面积较小且对结果要求比较精确时，可采取 公式回归法（王颖 等，2016） 。对于叶面积很小且 要求快速测定、对试验结果要求不太精确时，可 采用叶面积仪法（Qian et al.，2012；Zhang et al.， 2015） 。对于条件充足且对测定结果要求非常精确 的科研工作者，可选用高端仪器设备（如数码相机、 扫描仪）与先进的数据分析软件（如ImageJ、PS、 CAD、Matlab、根系分析仪等）进行快速且精确的 蔬菜叶面积测定（高建昌 等，2011；于守超 等， 2012；赵滢 等，2012；Shu et al.，2014；张万红 等， 2017） 。方格法作为一种最经典、最准确的叶面积 测定方法，由于其操作的繁琐性，通常只用于标定 其他方法的准确性，而不建议用于实际的叶面积 测定。 4 结论 不同叶面积测定方法所需时间、测得结果的准 确性和精度均存在差异。相比方格法、叶面积仪法 和打孔称重法，扫描分析法兼具准确性高、精度高 且用时短的优点。扫描分析法不同扫描分辨率下测 定的叶面积无显著差异，且选择更低扫描分辨率测 定所需时间更少，结果可靠。采用50 dpi扫描分辨 率测定蔬菜幼苗叶面积，结果可靠、精度高、用时 最少，可作为测定蔬菜幼苗叶面积的首选方法。 参考文献 柏军华，王克如，初振东，陈兵，李少昆．2005．叶面积测定方法 的比较研究．石河子大学学报自然科学版，23（2） 216- 218． 曹仪植，宋占午．1998．植物生理学．兰州兰州大学出版社 144-155． 陈卓，张笑千，张冠宇，韩东海，曲英华．2010．番茄叶片几何特 征的提取与分析．北方园艺，（15）144-146． 崔世钢，秦建华．2017．图像处理法测定油菜叶面积的研究．湖北 农业科学，56（14）2756-2757，2767． 高建昌，郭广君，国艳梅，王孝宣，杜永臣．2011．平台扫描仪结 合ImageJ软件测定番茄叶面积．中国蔬菜，（2）73-77． 李宝光，陶秀花，倪国平，黄冬华，宋小民．2006．扫描像素法测 定植物叶面积的研究．江西农业学报，18（3）78-81． 李乐，钟迪，贾宝军，胡靖扬，刘常富，于立忠．2016．蒙古栎叶 面积的数字图像法测定．西北林学院学报，31（6）96-103． 刘关君，王大海，郭晓瑞，杨传平，姜静，冯昕．2004．植物 叶面积的快速精确测定方法．东北林业大学学报，32（5） 82-83． 柳觐，倪书邦，宫丽丹，孔广红，贺熙勇．2014．澳洲坚果叶面积 测定方法比较．中国农学通报，30（25）142-147． 乔宝营，黄海帆，张信栓，马彩霞，李道德．2004．草莓叶面积简 易测定方法．果树学报，21（6）621-623． 盛双，王国聪，颜权，韦丝丝，秦元丽，杨振德，何日广．2011． 大叶桉叶面积测定方法的比较研究．广西林业科学，40（2） 140-142． 宋卫堂，李晨曦，孙旭光，王平智，赵淑梅．2017．散射膜日光温 室中种植垄向对番茄生长和产量的影响．农业工程学报，33 （24）242-248． 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（College of Horticulture，Northwest AF University，Key Laboratory of Protected Horticulture Engineering in Northwest China，Yangling 712100，Shaanxi，China） AbstractIn order to obtain a rapid and accurate leaf area measurement for vegetable seedlings， this study took tomato seedlings as material and square as the contrast，studied the accuracy，precision and determining speed of 3 leaf area measurement s，including scanning and analysis，leaf area meter and leaf punch weighing. Afterwards，the obtained results were verified by cucumber leaves，pepper leaves and scraps of paper. Finally based on varying scanning dpi levels，the screened s were optimized. The results showed that comparing with the leaf area meter and leaf punch weighing ，data obtained from scanning and analyzing was closer to the real value with higher precision and less time consuming. Meanwhile，there was no significant difference among results of scanning and analyzing under different resolutions，while less time needed for lower resolution. Therefore，the scanning and analyzing of 50 dpi resolution can be used as a rapid and accurate leaf area measurement for vegetable seedlings. Key wordsVegetable seedling；Leaf area；Scanning and analyzing ；Accuracy；Precision； Screening；Optimization 69 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 69 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES