解淀粉芽孢杆菌B6防治西瓜枯萎病及对西瓜幼苗抗氧化酶的诱导作用.pdf

p2018年第 6期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18,VoI. 38.No. 6研 究 报 告 解 淀粉芽孢杆菌 B6 防治 西瓜枯萎病及对西瓜幼苗 抗氧化酶的诱导作用 王 静 ， 宁燕夏 ， 糟雪云 ， 李 敏 ， 司海丽 ， 杨国平 ， 张 琇 （ 北方民族大学生物科学与工程学院 ， 宁夏银川 750021 ） 摘要 从宁夏中卫硒砂瓜连作土壤中分离筛选出一株对尖孢镰刀菌 （ Fusarium oxysporum f . sp . niveum ） 有抑制作用 的菌株 B6， 研究了其生物防治效果及诱导西瓜幼苗超氧化物岐化酶 （ SOD ） 及过氧化物酶 （ POD ） 的规律 。 经单菌落形 态鉴定和 16S rDNA 序列分析 ， 拮抗菌株 B6为解淀粉芽孢杆菌 （ Bacillus amyloliquefaciens ）。 拮抗菌株 B6皿内抑菌 试验显示其能够抑制尖孢镰刀菌生长 ， 抑菌率达 50％ 。 温室盆栽试验表明 ， 拮抗菌 B6对西瓜枯萎病的防效达 88.89％ 。 B6发酵液浇灌西瓜幼苗 ， 能够诱导幼苗中 SOD 及 POD 升高 。 尖孢镰刀菌侵染 B6预处理幼苗 ， 1h 后幼苗中 SOD 活性达最大值 1 .07 nmol/s ， 6 h 后 POD 活性达最大值 0 .73 nmol/s ，较对照升高更早 ， 活性更强 。 关键词 解淀粉芽孢杆菌 ； 西瓜枯萎病 ； 抑菌率 ； SOD ； POD 中图分类号 S436.421.13文献标识码 A 文章编号 1672-6820 （ 2018 ） 06-0005-06 ControI efficiency of Bacillus amyloliquefaciens B6 against watermeIon wiIt and its induction effect on POD and SOD of watermeIon seedIing Wang Jing, Ning Yanxia, Zao Xueyun, Li Min, Si Haili, Yang Guoping, Zhang Xiu （ College of Biological Science and Engineering, North Minzu University, Yinchuan Ningxia 750021, China ） Abstract A bacterial strain B6 with well inhibition ability to Fusarium oxysporum f. sp. niveum was isolated from soil collected in watermelon field of Zhongwei, Ningxia. The control efficiency and protection enzyme activity of watermelon seedling induced by B6 were detected. B6 strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens by 16S rDNA sequence analysis. The tablet confrontation training showed B6 had high inhibitive effect on F. oxysporum f. sp. niveum with inhibition rate of 50％. In addition, the fermentation broth of B6 strain exhibited 88.89％ control efficiency against this watermelon disease through root -drenching pot assay. After root -drenching of B6 fermentation, SOD and POD activity of watermelon seedling were increased. Then spore solution of F. oxysporum f. sp. Niveum was treated, and the SOD activity of seedling reached the highest level of 1.07 nmol/s one hour later, and the activity of POD reached the highest level of 0.73 nmol/s after 6 hours. Key words Bacillus amyloliquefaciens ; Watermelon wilt; inhibition rate; SOD; POD 收稿日期 2017-11-30 ； 修回日期 2018-03-28 基金项目 宁夏高等学校科学技术研究项目 （ NGY2016138）； 宁夏科技支撑计划项目 （ 重大专项 ）[ 宁科技字 （ 2015 ） 26号 ]； 北方民族大学人 才引进启动项目 （ 4400302550 ） 作者简介 王静 ， 博士 ， 讲师 ， 主要从事植物逆境生物学与分子调控研究 。 E - mail wangjing_imu163 .com 。 5 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 解淀粉芽孢杆菌是一类植物根际益生菌 ， 能够 促进植物生长 ， 防治土传病害 ， 是开发生物防治菌剂 的重要资源 。 我国总耕地面积 1 216.66万 hm 2 ， 所属 地区的气候 、 地理 、 土壤等自然条件差异大 ， 孕育了 丰富的微生物资源 ， 筛选及合理开发适宜特定地区 农业生产的生防菌株 ， 不仅是对微生物菌种资源的 保护 ， 还对农业经济绿色发展至关重要 。 土壤中 ， 植物根系分泌营养物质 ， 多种微生物 互相竞争 ， 与植物共同生长 ， 形成了复杂的根际系 统 [ 1 ] 。 在根际系统中 ， 微生物的定殖能力决定其能否 发挥作用 。 一些具有生物防治作用的解淀粉芽孢杆 菌能在番茄 [ 2] 、 棉花 [ 3] 、 小麦 [ 4] 、 白菜 、 烟草 [ 5]及香蕉 [ 6] 根际成功定殖并能抑制病害发生 。 解淀粉芽孢杆菌 FZB42 T 是商品化的生物防治菌剂 ， 也是研究生防菌 生防机制及菌株与植物互作的重要材料 。 分析其基 因组序列后发现 10％ 的基因参与抗菌素的合成 ， 可 直接抑制土壤中多种病原微生物的生长 [ 7] 。 不仅如 此 ， 细胞内合成的一些挥发性次生代谢产物 ， 例如 3-羟基丁酮 、 2-氨基苯甲酸及脂肽等还可作为激活 因子诱导植物产生免疫反应 [ 8-9] ， 增强植物对病原微 生物的抗性 。 Chowdhury 等人追踪研究发现喷施解 淀粉芽孢杆菌菌剂后几乎不会影响根际土壤中微生 物群落组成 [ 1 0] 。 因此 ， 解淀粉芽孢杆菌是重要的绿色 生防菌剂候选菌株 。 宁夏西瓜长于砂田 ， 富含多种微量元素 ， 是宁夏 地区传统特色 优势 产业 。 连 作地种植 模式使 土壤生 态环境恶 化 ， 极易 发生 严 重土传性病害 [ 1 1] 。 西瓜 枯萎 病是 由尖 孢 镰刀 菌 侵染 所 致 [ 1 2-13] ， 一 旦 发病 很难控 制 ， 是影响西瓜产量的 主 要因素 之 一 。 B6是 本课题 组 前期从 宁夏中 卫 地区西瓜 连 作多 年 的土壤中筛选 获得 的菌株 ， 对 尖 孢 镰刀 菌具有 良好拮 抗作用 。 本文 研究了 该 菌对西瓜 枯萎 病的防治 效果以 及对西瓜 幼 苗 中抗 氧 化 酶 的影响 ， 评价 其生物防治 潜 力 并探讨 可能的作用机制 ， 为开发适宜宁夏砂田耕作区生物 防治菌剂 奠 定 试验 基 础 。 1 材料与方法 1 .1 供试材料 拮 抗菌株 B6分 离 自宁夏中 卫 地区的西瓜 连 作 多 年 的土壤中 ， 致 病菌 尖 孢 镰刀 菌分 离 自发病西瓜 根 部 ， 菌株 均由本实验室 保 存 。 B6于 - 80 ℃ 冻存 ， 尖 孢 镰刀 菌于 4 ℃ 保 存 。 供试 西瓜品种 金城 5号 为宁 夏地区 主栽 品种 ， 购 自宁夏农业 科学院 。 1 .2 B6 形态学及分子生物学鉴定 皿 内 划线培 养 B6单 菌落 ， 进 行 形 态学 、 革兰氏 染 色 观察 及 16S rDNA 基因序列分析 。 选 择通 用 引 物 ， 以 B6菌株基因组 DNA 为 模板 ， 扩 增 16S rDNA 序列 ， 回收 PCR 产物 ， 测 序 。 将测 序 结果输入 NCBI 数据库 ， 进 行 同源性 比较 ， 并 用 MEGA5 .0软 件 构建 系统发育 树 。 1 .3 皿内拮抗试验 将 保 藏 的 尖 孢 镰刀 菌 转 接 到 PDA 培 养基 平板 上 ， 用 5 mm 灭 菌 打孔器 在病原菌菌落 边缘打孔 ， 将 菌 饼转 接至 新 的 PDA 平板 中 央 ， 30 ℃ 静置培 养 24 h ， 将 菌株 B6点 接在 距离 菌 饼 25 mm 处 ， 每皿 接 4 个点 ， 重复 3次 。 另点 接 无 菌 水 为 空 白对 照 。 28 ℃ 静 置培 养 2 d ， 观察拮 抗 效果 ， 计算 抑菌 率 [ 1 4] 。 抑菌 率 （ ％ ） [（ 对 照 病原菌直 径 -对 峙拮 抗菌的 病原菌直 径 ） /对 照 病原菌直 径 ] 100 1 .4 盆栽防效试验 将灭 菌土与 尖 孢 镰刀 菌 按照 30∶1 （ W/V ）（ 尖 孢 镰刀 菌 浓度 为 1 10 5 cfu/mL ） 比 例 混 合 ， 拌匀 。 将露 白西瓜种子 ， 平铺 在土 表 面 。 处 理组 每粒 种子 周围 施 入 1 mL （ 1 10 8 cfu / mL ） B6孢子 悬浮液 ； 对 照 组 施 无 菌 水 。 每盆播 种 6粒露 白种子 ， 每个处 理 各 5 盆 ， 置 于 日光温室培 养 20 d ， 观察幼苗 发病 情况 ， 计 算 病 情指数和 相对防治 效果 [ 1 5] 。 病 情指数 [∑ （ 各级 病 叶数 各级 代 表数值 ） / 叶片 总 数 最高 代 表级值 ] 100％ 防病 效果 （ ％ ） [（ 对 照 组病 情指数 - 处 理组病 情指数 ） /对 照 组病 情指数 ] 100 1 .5 B6 对西瓜幼苗 SOD 和 POD 酶活影响分析 取露 白西瓜种子 ， 播 种于育 苗盆 ， 放入日光温 室培 养 。 待幼苗 长 出 2片真叶 后 ， 处 理组 沿幼苗 根 部 施 入 1 mL （ 1 10 8 cfu/mL ） B6菌 液 ， 对 照 组施 无 菌 水 。 每个处 理 30个 重复 。 分 别 于施 B6菌 液 及 无 菌 水 的 第 0、 1、 3天和第 5天取幼苗真叶 。 每 次 每 组 取 3个 重复 ， 测 定 叶片 SOD 及 POD 酶 活 。 待 施 入 B6及 无 菌 水 5 d 后 ， 沿 西瓜 幼苗 根 部浇灌尖 孢 镰 刀 菌孢子 悬液 ， 菌 液浓度 为 1 10 5 cfu/mL 。 分 别 于 6 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 图 2 菌株 B6 与其他相关菌株的系统发育树 浇灌病原菌后的 0 、 1、 3、 6、 12 h 和 24 h 取西瓜幼 苗真叶 。 每次每组取 3个重复 ， 测定叶片 SOD 及 POD 酶活 [ 1 6] 。 1 .6 数据统计与分析 采用 Excell 软件进行数据处理 、 分析与作图 。 2 结果与分析 2 .1 拮抗菌 B6 的鉴定 经培养 ， 观察 B6菌株单菌落形态 。 菌落中间有 突起 ， 边缘不整齐且干燥 、 不透明 （ 图 1 a ）。 菌体呈 杆状 ， 革兰氏染色为阳性 （ 图 1 b ）。 37℃ 培养 36 h 后可产生大量芽孢 。 经 16S rDNA 基因序列测定 ， 与 GenBank 数据库中其他相似序列进行核酸序列同源 性比较 ， 采用 MEGA 5 .0 构建系统发育树 （ 图 2）。 B6 与解淀粉芽孢杆菌相似度最高 。 2 .2 拮抗菌 B6 皿内抑菌效果 正常培养 3 d 的尖孢镰刀菌 ， 菌落直径可达 6.5 cm （ 图 3 a ）。 解淀粉芽孢杆菌 B6与尖孢镰刀菌共同 培养 ， 尖孢镰刀菌菌落直径仅为 3.5 cm ， 抑菌率达 50％ （ 图 3 b ）。 B6具有良好的拮抗尖孢镰刀菌生长 的效果 。 2 .3 拮抗菌株 B6 对尖孢镰刀菌引起的西瓜枯萎病 的防效 解淀粉芽孢杆菌 B6 对尖孢镰刀菌引起的西瓜 a. 固体 LB 培养基 b. 革兰氏染色 （ 1 000 ） 图 1 拮抗菌株 B6 在固体 LB 培养基上形态和 革兰氏染色显微照片 a b 7 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 B6 CK 图 4 解淀粉芽孢杆菌 B6 对尖孢镰刀菌引起的 西瓜枯萎病盆栽试验防效 枯萎病具有较好的防治效果 （ 图 4）。 在含有尖孢镰 刀菌的土壤中 ， 施加 B6 的西瓜幼苗长势良好 ， 已长 出 3～ 4片嫩绿真叶 ， 病情指数为 8.33 0.7； 对照组 （ 无菌水 ） 西瓜幼苗出芽率低 、 且长势差 ， 发病严重 ， 病情指数为 75.25 5.8。 B6 菌株的防治效果达 88 .89％ 。 2 .5 B6 对西瓜幼苗 SOD 及 POD 酶活的影响 施加 B6 后西瓜幼苗中 SOD 及 POD 酶活均呈 现先升高后降低趋势 ， SOD 酶活在施加 B6 菌液 1 d 达到最大值 0.84 nmol/s ， POD 酶活在施加 B6 菌液 3 d 达最大值 0.35 nmol/s ， 分别如图 5 a 、 b 所示 。 B6 预处理的幼苗对尖孢镰刀菌更敏感 ， 在施加 尖孢镰刀菌后 SOD 酶活迅速升高 ， 1 h 达到最大值 1.07 nmol/s ， 随后酶活降低又升高 ， 12 h 达到检测第 2大值 1.01 nmol/s 。 而未经 B6 预处理的幼苗在施加 尖孢镰刀菌后 ， SOD 酶活在 3 h 达到最大值 0.82 nmol/s ， 随后酶活逐渐下降 ， 且未出现 SOD 酶活再次 升高现象 ， 如图 5 c 所示 。 经过 B6 预处理的幼苗在 施加尖孢镰刀菌 1 h 后 ， POD 酶活开始升高 ， 6 h 达 最大值 0.73 nmol/s ， 随后 ， 酶活逐渐下降 。 而未经 B6 预处理的西瓜幼苗在施加尖孢镰刀菌 3 h 后 POD 酶活开始升高 ， 12 h 达最大值 0.65 nmol/s ， 随后酶 活逐渐下降 ， 如图 5 d 所示 。 可见 ， 施加尖孢镰刀菌 后 ， B6 预处理的幼苗较对照更早表达 SOD 及 POD ， 且两种酶活性更强 。 a. 未加拮抗菌的尖孢镰刀菌 b. 加入拮抗菌 B6 后的尖链孢菌 图 3 解淀粉芽孢杆菌 B6 对尖孢镰刀菌的抑制效果 a b 8 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 1.2 0.9 0.6 0.3 0 a S O D酶 活 （ n m o l /s ） H2O B6 b 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 P O D酶 活 （ n m o l /s ） H2O B6 0 1 3 5 0 1 3 5 时间 （ d ） 时间 （ d ） c d 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 S O D酶 活 （ n m o l /s ） H2O B6 H2O B6 0.9 0.6 0.3 0 P O D酶 活 （ n m o l /s ） 0 1 3 6 12 24 0 1 3 6 12 24 时间 （ h ） 时间 （ h ） a.施加 B6后 SOD 的变化 b.施加 B6后 POD 的变化 c.施加尖孢镰刀菌后 SOD 的变化 d.施加尖孢镰刀菌后 POD 的变化 图 5 解淀粉芽孢杆菌 B6 对西瓜枯萎病的诱导活性 3 讨论 植物根际益生菌是一类能在植物根际定殖并具 有促进植物生长或防控病害能力的有益微生物 [ 1 6] ， 能够分泌抗菌素直接抑制病原菌生长 ， 可与病原菌 竞争植物表面结合位点 ， 造成植物与病原菌空间的 隔离 ， 还可通过激活植物免疫系统增强对病原微生 物的抵御能力 [ 1 8] 。 目前 ， 已经开发出多种以根际植物 益生菌为主要成分商品化的生防菌剂 。 据美国市场 研究公司调查 ， 2013 年全球市场采购生防菌剂耗资 54. 8千万美元 ， 2019 年预计将增长到 83 . 7 千万美 元 ， 生防菌剂对农业的可持续发展起着越来越重要 的作用 [ 1 9] 。 对商品化的解淀粉芽孢杆菌 FZB42 T 的研 究表明 ， 基因组中有 10 个基因簇参与合成抗菌类物 质 ， 例如环脂肽 、 聚酮化合物以及高度修饰的细菌素 等 [ 1 0] 。 本实验室前期筛选出的解淀粉芽孢杆菌 B6 不仅在培养皿内具有良好的抑制尖孢镰刀菌生长作 用 ， 且在盆栽试验中 ， 防治枯萎病效果达 88. 89％ ， 具 有极佳商业推广及基础研究价值 。 可根据已发表的 研究数据结合转录组 、 蛋白质组及 HPLC 等多种分 析技术 ， 深入研究 B6防治枯萎病的机制 ， 为其商品 化提供重要的理论支撑 。 植物益生菌发挥生物防治作用 ， 可通过以下 方式实 现 ， 如与病原菌争 夺 植物的结合位点 、 合成 生长素类物质促进植物生长以及分泌 信号 分 子诱 导 植物 产 生 先天 免疫 反应 [ 20 ] 。 在研究 蜡样 芽 胞 杆 菌 AR156 生防作用时 也得 到 了 类 似 结果 ， AR156 能够 诱导拟南芥产 生免疫 反应 ， 迅速 合成过 氧 化 氢 及防御 相关 的抗 氧 化酶 SOD 和 POD ， 诱导 抗病 基因 PR1 、 PR2 、 PR5 以及 MPK6 迅速表 达 ， 最终 增 强 拟南芥 对 丁香假单胞 菌的抵抗能力 [ 21 ] 。 有研究 表 明 ， 解淀粉芽孢杆菌通过 次 生 代谢产 物 表 面活 性 素 （ sufactin ） 诱导 植物 产 生 早 期免疫 反应并 增强 对病原菌的抵抗能力 [ 22 ] 。 本试验中 ， 预 先 施 加 解淀 粉芽孢杆菌 B6， 能够 诱导西瓜幼苗 SOD 和 POD 酶活 升 高 ， 再 施 加 尖孢镰刀菌 ， 幼苗 中 SOD 和 POD 酶活 会更早 、 更 强 烈 的 表 达 ， 激发 幼苗 抵抗病原菌 的 潜 力 。 9 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 参考文献 [ 1] Kloepper J W ， Leong J ， Teintze M ， et al . 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