葡萄灰霉病优势拮抗细菌的筛选与鉴定.pdf

p２ 018 年第 1期 CＨIＮA PLAＮＴ PROＴECＴIOＮ ２0 18,Ｖｏl. ３8 .Ｎｏ. 1 葡萄灰霉病是由灰葡萄孢 （ Botrytis cinerea Pers . ） 通过侵染葡萄叶片 、 新鞘 、 花穗 、 果实等导致的 一种真菌病害 。 其产孢量大 、 寄主范围广 ［ 1 ］ ， 是葡萄 生产中的主要病害之一 ［ 2 ］ ， 每年因灰霉病造成的损 失在 20以上 ［ 3］ 。 目前 ， 葡萄灰霉病仍以化学防治为 主 ， 存在农药残留 、 环境污染以及抗药性等问题 ［ 4-7］ 。 生物防治具有安全 、 无污染 、 无抗药性等优势 ， 已成 为葡萄灰霉病防治的研究热点 ［ 8］ 。 利用拮抗菌防治 灰霉菌已有广泛研究的报道 ［ 9-11 ］ 。 但关于葡萄灰霉 病果穗附生拮抗菌筛选 、 鉴定的研究较少 。 本研究从 葡萄中抗品种 “ 红地球 ” 果穗中分离附生细菌的拮抗 试验中 ， 筛选出葡萄灰霉病优势拮抗菌 ， 并进行生理 葡萄灰霉病优势拮抗细菌的筛选与鉴定 崔 欣 1 ， 李 伟 2 ， 朱建兰 3 （ 1. 长春科技学院生物食品学院 ， 吉林长春 130600； 2. 长春长东北开放开发先导区 （ 长德新区 ） 管理委员会 ， 林长春 130000 ； 3. 甘肃农业大学草业学院 ， 甘肃兰州 730070 ） 摘要 以葡萄灰霉病病菌为供试菌 ，采用平板对峙法 ， 研究了葡萄果穗附生细菌对葡萄灰霉病的拮抗效果 。 同时 ， 进 行生理生化 、 16S rDNA 序列鉴定与同源性分析 。 结果表明 ， 在分离得到的 13株附生细菌中 ， 其中 11株对葡萄灰霉 病有不同程度的拮抗作用 ， 且拮抗菌的保护作用优于治疗作用 。 其中 ， B5和 B12对葡萄灰霉病病菌孢子的抑菌率均 为 100，对葡萄灰霉病病菌菌丝的抑菌率分别为 14 . 49和 15. 17，显著高于其他拮抗菌 （ P ＜ 0. 05）。 B5、 B12菌株具 有良好的拮抗和离体抑制效果 ， 拮抗菌鉴定与同源性分析结果表明 ， B5属于芽孢杆菌属 ， B12属于枯草芽孢杆菌 。 关键词 葡萄 ； 灰霉病 ； 拮抗菌 ； 筛选 ； 鉴定 中图分类号 S432.1 文献标识码 A 文章编号 1672-6820（ 2018 ） 01-0012-05 Seleｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄeｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ｔｏ Botrytis cinerea Cui Xin 1 , Li Wei 2 , Zhu Jianlan 3 （ 1.College of Biological and Food, Changchun Sci -Ｔech University, Changchun Jilin 130600, China; 2. Changchun long Northeast Open Development Pilot Area Ｍanagement Committee, Changchun Jilin 130000, China; 3.College of Pratacultural, Gansu Agricultural University, Lanzhou Gansu 730070, China ） Aｂｓｔｒａｃｔ Antagonistic effect of adnascent bacteria isolated from grape fruit scion to Botrytis cinerea was studied by plate confrontation . Physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence of these antagonistic bacteria were determined and analysed. Ｔhe results showed that 11 strains among 13 isolated bacteria strains had certain function of antagonism against B. cinerea , with more protection function than cure function. Inhibitory rates of B5 and B12 against the conidia germination were both 100, and those against hyphae were 14.49 and 15.17, respectively, which were higher than those of other strains significantly （ P ＜ 0.05）. B5 and B12 had better inhibiting and antagonistic effect in vitro. Based on antagonistic bacterium identification and homology analysis, B5 strain belonged to Bacillus sp., and B12 strain belonged to B. subtilis. Keｙ wｏｒｄｓ grape; Botrytis cinerea ; antagonistic bacterium; selection; identification 收稿日期 2017-07-05 ； 修回日期 2017-11-08 基金项目 长春科技学院青年科研启动基金 （ 2014CK0642） 作者简介 崔欣 ， 硕士 ， 讲师 ， 研究方向为园林植物配置研究及病害防治 。 Ｅ - mail cuixin1982yeah .net * 通讯作者 朱建兰 ， 博士 ， 教授 ， 研究方向为病虫害生物防治 。 Ｅ - mail zhujlgsau .edu .cn 。 12 ２ 018 年第 1 期 CＨIＮA PLAＮＴ PROＴECＴIOＮ ２0 18 ,Ｖｏl. ３8 .Ｎｏ. 1 生化和分子生物学鉴定 ， 以期为葡萄灰霉病生物防 治产品的开发提供参考 。 1 材料与方法 1 .1 试验材料 葡萄中抗品种红地球采摘于甘肃省农业科学院 葡萄园 。 灰霉病菌种来自感染灰霉病的红地球葡萄 病果果穗上分离所得 ， 按柯赫氏法则进行纯化 ， 经甘 肃农业大学草业学院实验室鉴定为半知菌亚门灰葡 萄孢属的灰葡萄孢 （ Botrytis cinerea Pers . ）。 PDA 培 养基配制 马铃薯 200 g ， 葡萄糖 20 g ， 琼脂 20 g ， 蒸 馏水 1 000 mL 。 1 .２ 试验方法 1 .２ .1 附生细菌平板对峙试验 采用复式筛选法 ［ 1 2］对葡萄果穗附生菌进行分离 筛选 ， 经过平板粗筛和二次筛选 ， 分离得到具有拮抗 作用的拮抗菌 ， 并根据菌落直径计算抑菌率 。 抑菌率 （ ） ［（ 对照菌落直径 -致病菌菌落的直 径 ） /对照菌落直径 ］ 100 1 .２ .２ 灰霉病孢子萌发和菌丝生长的抑制试验 取葡萄灰霉病孢子悬浮液 （ 1 10 7 个 /mL ） 10 μ L， 加 10 μ L拮抗菌发酵液 ， 以 0.5葡萄糖液作对 照 ， 置无菌洁净载玻片上 ， 25 ℃ 培养 8 h 后观察孢 子萌发 ， 计算拮抗菌发酵液对病菌孢子萌发的抑制 率 ； 取灰霉病菌孢子悬浮液 0.5 mL 加入 PDA 培养 基中 。 将直径为 5 mm 灭菌滤纸片蘸上发酵液 ， 以无 菌水作对照 ， 25 ℃ 培养 3 d 后测量抑菌圈直径 ， 计 算拮抗菌发酵液对菌丝生长的抑制率 ［ 13 ］ 。 抑制率 （ ） ［（ 对照病斑直径 -处理病斑直径 ） / 对照病斑直径 ］ 100 1 .２ .３ 离体果防治试验 选取大小 、 成熟度一致的红地球葡萄果实 ， 每个 处理为 30 个果粒 ， 随机分为 5个处理 。 拮抗细菌发 酵液 （ 1 10 8 cfu/mL ） 组分为 2个处理 一个先刺伤果 皮接灰霉病菌的菌饼 （ 5 mm ）， 24 h 后喷拮抗菌发酵 液 ； 另一处理先喷拮抗菌发酵液 ， 24 h 后刺伤果皮 接灰霉病菌的菌饼 ； 拮抗细菌菌悬液 （ 1 10 8 cfu/mL ） 组分为 2个处理 先刺伤果皮接灰霉病菌的菌饼 ， 24 h 后喷拮抗细菌 ； 另一个处理先喷拮抗菌菌悬液 ， 24 h 后刺伤果皮接灰霉病菌的菌饼 ； 以喷无菌水对照 处理 。 在 27 ℃ 条件下 ， 处理 3 d ， 计算葡萄灰霉病病 情指数和相对抑制率 ［ 14 ］ 。 病情指数 ［∑ （ 各级病果粒 相对级数值 ） /调查 总果粒数 9］ 100 相对抑制率 （ ） ［（ 对照病情指数 -处理病情指 数 ） /对照病情指数 ］ 100 1 .２ .4 拮抗菌形态学鉴定 参照 常见细菌系统鉴定手册 ［ 15 ］进行菌落形态 和培养特征观察 ， 革兰氏染色后观察菌体形态 。 1 .２ .5 分子生物学鉴定 采用苯酚 /氯仿抽提法提取细菌 DNA ， 利用上 游引物 5’-GAGCGGAＴAACAAＴＴＴCACACAGG -3’， 下游引物 5’-CGCCAGGGＴＴＴＴCCCAGＴCACGAC -3’ 进行 16S rDNA 序列扩增 。 反应体系总体积 50 μ L 模板 DNA 1 μ L， 上下游引物各 1 μ L， 10 buffer 5 μ L， ＭgCl 2 5 μ L， dNＴP 2 μ L， Taq DNA Polymerase 0 .25 μ L， ddH 2 O补足至 50 μ L。 扩增条件 94 ℃ 预变 性 5 min ， 94 ℃ 变 性 10 s ， 54 ℃ 退火 10 s ， 72 ℃ 延伸 1 min ， 35个 循环 ， 最 后 72 ℃ 延伸 7 min 。 PCR 产 物经 1琼脂糖 凝胶电泳检 测后 ， 采用 凝胶回收试剂盒 进 行 回收与 纯化 。 将 PCR 产 物 送 至 宝 生物 工程 （ 大 连 ） 有 限公司 测序 。 测序 结 果 与 Genebank 已 知序列进行 对 比 ， 利用 mega 构建 系统进化 树 。 ２ 结果与分析 ２ .1 附生细菌对峙试验结果 从 葡萄病果果穗上分离的附生细菌中得到 13 株 拮抗菌 ， 其 平板对 峙试 验 结 果见 表 1 。 从 分离 出 的 拮抗细菌中 ， B9和 B13 对葡萄灰霉病 没 有拮抗作 用 ； 其余 11 种菌对灰霉病 均 有拮抗作用 ， 抑菌率 均 大于 20 ； B5、 B12 对灰霉病的拮抗作用 最强 ， 显著 高 于 其他 拮抗菌 （ P ＜ 0.05 ）； B4 抑菌率 最低 ， 为 16.11 。 ２ .２ 拮抗细菌对葡萄灰霉病病菌孢子萌发和菌丝 生长抑制效果 从 分离的附生细菌中筛选 出 的 11 株 拮抗细菌 ， 对葡萄灰霉病孢子萌发和菌丝生长抑制 试 验 结 果 显 示 ， 菌 株 B12 、 B5对葡萄灰霉病孢子萌发的抑制率 均 为 100 ， 其 对葡萄灰霉病病菌丝生长抑制率分 别 为 15.17和 14.49 ， 显著高 于 其他 拮抗菌 株 （ P ＜ 0.05）； 13 ２ 018 年第 1 期 CＨIＮA PLAＮＴ PROＴECＴIOＮ ２0 1 8,Ｖｏl. ３8 .Ｎｏ. 1 菌株编号 抑菌率 （ ） B5 （ 55.230 1.77） a B12 （ 53.140 2.39） a B11 （ 43.600 2.18） b B1 （ 42.870 1.33） b B3 （ 38.950 2.03） bc B10 （ 38.590 1.54） bcd B2 （ 35.600 1.03） cd B8 （ 34.800 1.32） cd B7 （ 33.040 1.16） d B6 （ 20.640 0.87） e B4 （ 15.130 0.42） e B9 （ 0.003 0.40） f B13 （ 0.003 0.40） f 表 1 葡萄附生细菌拮抗菌葡萄灰霉病病菌平板对峙试验 1） 1） 不同小写字母表示差异显著 （ P ＜ 0.05）。 菌株编号 孢子抑制率 （ ） 菌丝抑制率 （ ） B12 （ 100.00 1.12） a （ 15.17 0.35） a B5 （ 100.00 1.05） a （ 14.49 0.45） a B1 （ 100.00 0.95） a （ 9.67 0.31） bc B11 （ 100.00 1.06） a （ 8.22 0.28） cd B10 （ 99.84 1.98） a （ 10.61 0.19） b B3 （ 97.17 2.01） ab （ 8.56 0.30） bcd B8 （ 93.84 0.95） bc （ 7.33 0.15） cd B2 （ 90.50 2.03） cd （ 6.31 0.19） de B7 （ 86.84 2.48） d （ 5.55 0.20） e B6 （ 73.67 3.01） e （ 5.55 0.17） e B4 （ 70.67 2.00） e （ 5.55 0.24） e 表 ２ 葡萄附生拮抗细菌对葡萄灰霉病病菌孢子 和菌丝的抑制率 1） 1） 同列数据后母不同小写字母表示差异显著 （ P ＜ 0.05）。 菌株 编号 发酵液 菌悬液 先接病菌 后接病菌 先接病菌 后接病菌 病情指数 相对抑制 率 （ ） 病情指数 相对抑制 率 （ ） 病情指数 相对抑制 率 （ ） 病情指数 相对抑制 率 （ ） B1 （ 41.48 2.26） g 53.34 （ 32.22 0.69） g 63.75 （ 47.41 1.36） e 46.66 （ 34.44 1.26） g 61.26 B2 （ 54.80 1.76） de 38.34 （ 45.19 1.35） de 49.16 （ 61.85 2.36） c 30.42 （ 48.52 2.64） e 45.42 B3 （ 55.60 3.18） de 37.50 （ 43.70 1.44） e 50.84 （ 59.26 3.04） c 33.33 （ 49.63 1.66） e 44.17 B4 （ 67.41 2.23） b 24.16 （ 59.26 1.58） b 33.33 （ 69.63 2.94） b 21.67 （ 62.96 1.74） b 29.17 B5 （ 33.33 1.08） h 62.50 （ 16.67 0.68） h 81.25 （ 37.04 1.53） f 58.33 （ 21.11 0.47） h 76.25 B6 （ 65.56 1.92） b 26.25 （ 50.07 1.05） c 43.67 （ 71.85 1.49） b 19.17 （ 59.26 2.68） bc 33.33 B7 （ 57.78 0.99） cd 35.00 （ 49.26 2.08） cd 44.58 （ 67.41 0.98） b 24.16 （ 55.56 1.97） cd 37.50 B8 （ 62.96 1.32） bc 29.17 （ 48.15 1.17） cde 45.83 （ 60.74 1.01） c 31.67 （ 51.85 0.95） de 41.67 B10 （ 48.15 0.87） f 45.83 （ 30.37 2.00） g 65.83 （ 48.89 1.48） e 45.00 （ 32.22 0.95） g 63.75 B11 （ 51.11 1.06） ef 42.50 （ 37.78 1.09） f 57.50 （ 53.33 2.02） d 40.00 （ 40.00 1.85） f 55.00 B12 （ 35.56 0.59） h 60.00 （ 19.26 0.67） h 78.33 （ 38.15 0.96） f 57.08 （ 24.81 0.86） h 72.09 CK （ 88.89 3.06） a 0 （ 88.89 3.06） a 0 （ 88.89 3.06） a 0 （ 88.89 3.06） a 0 表 ３ 葡萄附生拮抗细菌菌悬液与其发酵液对离体果粒上葡萄灰霉病病菌的抑菌效果 1） 1） 同列数据后不同小写字母表示差异显著 （ P ＜ 0.05）。 除 B7 、 B6 和 B4 外 ，其他拮抗菌对灰霉病孢子抑制率 均大于 90 ， B4 对其孢子抑制率最低 ； B12 、 B5 和 B10 对葡萄灰霉病病菌丝抑菌率大于 10 ， B7 、 B6 和 B4 对葡萄灰霉病病菌丝抑菌率最低 （ 表 2）。 ２ . ３ 对葡萄离体果粒灰霉病病菌的抑制效果 葡萄离体果灰霉病病菌生物抑制试验结果如表 3所示 。 相同拮抗菌条件下 ， 后接病菌处理组的病情 指数和相对抑制率明显优于先接病菌处理组 ， 拮抗 菌发酵液后接病菌处理组的病情指数和相对抑制率 优于悬浮液后接菌处理组 ； 11种拮抗菌中 ， B5 和 B12 的病情指数显著低于其他拮抗菌 （ P ＜ 0. 05）， B5 和 B12 的相对抑制率均高于其他拮抗菌 ； B4 病情指 数最高 ， 相对抑制率最低 。 对照组病情指数为 88. 89。 ２ .4 优势拮抗细菌培养特征与染色反应 优势拮抗细菌 B5 、 B12 培养特征和染色反应如 14 ２ 018 年第 1 期 CＨIＮA PLAＮＴ PROＴECＴIOＮ ２0 18 ,Ｖｏl. ３8 .Ｎｏ. 1 a b c d a. B5单菌落 b. B5革兰氏染色 c. B12单菌落 d. B12革兰氏染色 图 1 葡萄附生拮抗菌株 B5 、 B1２ 的培养性状 及革兰氏染色反应 2 000 bp 1 000 bp 2 000 bp Ｍ 1 2 Ｍ. Ｍarker DL2000 1. B5 2. B12 图 ２ 葡萄附生拮抗菌株 B5 、 B1２ ｄ 的 1６S ｒDＮA 扩增图谱 B5 Bacillus sp. （ ＥF471916.1） Bacillus subtilis . （ AB195282.1 ） B12 0.01 图 ３ 葡萄附生拮抗优势菌株 B5 、 B1２ 系统发育学地位 图 1所示 。 B5菌落圆形 ， 白色 ， 稍隆起 ， 边缘整齐 ， 中 间有小突起 ， 不透明 。 菌落大小一致 ， 直径约 2.5 mm 。 菌体杆状 ， 革兰氏染色呈阳性 （ 图 1a 、 b ）。 B12菌 落圆形 ， 灰白色 ， 隆起 ， 边缘不整齐 ， 表面光滑发亮 ， 菌落大小一致 ， 直径约 2 mm ， 革兰氏染色阳性 ， 菌体 杆状 （ 图 1c 、 d ）。 ２ .5 细菌的 16S rDNA 检测 优势拮抗菌的 16S rDNA 扩增结果如图 2所 示 。 B5和 B12分别在 1 500 bp 左右处有 1条明亮 的 PCR 特异性条带 ， 经测序片段大小为 1 465 bp 。 优势拮抗菌系统发育树如图 3所示 。 B5与芽孢 杆菌属 （ Bacillus sp . ＥF471916 .1） 亲缘关系最近 ， 同 源性为 99 ， 确定 B5属于芽孢杆菌属 （ Bacillus sp . ）； B12与枯草芽孢杆菌属 （ Bacillus subtilis . AB- 195282.1） 亲缘关系最近 ， 同源性为 100 ， 确定 B12 属于枯草芽孢杆菌 （ Bacillus subtilis ）。 ３ 结论与讨论 目前 ， 葡萄灰霉病的防治仍以化学防治为主 ， 但 化学杀菌剂容易造成农药残留 、 环境污染以及抗药 性等问题 ［ 4-7］ 。 生物防治特别是拮抗菌的开发已成 为葡萄灰霉病的研究热点 。 葡萄果实内部 、 果穗 、 叶 面等区域附生有大量的真菌 、 细菌 、 酵母菌等微生 物 ［ 1 6-17］ ， 已先后分离出了木霉菌 、 类鼻疽假单胞杆 菌 、 鼻疽假单胞杆菌 、 枯草芽孢杆菌 、 高温芽孢杆菌 、 嗜热溶胞杆菌等多种对葡萄灰霉病具有拮抗作用的 微生物 ［ 1 7-20］ 。 本研究从葡萄品种果穗中分离出了 11 种对葡萄灰霉病具有拮抗作用的细菌 ， 其中 B5、 B12 两种拮抗菌的抑菌率和离体果的抑菌效果均显著优 于其他菌株 。 经生理生化和 16S rNDA 鉴定 ， B5、 B12 分别为芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌 ， 与前人研究结 果一致 。 通过离体果的防治试验发现 ， 先喷施拮抗菌发 酵液后接种病原菌的防治效果 ， 优于先接种病原菌 而后喷施拮抗菌发酵液的防治效果 。 表明拮抗菌的 保护作用好于治疗作用 。 可能是由于拮抗菌在果实 伤口处定殖 ， 快速增长的拮抗菌有助于其与病原菌 15 ２ 018 年第 1 期 CＨIＮA PLAＮＴ PROＴECＴIOＮ ２0 1 8,Ｖｏl. ３8 .Ｎｏ. 1 （ 上接第 51 页 ）病发病率明显下降 。 参考文献 ［ 1］ 和秋菊 ， 易传辉 . 曲足侎缘蝽生物学特性及防治 ［ J］ . 浙 江林业学报 ， 2008， 25 （ 3） 363-366 . ［ 2］ 黄荫规 . 肉桂泡盾盲蝽生物学特性及防治 ［ J］ . 广西植 保 ， 1997 ， 10（ 5） 5-9 . ［ 3］ 刘建峰 ， 杨五烘 ， 李敦松 ， 等 . 肉桂新害虫泡盾盲蝽的生 物学特性及防治研究 ［ J］ . 广东农业科学 ， 1995 ， 14（ 1） 36-39. ［ 4］ 萧采瑜 . 中国蝽类昆虫鉴定手册 第 1册 ［ Ｍ ］ . 北京 科 学出版社 ， 1977 208-209 . ［ 5］ 朱志建 ， 潘国良 ， 朱炜 ， 等 . 樟颈曼盲蝽生物学特性研究 ［ J］ . 浙江林业科技 ， 2012 ， 32（ 5） 42-45 . ［ 6］ 文新 ， 宋力 ， 黎启枪 ， 等 . 肉桂枝枯病病原研究 ［ J］ . 微生 物学报 1995 ， 35（ 3） 152-185 . ［ 7］ 张翠疃 ， 李大乱 ， 苏海峰 ， 等 . 茶翅蝽和黄斑蝽生物学特 性研究 ［ J］ . 林业科学研究 ， 1993， 6（ 3） 271-274 . 之间的营养竞争 ［ 21 ］ ， 也可能与拮抗菌诱导寄主产生 抗病性或直接与病原菌作用等机制有关 。 本试验研究了葡萄附生拮抗细菌菌悬液与其发 酵液对离体果粒上葡萄灰霉病病菌的抑菌作用 ， 但 实际田间应用会受到细菌定殖 、 自然环境和管理等 多种因素的影响 ， 而且细菌间存在一定的拮抗和协 同作用 ， 为了研究开发高效的葡萄灰霉病防治产品 ， 需对复合拮抗菌的防效以及田间试验进行深入研 究 。 参考文献 ［ 1］ 韩之琪 ， 贲海燕 ， 谢学文 ， 等 . 灰葡萄孢对杀菌剂抗性研 究进展 ［ J］ . 中国蔬菜 ， 2014， 1（ 5） 6-10. ［ 2］ 严红 ， 燕继晔 ， 王忠跃 ， 等 . 葡萄灰霉病病菌对 3种杀菌 剂的多重抗药性检测 ［ J］ . 果树学报 ， 2012 （ 4） 625-629 . ［ 3］ 陈宇 飞 ， 文 景芝 ， 李 立军 . 葡萄灰霉病研究进展 ［ J］ . 东 北农业大学学报 ， 2006， 37（ 5） 693-699. ［ 4］ 陈 玲 ， 王 小艳 . 葡萄采 后 生理生 化 特 征 及 贮藏 保 鲜 技 术 的研究进展 ［ J］ . 食 品 安全 导 刊 ， 2014 （ 20） 70-72 . ［ 5］ 李明 娟 ， 游向荣 ， 文 仁德 ， 等 . 葡萄果实采 后 生理及 贮藏 保 鲜方法 研究进展 ［ J］ . 北 方园艺 ， 2013（ 20） 173-178 . ［ 6］ Fern ndez - Ortu o D ， Grabke A ， Bryson P K ， et al . 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