新型月季叶枯病菌产毒条件及毒素化学成分分析_冯友仁.pdf

山 东 农 业 科 学 2017， 49 10 81 ～87 Shandong Agricultural SciencesDOI 10．14083/j． issn．1001 －4942．2017．10．017收稿 日期 2017 －02 －06基 金 项目 天津市农业科学院院长基金项目 15003作者简介 冯友仁 1983 ， 男 ， 硕士研究生 ， 助理研究员 ， 研究方向为植物保护及病虫害生物防治 。E － mail znlfyr126． com新型月季叶枯病菌产毒条件及毒素化学成分分析冯 友 仁 ， 刘宝生 ， 白鹏华 天津市植物保护研究所 ， 天 津 300384摘要 为深入揭示月季叶枯病菌 Pestalotiopsis clavispora 的致病机理 ， 本试验研究了其最优产毒条件 ， 测定了含毒滤液中蛋白质和可溶性糖含量 ， 并借助气相色谱 － 质谱联用仪 GC － MS 对月季叶枯病菌所产毒素中的化学成分进行了分析 。结果表明 ， 不同产毒条件下病菌产毒能力存在明显差异 ， 最佳产毒条件是 pH 7． 0的查彼 液体培养基 、培养温度 25℃、昼夜交替条件 、连续振荡 120 r/min 培养 25 d。含毒滤液的蛋白质浓度为 180 μg/mL， 可溶性糖含量为 2 057．25 μg/mL， 主要化学成分为三氧硅烷 、十甲基环五硅氧烷 、十二甲基环六硅氧烷 、1， 4 二甲氧基 －6， 7， 8， 9 四氢环庚酮 、戊二酸 、氨基甲酸甲酯 。关键词 新型月季叶枯病菌 ; 毒素 ; 产毒条件 ; 气相色谱 － 质谱联用仪 ; 化学成分中图分类号 S685．12 文献标识号 A 文章编号 1001 －4942 2017 10 －0081 －07Analysis on Production Condition and ChemicalComposition of Toxin in Pestalotiopsis clavisporaFeng Youren， Liu Baosheng， Bai Penghua Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin 300384， ChinaAbstract To deeply reveal the pathogenesis of Pestalotiopsis clavispora， the toxin production conditionswere optimized， the contents of protein and soluble sugar in toxin filtrate were measured， and the toxin chemi-cal compositions were analyzed by GC － MS． The results showed that the toxin production ability varied signifi-cantly under different conditions． The best toxin production conditions were Czapek liquid culture medium withpH value of 7．0， 25℃， day alternates with night， continuously shaking for 25 days with the rotational speedof 120 r/min． Moreover， the protein content of toxin was 180 μg/mL． The soluble sugar content of toxin was2 057．25 μg/mL． The chemical compositions of toxin were tripropoxysilane， decamethyl cyclopentasiloxane，dodecamethyl cyclohexasiloxane， 1， 4 dimethoxy －6， 7， 8， 9 tetraheptone， glutarate， methyl carbamate．Keywords Pestalotiopsis clavispora; Toxin; Toxin production condition; Gas chromatogram and massspectra; Chemical composition月 季 Ｒosa chinensis Jacq． 属蔷薇科蔷薇属 ，原产于中国 ， 因其花朵硕大 、花瓣鲜艳阔厚 、花香清新醉人而深受人们喜爱 ， 被我国多个城市定义为市花［ 1］， 在 城 市园林绿化中被广泛应用 。但在种植生长过程中 ， 易受到病虫危害 ， 出现生长不良 、掉叶 、萎蔫 、甚至死亡的现象 ， 既影响观赏效果 ， 又降低了月季本身的经济价值［ 2］。2013 年在天津市新 发现的月季叶枯病［ 3］， 于2014 年 56 月 在 天津市西青区某大型花圃全面爆发 ， 发病率达到 60 以上 ， 引起了月季栽培人员和园林部门的高度重视 。新型月季叶枯病是由半知菌类黑盘孢目黑盘孢科暗色多孢族盘多毛孢属棒状拟盘多毛孢 Pestalotiopsis clavispora Arth． Stey． 引起的真菌性病害 。病害多发自月季基部叶 片 ， 造 成老熟叶片严重脱落 。由于该病害在天津地区属新型病害 ， 有效的防治策略及方法尚不成熟 ， 因此该病害在天津地区有逐年加重趋势［ 4］。毒 素 是指由植物病原菌代谢产生的 、在生理浓度范围内即可干扰植物正常生理功能 、对植物有毒害作用的非酶类化合物［ 5］。前 人 研究表明 ，不同培养基成分对病原菌产毒影响显著 ， 培养时间 、培养温度 、培养液酸碱度 、光照条件等也会造成病原菌产毒能力出现差异［ 6］。拟 盘 多毛孢菌分泌的毒素是导致病害发生及给寄主植物造成伤害的关键影响因子［ 7］， 而有关新型月季叶枯病菌毒 素 的产生条件国内外均鲜见报道 ， 因此明确月季叶枯病菌分泌毒素的条件以及鉴定其毒素组分的结构 ， 可为深入揭示该病害的致病机理 、筛选新型杀菌剂以及制定新的防治方法提供理论依据 。1 材 料 与方法1．1 供 试 菌株由天津市植物保护研究所林木病虫研究室经分离 、纯化 、鉴定后保藏的菌种 ， 并进行了致病性测定 。1．2 培养条件优化筛选1．2．1 生物活性测定方法 将含毒原液用无菌水稀释为原浓度的 10、20、33． 3、50、1005 个浓度 ， 采用叶圆片浸渍法进行生物活性测定 。接毒后的叶片置于 25℃ 培养箱中保湿培养 12 h/12 h 昼夜更替 ， 连续观察 7 d 并记录结果 。叶圆片浸渍法 分别吸取不同浓度的毒素溶液 2 mL 于培养皿中 含滤纸 ; 取月季植株一定部位的叶片 ， 用清水冲洗干净 ， 先用 70 酒精表面消毒 ， 再用无菌水漂洗 3 次 ， 用灭菌滤纸吸干表面水分 ， 用直径为 8 mm 的圆形打孔器打取叶圆片 ， 均腹面向下平放在培养皿中 每皿 6 片 ， 用保 鲜袋封装好 ， 以灭菌的纯水为对照 ， 重复 3 次 。1．2．2 培养液种类 在无菌条件下 ， 分别采用PD 培养液 、PS 培养液 、月季叶煎汁蔗糖培养液 ＲSB 、月季叶煎汁马铃薯培养液 ＲPB 、查彼 培养液对供试菌株进行培养 ， 置于 25℃ 摇床中 ，连续振荡 120 r/min 暗培养 25 d， 重复 3 次 。用叶圆片浸渍法进行毒素的生物活性测定 下同 。1．2．3 培养时间 在无菌 、25℃条件下 ， 将接菌的 pH 7．0 的 PD 培养液在转速 120 r/min 恒温振荡条件下分别暗培养 10、15、20、25、30 d， 重复 3次 。1．2．4 培养温度 在无菌条件下 ， 将接菌的 pH7． 0 的 PD 培养液分别在 10、15、20、25、30℃下 ， 转速 120 r/min 恒温振荡暗培养 25 d， 重复 3 次 。1．2．5 通气量 在无菌 、25℃条件下 ， 将接菌的pH 7．0 的 PD 培养液分别在以下 3 种方式暗培养25 d。静置培养 每天振荡 0． 5 h; 间歇振荡培养 每天振荡 12 h; 连续振荡培养 全天振荡 24 h。转速均为 120 r/min， 重复 3 次 。1．2．6 光照条件 在无菌 、25℃条件下 ， 将接菌的 pH 7．0 的 PD 培养液分别置于全光照 、昼夜自然交替 、全黑 3 种条件下 ， 转速 120 r/min 恒温振荡培养 25 d， 重复 3 次 。1．3 月季叶枯病菌粗毒素的提取与化学性质初步分析1．3． 1 毒素溶液的制备 用直径为 5 mm 的圆形打孔器在活化过的病原菌菌落边缘打菌丝块 ，接入装有 100 mL PD 培养液的三角瓶中 ， 每瓶接4 个菌块 。置于 25℃恒温 、转速为 120 r/min 的摇床中暗培养 14 d 后 ， 将培养的菌液先用双层纱布滤去菌丝 ， 经布氏漏斗 含 2 层滤纸 抽滤 ， 滤液于低温冷冻离心 5 000 r/min 18 min， 上清液即为无菌丝的含毒滤液 。在 45℃ 低压旋转蒸发为原体积的 1/10， 于 5 000 r/min 下离心 18 min， 取上清液 ， 即为毒素原液［ 8］。1．3．2 试 验 试剂①标准蛋白溶液 称取 10 mg 牛血清蛋白 ， 溶于纯水中 ， 用 100 mL 容量瓶定容至刻度 ， 即为 100μg/mL 标准蛋白溶液 。②考马斯亮蓝溶液 精确称取 100．0 mg 考马斯亮蓝 G －250 溶解于 50 mL 95 乙醇溶液中 ，加入 100 mL 85的磷酸 ， 用纯水定容到 1 L， 贮于棕色瓶中 。③蒽酮乙酸乙酯试剂 取 1 g 分析纯蒽酮 ， 溶于 50 mL 乙酸乙酯中 ， 贮于棕色瓶中 ， 放置在黑暗中 。④1蔗糖标准液 取适量蔗糖于 80℃ 烘箱28 山 东 农 业 科 学 第 49 卷烘 至 恒重 ， 先精确称取 1． 00 g 溶解于少量的纯水 ， 再转入 100 mL 的容量瓶中 内含 0． 5 mL 浓硫酸 ， 最后用纯水定容至 100 mL。⑤100 μg/mL 蔗 糖 标准液 取 1 mL 1 蔗糖标准液于 100 mL 容量瓶中 ， 加纯水稀释至 100mL。1．3．3 蛋白质浓度测定 考马斯亮蓝法测定含毒滤液的蛋白质浓度［ 10］。① 标准曲线的绘制 。取 6 支 试 管并编号 ， 按表 1 所示分别加入 100 μg/mL 的标准蛋白和纯水 。摇匀后 ， 各试管中都加入考马斯亮蓝 G －250溶液 5 mL， 将试管摇匀 ， 放置 5 min， 用紫外分光光度计比色测定吸光值 A595 nm。以 A595 nm为 纵 坐标 、标准蛋白质含量为横坐标 ， 绘制标准曲线 。表 1 绘制标准曲线的各试剂加入量试剂试管 编号1 2 3 4 5 6标 准 蛋白质 mL 0 0．2 0．4 0．6 0．8 1．0纯水 mL 1．0 0．8 0．6 0．4 0．2 0蛋白质含量 μg 0 20 40 60 80 100②样 品 的测定及计算 。吸取含毒滤液 0． 2mL、纯水 0． 8 mL 于试管中 ， 再加入考马斯亮蓝G －250溶液 5 mL， 充分摇匀后 ， 放置 5 min， 在 595nm 下比色 ， 测定吸光值 A595 nm， 并 通 过对照标准曲线查得蛋白质含量 。重复 3 次 。计算公式 样品的蛋白质浓度 μg/mL 蛋白量 x μg /0．2 mL。1．3．4 可溶性糖含量测定 蒽酮比色法测定含毒滤液中可溶性糖含量 。① 标准曲线的绘制 。取6 支试管并编号 ， 按表 2 中的顺序依次加入试剂 ，摇匀后立即放入沸水浴中 1 min， 取出后自然冷却 ，在 630 nm 下比色 ， 测定吸光值 A630 nm， 重 复 3 次 ， 以吸 光值 A630 nm为 纵 坐标 、反应蔗糖量 μg 为横坐标 ， 绘制标准曲线 。表 2 绘制标准曲线的各试剂加入量试 剂试 管 编号1 2 3 4 5 6100 μg/mL 蔗糖 mL 0 0．2 0．4 0．6 0．8 1．0纯 水 mL 2．0 1．8 1．6 1．4 1．2 1．0蒽酮乙酸乙酯试剂 mL 0．5 0．5 0．5 0．5 0．5 0．5浓硫酸 mL 5 5 5 5 5 5蔗糖 μg 0 20 40 60 80 100② 样品的测定及计算 。将月季叶枯病菌含毒 滤 液稀释 5 倍 。在试管中依次加入稀释后的毒素溶液 0． 2 mL、纯水 1． 8 mL、蒽酮乙酸乙酯试剂0．5 mL、浓硫酸 5 mL， 立即放入沸水浴中 1 min，取出后自然冷却 。在 630 nm 下比色 ， 测得吸光值 ， 并将平均值带入标准曲线求出毒素滤液反应蔗糖量 。重复 3 次 。计算公式 样品的可溶性糖浓度 μg/mL 稀释倍数 可溶性糖 x μg /0．2 mL。1．4 气相色谱 － 质谱联用法测定含毒滤液原液的化学成分采用安捷伦 7890A 气相色谱 ， HP －5 石英毛细管柱 30 m 0．32 mm 0．25 μm ; 程序升温 40℃ 保持 1 min， 8℃ /min 升到 160℃， 再以 12℃ /min升到 250℃， 后运行 280℃ 1 min; 柱流量 1．0 mL/min; 进样口温度 250℃; 柱前压 100kPa; 进样量 1 μL; 分流比 20 ∶ 1; 载气 高纯99．999氦气 。采用安捷伦 7200 型气相色谱 /四极杆飞行时间质谱仪 ， 电离源 EI; 扫描质量范围 50 ～700 m/z; 气质接口温度 280℃; 离子源温度 230℃; 采用 NIST11 标准谱库检索定性［ 11］。2 结 果 与分析2．1 毒素生物活性测定2．1．1 月 季 叶枯病菌毒素对叶圆片的影响 采用叶圆片浸渍法［ 9］测定不同稀释倍数的毒素溶液对月季离体叶片的影响 。月季叶圆片经过不同浓 度 的毒素处理 ， 1 d 后边缘均出现褪绿斑 ， 1 倍与 2 倍稀释液出现褪绿斑的叶圆片数量增多 ， 褪绿斑不断扩大 ， 颜色也相对不断加深 。4 d 后所有叶圆片全部出现褪绿斑 ， 并且大部分完全变为黑褐色 ; 3 倍稀释液的褪绿斑约为叶圆片面积1/2。5 倍释液处理 7 d 后 ， 褪绿斑大约为叶圆片面积的 1/5; 10 倍稀释液处理 7 d 后 ， 大部分叶圆片基本无明显变化 图 1 。2．1．2 月季叶枯病菌毒素对针刺离体叶片的影响 月季叶片经过不同浓度的针刺 ， 1 d 后无明显效果 ， 2 d 后 1 倍与 2 倍稀释液处理下 ， 针刺部位出现明显的褪绿斑 ， 3 d 后 5 倍稀释液开始出现褪绿斑 ， 6 d 后 10 倍稀释液处理开始出现褪绿斑 ，但现象不是很明显 ， 随着天数的增加 ， 病斑并没有明显改变 。38第 10 期 冯友仁 ， 等 新型月季叶枯病菌产毒条件及毒素化学成分分析图 1 毒素 原液 1 倍和 5 倍稀释液 7 d 后对月季叶碟的影响2．2 培 养 条件筛选2．2．1 最优培养液 由表 3 可以看出 ， 培养液对病原菌产毒有很大的影响 ， 其中以在查彼 液体培养液中产毒量最高 ， 出现褪绿病斑的现象最为明显 ， 其次是 PD 培养液和 PS 培养液 ， 月季叶枯病菌在月季叶煎汁蔗糖培养液中的产毒能力最弱 。表 3 不同培养液对月季叶枯病菌产毒的影响培养 液褪绿斑大小 mm第 3 d 第 7 dPD 4．50 0dC 7．20 0．35abABPS 5．63 0．13bB 6．66 0．38bBCＲPB 5．10 0．10cB 5．73 0．05cCＲSB 1．33 0．30eD 4．23 0．23dD查 彼 7．80 0．56aA 8．00 0aA注 经 Duncan’s 新 复 极差法检验 ， 同列数据中不同小写字母表示 0．05 水平上差异显著 ， 大写字母表示 0．01 水平上差异显著 。2．2．2 最 优 培养时间 不同培养时间对月季叶枯病菌毒素的产生有很大影响 。图 2 结果表明 ，培养时间少于 25 d 毒素各处理对叶圆片褪绿程度随毒素培养时间增加而加重 ， 说明毒素的产生量随培养时间的增加而增加 。培养 30 d 的含毒培养液 1 d 就可以使全部叶碟出现褪绿病斑 ， 与培养 25 d 的含毒培养液效果相同 ， 从而推断 25 d后毒素含量基本保持在 25 d 的水平上 。2．2．3 最优培养温度 月季叶枯病菌在试验设定的温度范围内均能产毒 ， 温度对该菌的产毒能力影响显著 。培养温度低于 20℃时 ， 毒素产量随温度的升高而增加 ; 在 25℃和 30℃条件下得到的含毒培养液 2 d 后产生褪绿病斑的大小基本相同 。图 2 不同培养时间对月季叶枯病菌产毒的影响图 3 不同培养温度对月季叶枯病菌产毒的影响2．2．4 最佳 通气量 在其他条件一定的情况下 ，全天振荡培养的产毒量最大 ， 叶碟浸泡 3 d 后平均产生 5．4 mm 左右的褪绿病斑 ; 间歇振荡培养的产毒量次之 ， 叶碟浸泡 3 d 后平均产生 4． 9 mm左右的褪绿病斑 ; 静置培养的产毒量最低 ， 叶碟浸泡 3 d 后平均产生 4． 7 mm 左右的褪绿病斑 。结果表明 ， 全天振荡培养的情况下 ， 月季叶枯病菌产毒能力较强 。2．2．5 最优光照条件 在其他条件一定的情况48 山 东 农 业 科 学 第 49 卷下 ， 自 然 昼夜交替条件下月季叶枯病菌产毒能力最强 ， 含毒培养液 7 d 可造成 5． 8 ～6． 5 mm 的褪绿病斑 ; 全黑培养条件下产毒能力有所下降 ， 含毒培养液 7 d 可造成 4． 9 ～5． 9 mm 的褪绿病斑 ; 全光照条件下产毒能力最差 ， 7 d 所造成的褪绿病斑大小为 4．7 ～5．0 mm 左右 。说明 ， 光照对于该菌的产毒积累具有一定程度的抑制作用 ， 自然昼夜交替条件最有利于产毒 。2．3 月季叶枯病菌含毒滤液中蛋白质和可溶性糖含量的测定2．3．1 含毒滤液蛋白质含量 经测定 ， 月季叶枯病菌毒素的吸光值为 0． 657， 根据图 4 蛋白质标准线性回归方程求得毒素中蛋白质含量为 36μg， 代入公式 1 ， 计算出毒素原液中蛋白质浓度为 180 μg/mL。图 4 蛋白质的标准曲线2．3．2 含毒滤液可溶性糖含量 经测 定 ， 月季叶枯病菌毒素 5 倍稀释液的吸光值平均值为 0．581，根据图 5 可溶性糖的标准线性回归方程求得毒素中可溶性糖含量为 82． 29 μg， 代入公式 2 求得毒素原液中可溶性糖浓度为 2 057．25 μg/mL。图 5 可溶性糖的标准曲线2．4 含毒滤液的化学成分借 助 气相色谱 － 质谱联用法对毒素原液中的主要化学成分进行分析 ， 采用 NIST11 标准谱库检索定性 ， 检测出以下 6 种主要化学成分 ， 分别为三氧硅烷 、十甲基环五硅氧烷 、十二甲基环六硅氧烷 、1， 4 二甲氧基 －6， 7， 8， 9 四氢环庚酮 、戊二酸 、氨基甲酸甲酯 ， 每种化学物质的质谱图见图 6 ～图 10。图 6 月季叶枯病菌毒素原液中三氧硅烷质谱图图 7 月季叶枯病菌毒素原液中十甲基环五硅氧烷质谱图图 8 月季叶枯病菌毒素原液中十二甲基环六硅氧烷质谱图图 9 月季叶枯病菌毒素原液中 1， 4 二 甲 氧基 －6， 7， 8， 9四氢环庚酮质谱图58第 10 期 冯 友 仁 ， 等 新型月季叶枯病菌产毒条件及毒素化学成分分析图 10 月季叶枯病菌毒素原液中戊二酸质谱图图 11 月季叶枯病菌毒素原液中氨基甲酸甲酯质谱图3 讨 论 与结论本试验分别采用叶圆片浸渍法和离体叶片针刺 法 对月季叶枯病菌进行生物活性测定 ， 发现叶圆片浸渍法效果较为显著 ， 且操作相对简便 ; 含毒滤液浓度越高 ， 毒素致病力越强 。与于丽娜等［ 12］研究冬枣黑疔病病原菌毒素致病机制及黄秀萍［ 8］研 究 雷公藤角斑病毒素致病机理的结果相近 ， 均发现毒素浓度越大 ， 对植物组织的伤害越大 。培养条件对真菌毒素活性影响明显 ， 不同的培养条件如 培养基 、培养温度 、培养时间 、通气条件及光照条件等都是影响产毒的重要因素 。前人对致病真菌毒素的培养条件做了大量研究 。李小波等［ 13］研 究 发现番茄叶霉病菌产毒的最佳培养液为 PS 培养液 ， 高洪敏和陈捷［ 14］发 现 禾谷镰孢菌在 Ｒichard 培养基产生毒素的活性最高 ， 彭建华等［ 15］发 现 橡胶多主棒孢病菌最佳产毒培养基是改良的 Fries3 号培养基 ， 可见不同菌株对培养基存在选择性 。蒋继志［ 16］、朱 天 辉［ 17］、潘 阳［ 18］等分别对石楠拟盘多毛孢菌 、暗 孢 节菱孢菌 、大豆毛口壳叶斑病菌的产毒条件做了研究 ， 均发现不同病原真菌的最佳产毒条件不尽相同 。本研究发现月季叶枯病菌产毒条件为 最佳培养液查彼 ， 最佳培养时间 25 d， 最适产毒温度大约在 25 ～30℃之间 ， 通气量越充足产毒越好 ， 在昼夜交替条件下最有利于产毒 。由于作者之前已研究过该菌的生物学特性 ， 因此本试验未对产毒 pH 条件进行研究 。该菌的最佳产毒条件为温度 25℃， 与其生物学特性研究中该菌的最适生长温度相一致 ， 证明温度对于新型月季叶枯病的发病条件有很强的制约性 。当温度达到适宜温度左右 ， 病害便可以在月季叶片上迅速生长 ， 这也符合 2014 年的田间调查结果 ， 即该病害在当年的 5 月下旬到 6 月上旬和 9 月中旬前后在天津花圃大规模爆发 。对病原菌毒素溶液中蛋白质和可溶性糖含量的初步研究发现 ， 毒素粗提液中可溶性糖含量较高 ， 但后期仍需通过 ɑ － 萘酚反应 、班乃德反应和茚三酮反应等化学测定和薄层层析等手段进一步分析确定毒素中所含的具体是哪种或哪几种多糖［ 19］。气 相 色谱和质谱仪对毒素粗提液的化学成分的检测发现 ， 主要有 6 种化学物质 ， 分别为三氧硅烷 、十甲基环五硅氧烷 、十二甲基环六硅氧烷 、1， 4 二甲氧基 －6， 7， 8， 9 四氢环庚酮 、戊二酸 、氨基甲酸甲酯 。近年来国内外从内生拟盘多毛孢菌 Pestalotiopsis sp． 中发现了许多活性代谢产物 ， 其中有些甚至具备抗氧化 、抗高血压 、抗真菌等生物活性 ， 具有很好的药用开发潜质 。其代谢产物复杂多样 ， 除产生一些常见的化合物如齐墩果酸 、2 － 羟基 －3 － 苯基丙酸甲酯 、菜油甾醇 、过氧麦角甾醇 、D － 阿洛醇 、乌苏酸 、3 － 羟基 －4 －甲氧基苯乙烯 、邻苯二甲酸二异丁酯 、3， 4 － 二羟基苯乙醇 、对羟基苯乙醇［ 20］等 ， 还 有 许多结构新颖且活性显著的代谢产物 ， 但大致可以将这些代谢产物分为萜类 、生物碱类 、异香豆素和香豆素类 、醌类和半醌类 、色酮类和脂类等［ 21］。但 本 研究对象是从月季病叶上分离出来的致病真菌 ， 非月季本身内生的拟盘多毛孢菌 ， 因此 ， 本研究发现的 6 种主要化学物质对于拟盘多毛孢菌代谢产物的化学成分研究是一个很好的补充 。此外 ， 郑永标等［ 22］2011 年 从 一株拟盘多毛孢菌 Pestalotiop-sis sp． 的静置发酵培养液中通过硅胶和凝胶柱层析法分离和纯化化合物 ， 然后借助核磁共振波普分离到一个倍半萜的新化合物和一个已知化合物 4 － 羟基苯乙醇 。早在 1997 年董金皋和李正平［ 23］就 对 一些病原菌的致病毒素及其可能的化学结构进行了总结 ， 但其中并未涉及到由棒状拟68 山 东 农 业 科 学 第 49 卷盘 多 毛孢菌引起的植物病害 ， 因此弄清不同化学物质在对寄主植物毒害作用中所发挥的不同作用 ， 对今后进一步深入探讨棒状拟盘多毛孢菌毒素的致病机理具有十分重要的意义 。此外毒素对月季生理生化的影响还需深入研究 ， 主要是含毒滤液处理月季叶片后 ， 月季叶片受到胁迫并诱导自身产生系统抗病性 ， 体现为超氧化物歧化酶 、过氧化物酶等防御酶活性的变化 。真菌毒素的稳定性是毒素产生和积累的重要因素 。热稳定性 、酸碱稳定性以及耐储稳定性等对于病原真菌毒素的活性都有较大影响 ， 这可能与毒性物质的化学组成有关 。本研究发现 ， 月季叶枯病菌毒素中可溶性糖含量要比蛋白质含量高 ， 因此推测该菌的毒素稳定性可能相对比较稳定 ， 但具体结论仍需进一步稳定性试验结果的支持 。本研究内容对于天津市新型月季叶枯病菌发病规律和防控措施的制定提供了重要的参考依据 ， 具有重要的理论意义 。随着月季叶枯病菌致病机理的进一步深入研究 ， 本文涉及的相关研究内容略显浅显 ， 仍需后人进一步研究 。参 考 文 献 ［ 1］ 于 红 革 ， 崔红 ． 两类月季病害的防治 ［ J］ ． 中国花卉盆景 ，2002 8 32．［ 2］ 严桂 华 ， 曹萍 ． 月季主要病虫害及其防治 ［ J］ ． 现代农业科技 ， 2007 22 94 －97．［ 3］ Feng Y Ｒ， Liu B S， Sun B B． First report of leaf blotch causedby Pestalotiopsis clavispora on Ｒosa chinensis in China［ J］ ． PlantDisease， 2014， 98 7 1009［ 4］ 冯友 仁 ， 刘宝生 ， 白鹏华 ． 天津市新型月季叶枯病病原菌鉴定及生物学特性研究 ［ J］ ． 北方园艺 ， 2015 14 125 －129．［ 5］ 许志 刚 ． 普通植物病理学 第三版 ［ M］ ． 北京 中国农业出版社 ， 2003．［ 6］ 张淑珍 ． 植物病原菌毒素研究进展 ［ J］ ． 黑龙江农业科学 ，2001 2 42 －43．［ 7］ 李 向 彬 ， 蒋继志 ， 郭会婧 ． 草莓根腐病菌致病物质的初步研究 ［ J］ ． 河北农业大学学报 ， 2008， 31 2 42 －43．［ 8］ 黄秀 萍 ． 雷公藤角斑病菌的毒素提取及致病机理的初步研究 ［ D］ ． 福州 福建农林大学 ， 2012．［ 9］ 朱涛 ， 杨会敏 ， 卢东升 ． 茶树轮斑病病原菌毒素生物测定方法研究 ［ J］ ． 安徽农业科学 ， 2009， 37 5 1991 －1994．［ 10］ 杜化 仿 ， 张茹琴 ， 夏淑春 ， 等 ． 花生叶腐病菌毒素提取及致病性研究 ［ J］ ． 青岛农业大学学报 自然科学版 ， 2011， 28 2 99 －102．［ 11］ 蒋潇 ， 田 静 ． 三个产地艾叶挥发油的化学成分分析 ［ J］ ． 中国民族民间医药 ， 2015， 24 17 19 －22．［ 12］ 于丽 娜 ， 闫红飞 ， 宗淑萍 ， 等 ． 冬枣黑疔病病原菌毒素致病机制研究 ［ J］ ． 河北农业大学学报 ， 2008， 31 1 33 －36．［ 13］ 李小 波 ， 康立功 ， 路盼 ， 等 ． 番茄叶霉病菌产毒条件研究［ J］ ． 植物保护 ， 2010， 36 1 83 －86．［ 14］ 高 洪 敏 ， 陈捷 ． 玉米茎腐菌毒素的产生条件和化学特征的初步研究 ［ J］ ． 沈阳农业大学学报 ， 1999， 30 3 223 －226．［ 15］ 彭建 华 ， 郑春耀 ， 潘羡心 ， 等 ． 橡胶树多主棒孢病菌强致病菌株的筛选及产毒条件优化 ［ J］ ． 热带作物学报 ， 2009， 30 4 520 －524．［ 16］ 蒋继 志 ， 李向彬 ， 桂春爽 ， 等 ． 石楠拟盘多毛孢毒素产生条件初探 ［ J］ ． 微生物学通报 ， 2009， 36 1 46 －50．［ 17］ 朱天 辉 ， 李姝江 ， 车冠男 ． 暗孢节菱孢菌蛋白类毒素产生条件研究 ［ J］ ． 四川农业大学学报 ， 2011， 29 4 518 －523．［ 18］ 潘阳 ， 朱 晓峰 ， 王媛媛 ， 等 ． 大豆毛口壳叶斑菌产毒素的研究［ J］ ． 植物病理学报 ， 2011， 41 6 596 －603．［ 19］ 王明 旭 ， 叶茂 ， 罗宽 ， 等 ． 毛竹枯梢病病原菌毒素的生物测定及成分研究 ［ J］ ． 湖南环境生物职业技术学院学报 ， 2001， 7 1 28 －32．［ 20］ 邓慧 颖 ， 邢建广 ， 罗都强 ． 海莲内生真菌 Pestalotiopsis clavis-pora 代谢产物研究 ［ J］ ． 菌物学报 ， 2011， 30 2 263 －267．［ 21］ 白志 强 ， 林秀萍 ， 刘永宏 ． 内生拟盘多毛孢菌化学成分研究进展 ［ J］ ． 天然产物研究与开发 ， 2013 25 706 －715．［ 22］ 郑永 标 ， 陈丹霞 ， 李军进 ， 等 ． 拟盘多毛孢菌中新倍半萜的分离与结构解析 ［ J］ ． 中国天然药物 ， 2011 9 421 －424．［ 23］ 董金 皋 ， 李正平 ． 寄主选择性植物病原真菌的毒素化学［ J］ ． 微生物学通报 ， 1997 24 247 －250．78第 10 期 冯 友 仁 ， 等 新型月季叶枯病菌产毒条件及毒素化学成分分析