粤北地区果蔗细菌性病害PCR分子检测.pdf

2018年第 6期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18,VoI. 38.No. 6 果蔗作为粤北特色经济作物之一 ， 至今已有 30 年以上历史 ， 主要分布在广东省清远市 、 英德市及韶 关市翁源县 [ 1 ] 。 据统计 ， 英德市果蔗种植面积约为 866 . 67 hm 2 ； 翁源县果蔗种植面积约为 2 133 . 33 hm 2 。 黑皮果蔗 （ Badila ） 和黄皮果蔗是粤北果蔗种植 区主要种植品种 ， 一般产量可达 120 t/hm 2 ， 高产甘 蔗可达 150 ～ 180 t/hm 2 。 产品主要销往福建 、 江西 、 安 徽 、 山东 、 河南 、 黑龙江等省 。 经多年连年种植 ， 果蔗 病害问题日益突出 ， 严重影响其品质与产量 ， 生产上 迫切需要推广果蔗改良品种及应用健康种苗 。 甘蔗宿根矮化病 （ ratoon stunting disease ， RSD ）、 甘蔗赤条病 （ red stripe ）、 甘蔗白条病 （ leaf scald ） 是 粤北地区果蔗细菌性病害 PCR 分子检测 吴小斌 ， 齐永文 * ， 劳方业 ， 樊丽娜 ， 何慧怡 ， 李奇伟 （ 广东省生物工程研究所 /广州甘蔗糖业研究所 /广东省甘蔗遗传改良工程技术中心 ， 广东广州 510316 ） 摘要 为了解粤北地区果蔗主产区甘蔗宿根矮化病 、 赤条病和白条病病害发生和为害 ， 本研究通过 PCR技术对粤北 果蔗产地植株蔗茎样品进行分子检测 。 结果表明 ，果蔗宿根矮化病菌总检出率为 41 . 5％ ，各采样地块均检测出宿根矮 化病病原菌 ， 地块检出率达到 100％ ， 不同地块的检出率为 10％ ～ 82. 8％ 。 赤条病和白条病病原菌未检出 。 粤北地区果 蔗细菌性病害以甘蔗宿根矮化病为主 。 关键词 果蔗 ； 宿根矮化病 ； PCR； 细菌病害 中图分类号 S435.661 文献标识码 A 文章编号 1672-6820 （ 2018 ） 06-0011-05 MoIecuIar detection of pathogen of bacteria disease on sugarcane by PCR in northern Guangdong province Wu Xiaobin, Qi Yongwen, Lao Fangye, Fan Lina, He Huiyi, Li Qiwei （ Guangdong Provincial Bioengineering Institute/ Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute / Guangdong Engineering and Technical Research Center of Sugarcane Genetic Improvement, Guangzhou Guangdong 510316, China ） Abstract Ratoon stunting disease （ RSD ） , leaf scald and red stripe are three major bacterial diseases of sugarcane. In order to understand occurring of major bacterial diseases in main fruit-cane producing areas in northern Guangdong province, some local stem samples was detected by PCR. The results showed that total positive detection rate of RSD was 41.5％, and positive detection rate of RSD in plots was 100％, which ranged from 10％ to 82.8％ among different plots. Pathogens of leaf scald and red stripe were not found by detection, and RSD was the major disease against sugarcane in northern Guangdong province. Key words sugarcane; ratoon stunting disease; PCR; bacterial disease 收稿日期 2017-12-08 ； 修回日期 2018-04-11 基金项目 国家糖料作物产业技术体系 （ CARS - 170107 ）； 广东省科技计划 （ 2014B090907006 、 2014B070705002 、 2015A020209026 、 2016A030313415 、 2016A030303018 ） 作者简介 吴小斌 ， 硕士 ， 研究实习员 ， 主要从事甘蔗病害及甘蔗分子设计育种研究 。 E- mail wuxiaobin163 .com * 通讯作者 齐永文 ， 博士 ， 研究员 ， 主要从事甘蔗种质创新与新品种选育研究 。 E- mail yongwen2001163 .com 。 11 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 病害名称 上游引物名称及序列 片段大小 （ bp ） 参考文献 宿根矮化病 Pat1 -F2 5′ -GGAATACTCGCTATGTGTTG -3′ 597 Fu et al. 2016 [ 5] Pat1 -R2 5′ -CCAATACTATGCCGTAGAAAG -3′ 赤条病 Oaf1 5 ′ -GTCGGTGCTAACGACATGG -3′ 550 Song et al. 2003 [ 28] Oar1 5 ′ -AGACATCTCCGCTTTCTTTCAA -3′ 白条病 XAF1 5′ -CCTGGTGATGACGCTGGGTT -3′ 600 Wang et al. 1999 [ 32] XAR1 5 ′ -CGATCAGCGATGCACGCAGT -3′ 表 1 甘蔗细菌病害检测引物 世界各蔗区广泛发生的重要甘蔗细菌病害 ， 国内外 均有相关报道 ， 并出现大面积为害现象 [ 2-11 ] 。 甘蔗宿 根矮化病主要通过血清学 [ 2 ， 12-18] 及分子生物学 [ 5， 19-25] 的手段进行检测 。 2016年 ， Berna 等在植物生理学与 病理学国际会议提交的会议论文中提出 ， 通过固相 微萃取和气相色谱 -质谱联用技术 ， 对澳大利亚昆 士兰蔗区的 10多个甘蔗栽培种进行甘蔗宿根矮化 病原菌检测 [ 26 ] 。 甘蔗赤条病尚无国家标准检验检疫 方法 。 Song 等在病菌基因组 16S～ 23S 间隔区设计 1 对特异性引物 Oaf1/Oar1 ，对甘蔗病叶样品进行 PCR 检测 [ 27 -28 ] 。 傅华英等在 Aaa 菌株的 16S～ 23S rDNA 及其间隔区设计 2对特异性引物 ， 进行巢式 PCR扩 增 [ 29 ] 。 甘蔗白条病病症不稳定性 ， 致使直观判断病害 侵染存在困难 。 目前 ， 应用酶联方法 、 斑点和组织免 疫印迹杂交法 、 常规 PCR和荧光定量 PCR检测甘 蔗白色条纹病菌 [ Xanthomonas dbilineans （ Ashby ） Dowson ] 均有报道 [ 4 ， 30 -32] 。 为了解粤北地区果蔗细菌病害在翁源县分布情 况 ， 本研究应用 PCR技术对粤北地区果蔗进行细菌 病害检测 。 本研究对粤北地区有效防控甘蔗细菌病 害 ， 推广应用脱毒健康种苗具有重要现实意义 。 1 材料与方法 1 . 1 材料 2016年 12月 ， 分别从广东省英德市 、 翁源县共 19个采样点 ， 采集黑皮果蔗样本 181份 ， 黄皮果蔗 样本 10份 。 蔗茎经清洗消毒后 ， 截取地上部 第 3节 部及 第 4 节 部 ， 榨 取蔗 汁约 2 mL ， 装于 2 mL 离心 管 ， 保 存 于 -80 ℃ 备 用 。 阴 性甘蔗样品取 自 本实验 室 合作 蔗 田 脱毒健康种苗 ， 阳 性样品取 自 本实验 室 染 病蔗茎 。 Ex Taq TM Version 2 . 0扩增酶 、 DNA Marker 购自 TaKaRa 公司 ， 琼脂糖粉末购自 BIOWEST 公司 。 1 .2 实验方法 1 .2 .1 引物合成 用 于 检测甘蔗细菌病害引物 信息如表 1， 引物 合成由赛默飞 世 尔科 技 （ 中国 ） 有 限公司完成 。 1 .2 .2 DNA 提取及病原菌 PCR检测 蔗 汁总 DNA 提取采用 改良 CTAB 法 ， 所 有 DNA 保 存 于 -20 ℃ 备 用 。 DNA 质量及 浓度 分 析 分别 通过 琼脂糖凝胶电泳 检测和 Biophotometer 生物分 光光 度 计测定 。 PCR反 应 体系 为 25 μ l ∶12. 5 μ l 2 Ex Taq premix ， 上 下 游引物各 1 μ l ， 0. 5 μ l 总 DNA 和 10μ l 无菌 水 。 宿根矮化病检测 PCR扩增 程 序为 94 ℃ 预变 性 2 min ； 94 ℃ 变 性 30 s ， 50 ℃ 退火 30 s ， 72℃ 延伸 60 s ， 35 个 循环 ； 72 ℃ 延伸 10 min 。 赤条病检测 PCR 扩增 程 序为 94 ℃ 预变 性 5 min ； 94 ℃ 变 性 1 min ， 55 ℃ 退火 30 s ， 72 ℃ 延伸 1 min ， 10个 循环 ； 72 ℃ 延伸 7 min 。 白条病检测 PCR 扩增 程 序为 94 ℃ 预变 性 5 min ； 94 ℃ 变 性 45 s ， 65 ℃ 退火 1 min ， 72 ℃ 延伸 1 min ， 10个 循环 ； 94 ℃ 变 性 45 s ， 65 ℃ 退火 1 min ， 72 ℃ 延伸 2 min ， 10个 循环 ； 94 ℃ 变 性 45 s ， 65 ℃ 退火 1 min ， 72 ℃ 延伸 3 min ， 15 个 循环 ； 72 ℃ 延伸 10 min 。 1 .3 数据处理 PCR扩增 产 物采用 1. 5％ 琼脂糖凝胶电泳 检测 ， 并观测目的条 带 。 每 份样品进行 3次 生物学重 复鉴 定 ， 3次 重 复试 验 结 果均出现 阳 性条 带时 ， 确认 病原 菌检出 ； 3次 重 复试 验 结 果不 一 致 时 ， 再次 重检 ， 直 至确认 。 12 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 18 ,VoI. 38 .No. 6 M . DL2000 DNA Marker 1. 翁城镇黑皮果蔗 2.周陂镇黑皮果蔗 3.官渡镇黑皮果蔗 4.青塘镇黑皮果蔗 5. 连州镇黑皮果蔗 6. 横石水镇黑皮果蔗 7.官渡镇黄皮果蔗 N1. Negative/ 横石水镇黑皮果蔗脱毒种苗 N2. Negative/ 六里镇黑皮果蔗脱毒种苗 B. Blank/ 水 P. Positive/ 染病黑皮果蔗 图 1 宿根矮化病病菌 PCR 检测凝胶电泳 地点 （ 品种 ） 样本茎数 （ 条 ） 宿根矮化病 赤条病 白条病 阳性 （ 条 ） 检出率 （ ％ ） 阳性 （ 条 ） 检出率 （ ％ ） 阳性 （ 条 ） 检出率 （ ％ ） 翁城镇 （ 黑皮果蔗 ） 31 10 32.2 0 0 0 0 周陂镇 （ 黑皮果蔗 ） 31 10 32.2 0 0 0 0 官渡镇 （ 黑皮果蔗 ） 29 24 82.8 0 0 0 0 官渡镇 （ 黄皮果蔗 ） 10 1 10.0 0 0 0 0 青塘镇 （ 黑皮果蔗 ） 29 4 13.8 0 0 0 0 连州镇 （ 黑皮果蔗 ） 31 16 51.6 0 0 0 0 横石水镇 （ 黑皮果蔗 ） 10 6 60.0 0 0 0 0 合计 171 71 41.5 0 0 0 0 表 2 粤北地区蔗田甘蔗样品宿根矮化病病原菌检出率 病菌检出率 （ ％ ） [ 阳性样本数 /样本茎数 ] 100。 2 结果与分析 经统计 ， 在粤北地区蔗田随机采集的 171份果 蔗样本中 ， 共检测得到 71份宿根矮化病病原菌阳性 样品 ， 阳性检出率为 41. 5％ ； 各采样地块均检测出宿 根矮化病病原菌 ， 地块检出率达到 100％ ， 不同地块 的检出率为 10％ ～ 82 . 8％ （ 表 2）。 在琼脂糖凝胶电泳 图中 ， 宿根矮化病阳性样品目的片段长度为 597 bp （ 图 1）。 本次试验均未检测出赤条病病原菌及白条 病病原菌检测 。 在粤北地区本实验室合作蔗田随机 采集的 20份健康种苗样本 ， 其中 1代种苗 10份 、 2 代种苗 10份 ， 均未检测出宿根矮化病原菌 、 赤条病 病原菌及白条病病原菌 。 3 讨论 甘蔗细菌病害传播性极强 ， 主要通过带病种茎 及砍收工具传播 ， 带甘蔗宿根矮化病病原蔗汁稀释 至 10 000倍及受污染蔗刀在阴暗处放置 7 d 仍具 有传染力 [ 33 -34 ] 。 蔗农普遍采用蔗梢繁种及传统砍收 方式是果蔗细菌病害大范围传播的直接原因 。 由于 甘蔗细菌病原物通常淤塞于甘蔗维管束 ， 影响水分 、 有机质等运输 ， 大田生产中 ， 甘蔗宿根矮化病可造成 减产 10％ ～ 30％ ， 干旱时可减产达 60％ 以上 ， 甚至导 致种性退化 [ 35 -36 ] 。 但由于该病害隐蔽性强 ， 无法从外 13 2018 年第 6 期 CHINA PLANT PROTECTION 20 1 8,VoI. 38 .No. 6 观上直接观测该病害的发生 ， 易与水肥管理不良等 造成的不良现象混淆 。 因此 ， 蔗农对该病害认识与重 视程度严重缺乏 。 PCR技术作为分子生物学实验基础技术之一 ， 具有技术成熟 、 灵敏度优异 、 特异性强 、 操作简便 、 成 本相对低廉等优点 。 同时 ， 蔗汁核酸提取省时 、 省力 ， 操作简便 。 因此 ， 蔗汁病原 PCR检测适宜作为大量 样品病原检测的手段之一 。 本次试验结果表明 ， 采样 地块果蔗均已受宿根矮化病菌感染 ， 采样地块果蔗 茎种蔗已不适合进行下一轮果蔗生产 。 由于果蔗生产中 ， 常采用蔗梢作为繁种材料 ， 甘 蔗病害连年积累 ， 致使果蔗栽培成本逐年加重 ， 多数 蔗地果品不佳 ， 蔗汁口感淡 、 咸 ， 收购价格相对低廉 。 在本次调查中 ， 农民普遍反映 ， 果蔗种植过程大量施 用化肥 、 激素 ， 并且逐年增加 ， 药物 、 人工成本越来越 高 。 2017年 12月 ， 广东省果蔗收购价格低迷 ， 成品 蔗普遍收购价格为 0.4～ 0.6 元 /kg ， 农民损失严重 ， 仅 有少部分果品优良甘蔗收购价格稍高 。 果蔗脱毒种苗具有增产 、 节间拉长 、 商品性好等 优点 [ 37 ] 。 蔡文伟等通过 1年新植与 4年宿根繁殖材 料的试验数据证实 ， 甘蔗脱毒种苗分蘖率 、 发株率 、 单位面积有效茎数 、 甘蔗单位面积产量和蔗糖分 含 量均优于同品种 非 脱毒种苗 。 其 中 ， 脱毒种苗宿根 第 4年数据 虽然 优于 非 脱毒种苗 ， 但未达到显著 水 平 [ 38 ] 。 陈仲华 、 沈万宽 等 应 用 热 水脱毒 方法 使 健康 种苗 较 同品种种苗新植蔗增产 10％ ～ 20％ ， 宿根蔗增 产 15％ ～ 25％ [ 39-40] 。 本次实验结果表明 ， 健康 种苗 可 有效 除去 种苗 细 菌病原物 ， 1代 、 2代 果蔗 健康 种苗 均 可 有效 控制细 菌病害发生 。 脱毒种苗果蔗 风味清 甜 ， 种植过程省 钱 、 省工 ， 对于提 升 果蔗品 质 ， 减 少蔗 农损失 ， 促 进蔗农增收 意义 重大 。 然而 ， 蔗农对脱毒 种苗认识 依旧 不 足 ， 讹称 为 “ 基 因种 ”， 且对于 尝 试种 植脱毒种苗 意愿 低下 ， 不 利 于产 业健康 发 展及粤北 地 区 果蔗品 牌建立 。 我国 蔗 区丰富 的生 态多 样性 ， 以及频繁引 种 、 调 种为甘蔗病害 传播 、 变 异提 供了条件 ， 且甘蔗 细 菌病 害表现不 稳定 ， 依 据 田间症状 进行甘蔗病害 诊断 易 造成 误判 ， 甘蔗 安全 生产 存 在 隐患 。 因此 ， 对不同蔗 区 甘蔗病害进行有效 诊断尤 为 必要 。 粤北 地 区 果蔗 细 菌性病害 以 甘蔗宿根矮化病为 主 ， 建议要 加强果 蔗宿根矮化病 诊断 和 防控 ， 积 极推 进果蔗脱毒种苗 的 推 广 应 用 。 本次试验中 两个 试验点的脱毒种苗果 蔗 （ Badila 和 Negative ， 其 蔗苗由本实验 室 提 供 ） 3种 细 菌病害检 出 率均为 0， 应 用 PCR技 术进行甘蔗病 原物检测 可 为甘蔗脱毒种苗生产提 供准确可靠 、 灵 敏 、 快速 的检测手 段 。 参考文献 [ 1] 幸晓维 ， 郑 伟 仪 . 8-5各市 农作物 播 种面积和产量 [ M] // 广东农 村统计 年 鉴 --- 2015. 北京 中 国统计出版社 ， 2015 192-193. 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