湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定_班一云.pdf

p２０１７，４３（４）１３４－１３８ nbsp;Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ研 究 简 报Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅｓ收稿日期 ２０１７－０３－２５ nbsp; 修订日期 ２０１７－０４－２７基金项目 国家自然科学基金重大项目 （３１３９０４２２）＊通信作者 Ｅ－ｍａｉｌｂｄｉｎｇ＠ｉｐｐｃａａｓ．ｃｎ；ｚｚｈｏｕ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定班一云 ，丁波＊，周雪平＊（中国农业科学院植物保护研究所 ，植物病虫害生物学国家重点实验室 ，北京１００１９３）摘要双生病毒是一类在全世界范围内广泛发生的单链环状 ＤＮＡ病毒 。本文对从湖南采集到的 ６例 （洋姜 、番茄 、萝卜 、赛葵 、甘薯 、牵牛花 ）疑似双生病毒侵染的植物叶片进行了分子鉴定 。利用滚环扩增技术 （ＲＣＡ）对样品ＤＮＡ进行扩增，分别对其ＲＣＡ产物进行酶切，并将酶切得到的片段测序后进行ＢＬＡＳＴ比对，结果显示番茄样品中的病毒分离物与番茄黄化曲叶病毒相似性最高 （９９％），牵牛花样品中的病毒分离物与甘薯卷叶病毒相似性最高（９９％），证明这两个分离物是单组分ＤＮＡ－Ａ双生病毒。这是在湖南省首次发现并报道双生病毒的全核酸序列 。关键词番茄黄化曲叶病毒 ；甘薯卷叶病毒 ；ＤＮＡ－Ａ中图分类号 Ｓ ４３６ nbsp;文献标识码 Ａ nbsp;ＤＯＩ１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１５４２．２０１７．０４．０２５Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ ｏｎ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｍｏｒｎｉｎｇｇｌｏｒｙ ｉｎ Ｈｕｎａｎ ＰｒｏｖｉｎｃｅＢａｎ Ｙｉｙｕｎ，ＤｉｎｇＢｏ，Ｚｈｏｕ Ｘｕｅｐｉｎｇ（Ｓｔａｔｅ ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒ ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ ＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｇｒｏｕｐ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｓｉｘ ｐｌａｎｔｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｉｔｈ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｓｕｓｐｉｃｉｏｕｓ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ａｆｔｅｒ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｒｏｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ），ｔｈｅ ＲＣＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏ－ｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｍｏｒｎｉｎｇ ｇｌｏｒｙ ｓｈａｒｅｄ９９％ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈ Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｏｗ ｌｅａｆｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ（ＴＹＬＣＶ）ａｎｄ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬＣＶ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅ－ｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｍｏｒｎｉｎｇ ｇｌｏｒｙ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ，ａｎｄ ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｏｗ ｌｅａｆｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ；Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ；ＤＮＡ－Ａ双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链ＤＮＡ病毒 ，一般发生在热带和亚热带地区 ，寄主范围十分广泛 ，在全球范围内造成重大损失［１］。番茄黄化曲叶病毒Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ（ＴＹＬＣＶ）和甘薯卷叶病毒Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ（ＳＰＬ－ＣＶ）均属于双生病毒科Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ的菜豆金色花叶病毒属Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ，该属病毒主要以烟粉虱传播 ，危害极为严重［２－４］。番茄黄化曲叶病毒是侵染番茄Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌ的主要病毒之一 ，最早在以色列被发现 ，１９６４年正式被命名［５］。该病毒引起植株曲叶 、黄化 、矮化等症状 ，常对番茄栽培地区造成毁灭性危害［６］。我国是世界上最大的甘薯Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｌａｎ生产国 ，而甘薯卷叶病毒主要侵染旋花科植物 ，其危害严重阻碍了甘薯产业的发展［７－８］。牵牛花Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｎｉｌ是一种观赏植物 ，并且具有药用价值 ，其生长适应性强 ，田间路边随处可见 。研究表明 ，双生病毒可经烟粉虱在牵牛花与作物之间相互传播［９－１０］，因此牵牛花对双生病毒重组 、传播及扩散都有重要的作用 ，对作物生产构成了严重的威胁［１１］。目前 ，受全球气候变暖 、国际贸易加强及人类活动等影响 ，双生病毒病害在我国的危害范围不断扩大［１２］。因此 ，对不同地区 、不同寄主４３卷第 ４期 班一云等湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定的双生病毒进行鉴定 ，进一步明确该病害在我国的发生 、分布及危害情况可为病毒病防控打下基础 。本研究对从湖南省采集的样品进行了分子鉴定 ，发现番茄样品被ＴＹＬＣＶ侵染 ，而牵牛花样品被ＳＰＬ－ＣＶ侵染 ，ＴＹＬＣＶ和ＳＰＬＣＶ分离物的全基因组大小均约２．８ｋｂ的单链环状ＤＮＡ分子 。病毒基因组共编码６个开放阅读框 （ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），分别为ＡＶ １、ＡＶ ２、ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３和ＡＣ４［１３－１５］，并未检测到ＤＮＡ－Ｂ和ＤＮＡβ组分 。１ 材料与方法１．１ 材料１．１．１ 样品采集２０１６年１０月在湖南省长沙市采集到疑似被双生病毒侵染的植物叶片样品６份 ，分别为洋姜 、番茄（图１ａ）、萝卜 、赛葵 、甘薯和牵牛花 （图１ｂ）。阳性对照为本实验室保存的番茄黄化曲叶病毒和甘薯卷叶病毒 。图 １从湖南省采集的番茄和牵牛花样品的感病症状Ｆｉｇ．１ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｍｏｒｎｉｎｇｇｌｏｒｙｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ１．１．２ 试剂及仪器ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ内切酶 ，购自Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司 ；ｐＬＢ零背景快速克隆试剂盒 ，购自天根生化科技公司 ；２ＥａｓｙＴａｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ，购自全式金生物技术公司 ；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ高保真酶试剂盒 ，购自Ｔｏｙｏｂｏ公司 ；Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，购自Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ公 司 ；ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ，购自ＧＥ公司 ；Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４２４离心机 ，购自Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司 ；Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋凝胶成像系统 ，Ｔ１００Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ仪 ，购 自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公 司 ；Ｔｉｓ－ｓｕｅｌｙｓｅｒ－４８全自动快速样品研磨仪 ，购自上海净信科技公司 。１．２ 方法１．２．１ 叶片总ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法提取样品叶片总ＤＮＡ。分别取０．１ｇ叶片组织放入预先加入一枚钢珠的２ｍＬ离心管中 ，液氮速冻后利用全自动快速样品研磨仪将样品研磨至粉状 ，加入５００μＬ ６５℃水浴预热的２％ＣＴＡＢ抽提缓冲液 ，６５℃水浴保温１ｈ后加入等体积的２４∶１的氯仿 ／异戊醇振荡混匀 ，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移上清至新的１．５ｍＬ离心管中 。然后加入１／１０体积醋酸钠 （ｐＨ＝５．２）和２倍体积的－２０℃预冷的无水乙醇 ，混匀后于－２０℃放置１ｈ，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ以沉淀ＤＮＡ，弃上清后用１ｍＬ ７５％乙醇将沉淀清洗１次 ，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ弃上清后干燥 ，最后加入适量去离子水溶解ＤＮＡ，置于－２０℃保存 。１．２．２ 病毒基因组的滚环扩增及酶切鉴定利用ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ对样品总ＤＮＡ进行滚环扩增 。将１μＬ ＤＮＡ（约１０～２０ｎｇ）加入到５μＬ样品缓冲液中 ，９５℃变性３ｍｉｎ后立即置于冰上１０ｍｉｎ，然后加入５μＬ反应缓冲液和０．２μＬ ＤＮＡ聚合酶 ，混匀后置于３０℃反应１８～２０ｈ，最后６５℃加热１０ｍｉｎ以终止反应 。选取多种双生病毒含有的酶切位点 ，采用相应的限制性内切酶分别对６个样品的ＲＣＡ产物进行酶切以获得特异性片段 。１．２．３ 病毒基因组的克隆测序及全长序列获取将酶切得到的片段连接至ｐＬＢ载体 ，由北京擎科生物公司进行测序 ，在ＮＣＢＩ网站对测序结果进行ＢＬＡＳＴ比对 ，结果表明番茄样品分离物与ＴＹＬＣＶ的相似性最高 ，牵牛花样品分离物与ＳＰＬＣＶ的相似性最高 。根据测得的部分序列设计 特 异 引 物 对 ＮｄｅＩ－Ｆ（５′－ＡＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＡＣＴＧＡＡＡＡ－ＣＧＣＣ－３′）／ＮｄｅＩ－Ｒ（５′－ＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴ－ＴＡＴＡＡＧＴＴ－３′）和ＮｃｏＩ－Ｆ（５′－ＣＡＧＡＴＣＧＡＡＴＣＡ－ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＣＡ－３′）／ＮｃｏＩ－Ｒ（５′－ＴＴＣＧＧＴＧＡＧＡＣ－ＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡ－３′）分别扩增番茄样品和牵牛花样品分离物的ＤＮＡ－Ａ全长 。同时分别利用ＤＮＡ－Ｂ组分的通用引物ＣＲ０１／ＣＲ０２［２］和ＤＮＡ－β的通用引物ｂｅｔａ０１／ｂｅｔａ０２［１６］对 样 品 进 行ＰＣＲ扩 增 ，以 期 获 得ＤＮＡ－Ｂ和ＤＮＡ－β序列 。１．２．４ 病毒基因组序列比对及进化树构建利用ＤＮＡＭＡＮ ５．２．２软件对筛选的阳性克隆５３１２０１７序列进行比对 ，最终确定病毒分离物的基因组全序列 。在ＮＣＢＩ数据库中进行ＢＬＡＳＴ相似性比对分析 ，并从中选取已报道的ＴＹＬＣＶ和ＳＰＬＣＶ的代表性同 源 序 列 ，在ＭＥＧＡ ６．０［１７］中 采 用 邻 接 法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）构建全基因组序列进化树 ，系统进化树中ｂｏｏｔｓｔｒａｐ参数值设置为１ ０００。２ 结果与分析２．１ ＲＣＡ产物酶切检测以提取的植物基因组总ＤＮＡ为模板分别进行ＲＣＡ扩增 ，通过酶切样品的ＲＣＡ产物 ，从番茄和牵牛花样品中均得到了２．５～３．０ｋｂ左右的条带 （图２），割胶纯化后克隆测序 ，序列ＢＬＡＳＴ比对结果显示 ，番茄样品的分离物与ＧｅｎＢａｎｋ中番茄黄化曲叶病毒 （ＫＸ０３４５４７）的 相 似 性 最 高 （９９％），命 名 为ＴＹＬＣＶ－ＨＮ（ＫＹ７８３９４０）；牵牛花样品中的分离物与甘薯卷叶病毒 （ＦＪ１７６７０１）的相似性最高 （９９％），命名为ＳＰＬＣＶ－ＨＮ（ＫＹ７８３９４１）。利 用 通 用 引 物ＣＲ０１／ＣＲ０２［２］和ｂｅｔａ０１／ｂｅｔａ０２［１６］对样品进行ＰＣＲ扩增 ，结果均未检测到ＤＮＡ－Ｂ或ＤＮＡ－β组分 ，推测ＴＹＬＣＶ－ＨＮ和ＳＰＬＣＶ－ＨＮ均 为 仅 含 有ＤＮＡ－Ａ组分的单组分双生病毒 。图 ２湖南省采集样品的 ＲＣＡ产物的酶切鉴定Ｆｉｇ．２ Ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＲＣＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ２．２ 病毒基因组的序列测定和分析通过酶切ＲＣＡ产物得到番茄和牵牛花样品分离物的基因组片段 ，分别设计特异引物扩增ＤＮＡ－Ａ全长 （图３），每个分离物均检测３个阳性克隆 ，测序结果表明各分离物病毒基因组序列之间无任何差异 。其中 ，ＴＹＬＣＶ－ＨＮ全长为２ ７８１ｂｐ，为单链闭合环状ＤＮＡ，共编码６个ＯＲＦ，其中病毒链编码２个ＯＲＦＡＶ１（３０８－１０８４）和ＡＶ２（１４８－４９８），互补链编码４个ＯＲＦＡＣ１（１５４２－２６１５）、ＡＣ２（１２２６－１６３３）、ＡＣ３（１０８１－１４８５）和ＡＣ４（２１７１－２４６４）。ＳＰＬ－ＣＶ－ＨＮ全长为２ ８２７ｂｐ，为单链闭合环状ＤＮＡ，共编码６个ＯＲＦ，其中病毒链编码２个ＯＲＦＡＶ１（３０１－１０６５）和ＡＶ２（１３２－４７６），互 补 链 编 码４个ＯＲＦＡＣ１（１５８７－２６８１）、ＡＣ２（１２３２－１６７８）、ＡＣ３（１０８１－１５１５）和ＡＣ４（２２６７－２５２４）。图 ３利用特异引物扩增番茄样品和牵牛花样品中双生病毒分离物基因组全长Ｆｉｇ．３ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ ｏｎ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｍｏｒｎｉｎｇｇｌｏｒｙ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ２．３ ＴＹＬＣＶ－ＨＮ及ＳＰＬＣＶ－ＨＮ的序列分析从ＮＣＢＩ中选取有代表性的同源序列和ＴＹＬ－ＣＶ－ＨＮ和ＳＰＬＣＶ－ＨＮ序列进行序列比对 ，采用邻接法 （ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）分别对ＴＹＬＣＶ和ＳＰＬＣＶ构建进化树 （图４）。从进化树图中可以看出 ，ＴＹＬ－ＣＶ－ＨＮ与云 南 分 离 物 的 亲 缘 关 系 最 近 （图４ａ），ＳＰＬＣＶ－ＨＮ与江苏 、安徽等地分离物的亲缘关系最近 （图４ｂ）。３ 讨论本研究通过对从湖南省采集的６例样品进行检测及鉴定 ，证明双生病毒的危害进一步扩大到了６３１４３卷第 ４期 班一云等湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定湖南省 ，为进一步研究我国双生病毒的分布情况及分子变异情况提供了一定的科学依据 。根据双生病毒科病毒的命名规则 ，全基因组核酸序列的相似性大于８９％被命名为同种病毒的不同株系 ，小于８９％则被命 名 为 不 同 种 的 病 毒［１８］，因 此 将ＴＹＬ－ＣＶ－ＨＮ确 定 为ＴＹＬＣＶ的 一 个 分 离 物 ，ＳＰＬＣＶ－ＨＮ为ＳＰＬＣＶ的一个分离物 。这是首次在湖南省发现并报道双生病毒 。图 ４ＴＹＬＣＶ和 ＳＰＬＣＶ不同分离物的核苷酸序列进化树Ｆｉｇ．４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ａｎｄ ＳＰＬＣＶ番茄在湖南省的生产生活中占有重要地位 ，它不仅是人们日常食用的主要蔬菜 ，番茄产业也为当地的农民增加了收入 。然而 ，番茄黄化曲叶病毒病是一种发生于番茄上的毁灭性病害［１９］，它严重制约了番茄产业的发展 。目前 ，该病害在我国传播呈现出由南向北的发展趋势 ，并且逐年加重［２０］。从进化树关系图中可以看出 ，ＴＹＬＣＶ－ＨＮ和云南等省市的分离物的序列亲缘关系最近 ，并且其保守性也很高 ，所以我们推测从湖南省检测到的双生病毒很可能是从周边省份传入 。湖北省与湖南省相邻 ，并且在２０１５年已有双生病毒发生的报道［２１］，但是两地分离物的亲缘关系却不是最近 （图４ａ），可见分离物亲缘关系的远近并不与地域呈正相关 。由于ＴＹＬＣＶ可随种苗等传播 ，所以有必要在调种前进行检测 ，同时也建议加强田间管理工作 ，及时清除病苗和适时施肥等［２２］；而积极培育选择抗病品种也会在很大程度上减少经济损失 。甘薯卷叶病毒主要侵染旋花科植物 ，在中国从南到北均有发生 ，不但危害了甘薯产业的发展 ，还严重影响了牵牛花的经济价值［７－８］。作为一种主要的观赏植物 ，牵牛花在田间路边随处可见 。研究表明 ，双生病毒可经烟粉虱在牵牛花与作物之间互传 ，作为双生病毒的中间寄主 ，牵牛花对其重组 、传播及扩散都有重要的作用［９］。因此 ，在平时作物生产过程中应加 强 检 疫 ，使 用 无 毒 种 苗 ，发 现 病 株 后 及 时拔除 。ＲＣＡ是一种新近发展起来的恒温核酸扩增方法 ，可以直接从样品总ＤＮＡ扩增目的ＤＮＡ，实现对靶病毒的信号放大 ，在生物大分子检测方面有重要的应用价值 ，同时也提高了双生病毒的检出率［２３－２４］。本研究通过酶切样品的ＲＣＡ产物快速准确地检测到番茄和牵牛花样品中的双生病毒序列 ，进一步明确了该病害在我国的发生及分布情况 ，为双生病毒病害的防控提供了参考 。参考文献［１］Ｈａｎｌｅｙ－Ｂｏｗｄｏｉｎ Ｌ，Ｂｅｊａｒａｎｏ Ｅ Ｒ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｍｉｎ－ｉｖｉｒｕｓｅｓｍａｓｔｅｒｓ ａｔ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｌａｎｔｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１１（１１）７７７－７８８．［２］Ｆｏｎｄｏｎｇ Ｖ Ｎ，Ｐｉｔａ Ｊ Ｓ，Ｒｅｙ Ｍ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｙｎｅｒ－ｇｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｆｒｉｃａｎ ｃａｓｓａｖａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｄｏｕｂｌｅ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｃａｓｓａｖａ ｉｎ Ｃａｍｅｒｏｏｎ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，８１（１）２８７－２９７．［３］Ｓｈａｆｉｑ Ｍ，Ａｓａｄ Ｓ，Ｚａｆａｒ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｐｅｒ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｌａｈｏｒｅｖｉｒｕｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｂ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ＮｅｗＤｅｌｈｉ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｃａｕｓｅ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１０，７（１）３６７－３７４．７３１２０１７［４］Ｍａｎｓｏｏｒ Ｓ，Ｂｒｉｄｄｏｎ Ｒ Ｗ，Ｚａｆａｒ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｈｒｅａｔ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，８（３）１２８－１３４．［５］Ｃｏｈｅｎ Ｓ，Ｈａｒｐａｚ Ｉ．Ｐｅｒｉｏｄｉｃ，ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｔｉｎｕａｌ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆ ａ ｎｅｗ ｔｏｍａｔｏ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｉｔｓ ｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｗｈｉｔｅｆｌｙ（Ｂｅ－ｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ Ｇｅｎｎａｄｉｕｓ）［Ｊ］．Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ｅｔＡｐｐｌｉｃａｔａ，１９６４，７（２）１５５－１６６．［６］宋建军 ，刘红宵 ，仇燕 ，等 ．番茄黄化曲叶病毒病的发生分布及防治对策 ［Ｊ］．北方园艺 ，２０１０（７）１４７－１５０．［７］乔贞贞 ，秦艳红 ，乔奇 ，等 ．甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达 ［Ｊ］．河南农业科学 ，２０１２，４１（４）８６－８９．［８］Ｖａｌｖｅｒｄｅ，Ｒ Ａ，Ｃｌａｒｋ Ｃ Ａ，Ｖａｌｋｏｎｅｎ Ｊ Ｐ Ｔ．Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ，２００７，１（１）１１６－１２６．［９］Ａｌｖｉｎｍ Ｓ，Ｌｉｎｇ Ｋａｉｓｈｕ，Ｈｏｗａｒｄ Ｈ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ，ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓ－ｍｉｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ（ＨｅｍｉｐｔｅｒａＡｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ）［Ｊ］．Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００９，２８（１１）１００７－１０１１．［１０］Ｌｏｔｒａｋｕｌ Ｐ，Ｖａｌｖｅｒｄｅ Ｒ Ａ，Ｃｌａｒｋ Ｃ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２００７，８２（１１）１２５３－１２５７．［１１］王向阳．广西胜红蓟黄脉病样中发现多种菜豆金色花叶病毒属的病毒 ［Ｊ］．植物病理学报 ，２００７，３７（６）６７９－６８２．［１２］周雪平．双生病毒种类鉴定、分子变异及致病机理研究 ［Ｃ］∥中国植物保护学会 ２０１５年学术年会 ，２０１５．［１３］Ｍｏｒｉｏｎｅｓ Ｅ，Ｎａｖａｓ－Ｃａｓｔｉｌｏ Ｊ．Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ，ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｕｓｉｎｇ ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７１（１／２）１２３－１３４．［１４］Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｂ Ｄ，Ｓｗａｎｓｏｎ Ｍ Ｍ，Ｆａｒｇｅｔｔｅ Ｄ．Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｒｏｌｏｇｙ，ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００２，６０（５）２５７－２７１．［１５］Ｒｏｊａｓ Ｍ Ｒ，Ｊｉａｎｇ Ｈａｏ，Ｓａｌａｔｉ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ ｂｅｇｏｍｏｖｉｒ－ｕｓ，Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，２９１（１）１１０－１２５．［１６］Ｂｍｕｇｉｒａ Ｒ Ｂ，Ｗｕ Ｊｉａｎｂｉｎｇ，Ｗｕ Ｚｕｊｉａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃ－ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｖａｓｔｒｕｍ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＦｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．植物病理学报，２００８，３８（３）２５８－２６２．［１７］Ｔａｍｕｒａ Ｋ，Ｓｔｅｃｈｅｒ Ｇ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．ＭＥＧＡ ６Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ－ｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１３，３０（１２）２７２５－２７２９．［１８］Ｆａｕｑｕｅｔ Ｃ Ｍ，Ｂｉｓａｒｏ Ｄ Ｍ，Ｂｒｉｄｄｏｎ Ｒ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｇｅｍｉｎ－ｉｖｉｒｉｄａｅ，ａｎｄ ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｌｉｓｔ ｏｆ ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ａｒ－ｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，１４８（２）４０５－４２１．［１９］Ｇｌｉｃｋ Ｅ，Ｌｅｖｙ Ｙ，Ｇａｆｎｉ Ｙ．Ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｏｗｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｄｉｓｅａｓｅ－ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，４５（３）８１－９７．［２０］苗相伟．番茄黄化曲叶病毒病的研究进展［Ｊ］．中 国 果 菜，２０１７（３）３１－３５．［２１］汤亚飞 ，何自福 ，杜振国 ，等．番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道 ［Ｊ］．植物保护 ，２０１５，４１（５）２３３－２３６．［２２］徐德利 ，杨静 ，鲍继友 ，等．番茄黄化曲叶病毒病综合防控技术研究进展 ［Ｊ］．农业科技通讯 ，２０１４（９）２５４－２５７．［２３］Ｃｈｅｇｌａｋｏｖ Ｚ，Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｙ，Ｂａｓｎａｒ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｖｉｒｕ－ｓｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｒｏｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡｚｙｍｅｓ［Ｊ］．Ｏｒｇａｎｉｃ ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，５（２）２２３－２２５．［２４］Ｊｏｈｎｅ Ｒ，Ｍｌｅｒ Ｈ，Ｒｅｃｔｏｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａ－ｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｉ２９ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１７（５）２０５－２１１．（责任编辑 杨明丽櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍）（上接１２８页）［３］李儒海 ，褚世海 ．二氯喹啉酸对水稻后茬作物的安全性研究［Ｊ］．湖北农业科学，２０１３，５２（２３）５７４９－５７５１．［４］黄翅 ，罗坤 ．降解菌 Ｊ３对茄科作物二氯喹啉酸药害的修复作用［Ｊ］．现代农业科技，２０１５（１２）１３１－１３９．［５］Ｍａｔｔｉｃｅ Ｊ Ｄ，Ｓｋｕｌｍａｎ Ｂ Ｗ，Ｎｏｒｍａｎ Ｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｖ－ｅｒ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｒｉｃｅ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ｉｎ ｅａｓｔｅｒｎ Ａｒｋａｎｓａｓ ｆｒｏｍ ２００２ｔｏ２００８［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｉｌ ａｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，２０１０，６５（２）１３０－１４０．［６］Ｋｙｕｎｇ Ｋ Ｓ，Ｓｕｈ Ｙ Ｔ，Ｌｅｅ Ｊ Ｋ．Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｑｕｉｎｃｌｏ－ｒａｃ ｉｎ ａ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔ－ｇｒｏｗｎ ｌｙｓｉｍｅｔｅｒ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎ－ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，６８（２）１８７－１９８．［７］王一茹 ，刘长武 ，牛成玉 ，等 ．二氯喹啉酸及其代谢物在稻田水土作物中的气谱和液谱残留分析方法研究 ［Ｊ］．农业环境保护 ，１９９６，１５（３）１０２－１０６．［８］陈泽鹏 ，王静 ，万树青 ，等 ．广东部分地区烟叶畸形生长的原因及治理的研究 ［Ｊ］．中国烟草学报 ，２００４，１０（３）３４－３７．［９］李晶新 ，韩锦峰 ，刘华山 ，等 ．二氯喹啉酸对烤烟种子萌发及幼苗生长的影响 ［Ｊ］．河南农业科学 ，２０１０（２）３７－３９．［１０］李丽春 ，陈泽鹏 ，张万良 ，等．二氯喹啉酸在土壤、畸形烟叶和烤烟中残留量的比较分析 ［Ｊ］．农药 ，２０１２，５１（２）１２７－１２９．［１１］张倩 ，郭伟 ，宋超 ，等．二氯喹啉酸在不同土壤中的降解规律及其影响因子 ［Ｊ］．中国烟草科学 ，２０１３，３４（６）８３－８８．［１２］贾菲 ，高贵 ，郑良玉．除草剂二氯喹啉酸的毛细管电泳分析［Ｊ］．分析化学，２００８，３６（１０）１４４０－１４４２．［１３］陈虹 ，钟明 ，唐昊冶 ，等．高效液相色谱法测定土壤中的二氯喹啉酸 ［Ｊ］．土壤 ，２０１６，４８（２）３３７－３４２．［１４］郑雄志 ，曾维爱 ，赵松义 ，等．高效液相色谱技术检测烟草和植烟土壤中的二氯喹啉酸残留量 ［Ｊ］．中国烟草学报 ，２０１２，１９（２）１７－２２．［１５］陈泽鹏 ，王静 ，万树青 ，等．烟区土壤残留二氯喹啉酸的消解动态 ［Ｊ］．农药 ，２００７，４６（７）４７９－４８０．（责任编辑 杨明丽 ）８３１/p