微型月季花粉离体萌发培养基组分的优化_宋杰.pdf

山西农业科学 2018， 46（ 3） 320-324 Journal of Shanxi Agricultural Sciences微型月季花粉离体萌发培养基组分的优化宋 杰1，2，3，许 凤1，2，3，张 露1，2，3，李世 峰1，2，3，解玮 佳1，2，3，李树 发1，2，3，王继 华1，2，3，李绅 崇1，2，3（ 1.云南省农业科学院花卉研究所 ， 云南 昆明 650205； 2.云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205；3.国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650205）摘 要 采用液体培养法研究了不同培养基组 分 对 微型月季 Unconditional Love 花粉萌发和花粉管生长的影响，旨在为微型月季花粉活力检测和杂交育种提供参考。 结果表明，在液体培养基内添加蔗糖、 硼酸、 硝酸钙、 硫酸锌、 硫酸镁和硝酸钾，均能促进微型月季 Unconditional Love 花粉萌发和花粉管生长；在一定范围内，花粉萌发率和花粉管生长长度均随培养基组分添加量的增加而增加，但超过一定添加量时，则出现抑制作用；在此基础上通过正交试验，比较了蔗糖 、硼酸和硝酸钙对花粉萌发和花粉管生长的影响，结果表明，最适合微型月季花粉萌发的蔗糖 、硼酸和硝酸钙 3 种组分的培养基配方为蔗糖 150 g/L＋H3BO3125 mg/L＋Ca（ NO3）24H2O100 mg/L。关键词 微型月季；培养基组分； 花粉萌发； 花粉管生长中图 分 类号 S685.12 文献 标 识码 A 文章 编 号 1002-2481（ 2018） 03-0320-05Optimization of Medium Components for Pollen of Rosahybrida var. Minima in vitro GerminationSONGJie1， 2， 3， XUFeng1， 2， 3， ZHANGLu1， 2， 3， LI Shifeng1， 2， 3， XIE Weijia1， 2， 3，LI Shufa1， 2， 3， WANGJihua1， 2， 3， LI Shenchong1， 2， 3（ 1.Institute ofFlower， Yunnan AcademyofAgricultural Sciences， Kunming650205， China； 2.KeyLaboratoryofYunnan FlowerBreeding， Kunming650205， China； 3.National EngineeringResearch Center for Ornamental Horticulture， Kunming650205， China）Abstract The effects of different medium components on pollen germination and pollen tube growth of Rosa hybrida var. MininaUnconditional Love were studied wih liquid culture, so as to provide reference for pollen viability detection and hybridization breeding ofRosa hybrida var.Minina.Theresultsshowedthatintheliquidmediumwithsucrose,H3BO3,Ca（ NO3）24H2O,ZnSO47H2O, MgSO47H2O,KNO3couldpromotethe Rosa hybrida var.MininaUnconditionalLovepollengerminationandpollentubegrowthinacertainrange, butthisfunctionwasinhibitedifexceeded acertain amount. Orthogonaltestbased on theeffectsofsucrose, H3BO3, and Ca（ NO3）24H2Oon pollengermination and pollen tube growth were compared and screened out the most suitable culture medium for pollen germination of Rosahybrida var. Minina Unconditional Love, which was sucrose 150 g/L＋H3BO3125 mg/L＋Ca（ NO3）24H2O100 mg/L.Key words Rosa hybrida var. Minina; culture mediumcomposition; pollen germination; pollen tube growth收 稿 日 期 2017- 12- 06基金 项 目 云南省科技惠民专项 （ 2014RA053）；云南省科技创新强省计划项目（ 2014AB014）；云南省科技人才引进与培养专项（ 2016HA005）作者 简 介 宋 杰（ 1980-） ，男，山西长治人，助理研究员，主要从事园林花卉种质资源创新方面研究。李绅崇为通信作者。doi10.3969/j.issn.1002-2481.2018.03.03微型 月 季（ Rosa hybrida var. Minima）是蔷薇科蔷薇属多年生灌木，其花 、叶 、枝 、刺等形态特征都比一般的月季要小，而且花色丰富，花形美丽，株型秀丽可爱，是一种重要的园林观赏植物，被广泛用作园林地被和盆花[1-2]。微型月季具有广阔的市场前景 ， 因此，其新品种的选育工作具有极其重要的价值。然而，微型月季自交或杂交的结实率很低，通过杂交这一传统育种方法选育新品种是微型月季育种的难点。 以往国内对于微型月季的研究主要集中在繁殖和栽培等方面[3-8]，对于其育种方面的研究也仅限于资源和品种分类[9]、亲本 分 析[10]、花粉 形 态[2]等，而关于微型月季花粉萌发和花粉管生长方 面 的研究则鲜见报道。本研究以微型月季品种 Unconditional Love（无条件的爱）为试验材料，检测和分析其花粉在不同培养基组分中的花粉萌发率和花粉管生长长度，并确定最适合其花粉萌发的培养基配方，旨在为微型月季的花粉活性检测和杂交育种的亲本选择提供参考依据。320 宋 杰等微型月季花粉离体萌发培养基组分的优化表 1 培养基各组分浓度梯度培养基组分蔗糖 /（ g/L）H3BO3/（ mg/L）Ca（ NO3）24H2O/（ mg/L）MgSO47H2O/（ mg/L）KNO3/（ mg/L）ZnSO47H2O/（ mg/L）梯度设置0， 50， 100， 150， 200， 250， 3000， 25， 50， 75， 100， 125， 150， 2000， 50， 100， 150， 200， 250， 3000， 10， 25， 50， 100， 1500， 10， 25， 50， 100， 1500， 10， 25， 50， 100， 1502.1.2 硼酸 由 图 2 可知，当硼酸的添加量为 0～125 g/L时，花粉萌发率随硼酸质量浓度的增加而升高，花粉萌发率在硼酸质量浓度为 125 mg/L时达到峰值，为 8.47，之后随着硼酸质量浓度的增加而降低 。花粉管生长的最佳硼酸浓度也为 125 mg/L，此时花粉管长度为 893.80 μm。2.1.3 钙 从图 3 可以看出，微型月季 UnconditionalLove 的花粉萌发率随着钙离子浓度的增加同样呈先升高而后降低的变化趋势，花粉萌发率的最高值为 16.34，出现在 Ca（ NO3）24H2O 质量 浓 度为150 mg/L时，而且此时花粉管生长的长度最长，为726.61 μm。1 材料 和 方法1.1 材料供试花粉的微型月季品种为 UnconditionalLove（无条件的爱），采自云南省农业科学院花卉研究所晋宁大春河基地内 。2017 年 4 月采集生长健壮的植株上饱满且未开放的花朵，在实验室内将其花药从雄蕊上剥下，置于培养皿中，将培养皿放置在干燥皿中干燥至花药破裂，用试管将散出的花粉进行收集，贮藏于 - 20℃冰箱中。1.2 方 法1.2.1 培养 基 的配制 参考王岚岚等[11]的方 法 ，以100 g/L 蔗糖， 50 mg/L H3BO3， 100 mg/L Ca（ NO3）24H2O为培养基的基本组分 。培养基各组分浓度梯度设置 如 表 1 所示 。其中，蔗糖 、H3BO3和 Ca（ NO3）24H2O的浓度梯度以不加该物质为对照。1.2.2 花粉的培养方法和培养时 间 的 确定 采用液体培养法进行花粉培养。 萌发试验均在花粉采集后 24 h 内进行。 将收集的花粉充分混匀，用移液枪取制备好的培养液 200 μL放入 1 mL 离心管内，加入适量花粉（约用牙签蘸 2 次），混合均匀后将离心管放入 28℃恒温箱中暗培养 4 h。1.2.3 花粉萌发率和花粉管生长长度的测定 用移液枪取 15 μL培养 4 h 后的花粉悬浮液于载玻片上，在带有摄像系统的光学显微镜（ LEICA DM6000B）下拍照记录 。当花粉管生长的长度大于花粉粒的直径时，认为花粉萌发 。通过统计萌发和未萌发的花粉粒数来计算花粉萌发率，花粉萌发率（ ） ＝萌发的花粉数 / 总花粉数 100％。采用显微镜自带的拍照系统测量每个视野中花粉管的长度，从而计算出花粉管生长的平均长度。每个培养基组分的浓度梯度均设置 3 次重复，每个重复观测 5 个视野，每个视野内所统计的花粉粒数量大于 50 粒。1.2.4 正交试验设计 在单因子试验的基础上，选择对微型月季花粉萌发影响较大的培养基组分，采用 L25（ 56）正交试验设计， 优化基本培养基组分的 最佳组合。1.3 数 据 处 理采用 SPSS 18.0 软件进行数据的统计分析，各处理间差异显著性水平为 P＜0.05。2 结果 与 分析2.1 不同 培 养基组分对花粉萌发和花粉管生长的影响2.1.1 蔗糖 由 图 1 可知，花粉萌发率随蔗糖浓度的增加先升高而后降低，当蔗糖浓度为 100 g/L 时，花粉萌发率达到最大值（ 5.23），且与其他浓度处理间呈显著性差异。 适合花粉管生长的最佳蔗糖浓度为 100～250 g/L，此时花粉管的长度为 516.07～546.90 μm，但差异不显著。321 山西农业科学 2018 年第 46 卷第 3 期2.1.4 锌 、镁 、钾 由图 4 可 知，花粉萌发率和花粉管长度随着锌 、镁和钾的质量浓度增加均出现先升高再降低的现象。 其中，当锌质量浓度为 25mg/L时，花粉萌发率最大（ 13.04），锌质量浓度为 10 mg/L时，花粉管最长（ 491.62μm）；镁质量浓度为 100mg/L时，花粉萌发率最大 （ 16.95），且花粉管最长（ 497.54 μm）；钾质量浓度为 50mg/L 时，花粉萌发率最大（ 5.02），钾质量浓度为 100 mg/L 时，花粉管最长（ 447.52 μm） 。2.2 蔗糖 、B 和 Ca 三因子正交试验对花粉萌发和花粉管生长的影晌通过单因子试验， 确定蔗糖 、硼 酸和硝酸钙这3 种组分对微型月季 Unconditional love 花粉萌发的影响较大。 因此，进一步采用正交试验设计，筛选这 3 种组分最佳的组合（表 2） 。结果表明，在蔗糖150g/L＋H3BO3125mg/L＋Ca（ NO3）24H2O100mg/L的处理组中，微型月季 Unconditional love 的花粉萌发率最高，为 25.10，且用该培养基培养时，花粉管生长长度为 251.13 μm，仅次于蔗糖 250 g/L＋H3BO375 mg/L＋Ca（ NO3）24H2O 200 mg/L 的处理组，且生长良好，未出现异常 。对表 2 中的数据进行方差分析，得到的结果如表 3 所示。从表 3 方差分析结果可以看出，蔗糖、 H3BO3和Ca（ NO3）24H2O 对花粉萌发率的影响均 达 到显著水平， 3 个因子对花粉萌发率的影响从大到小依次为蔗糖 ＞H3BO3＞Ca（ NO3）24H2O；蔗 糖 和 H3BO3对花粉管生长长度的影响达到显著水平 ， 且影响的显著性为 H3BO3＞蔗糖 ， Ca（ NO3）24H2O 对花 粉 管生长长度的影响未达到显著水平。 方差分析的结果与直观分析的结果一致。322 3 结论 与 讨论花粉离体培养需要一定的糖、 硼酸 和 钙，不同植物花粉萌发的适宜培养基不尽相同，它们的浓度大小很大程度上影响着花粉的萌发和花粉管的生长。 糖类物质是花粉萌发及花粉管生长的重要营养成分，在花粉萌发过程中，能够为花粉提供能源 、调节渗透压，同时，它还是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质[12-14]。本试验结果表明， 蔗糖对花粉的萌发影响显著 。供试的微型月季花粉萌发率在一定蔗糖浓度范围内，先升高而后降低，在蔗糖质量浓度为 150 g/L时，花粉萌发率最高，当蔗糖质量浓度大于 200 g/L时，花粉萌发率开始下降，表明低浓度的蔗糖可促进花粉萌发，而高浓度的蔗糖可能会抑制花粉萌发，这与许多在其他园艺植物上的研究结果一致[15-16]。此外，一些针对大花香水类 、丰 花 类和藤本类等月季的花粉萌发研究认为， 150～200 g/L的蔗糖浓度为月季花粉最优的萌发条件[11， 17-18]，而 本研 究认为， 100～150 g/L 的蔗糖浓度较适宜微型月季花粉的萌发，这可能是由微型月季花粉的渗透压比其他花型较大的月季低所致。硼酸参与果胶物质的合成，有利于花粉管壁的建造[19]。植物缺硼的症状首先出现在快速生长的部位， 如 根尖和花粉管尖端，其特征一般为细胞壁异常[20]。花柱组织中存在的钙离子主要通过花粉管上的钙离子通道来调节花粉管内的动态变 化 ，从而影响花粉管的生长[21]。一般情况下，植物花粉粒内所含的硼和钙是难以满足花粉萌发和花粉管生长需求的， 自然状态下则由柱头和花柱内的 硼和钙来弥补[22]。但花粉在离体培养时， 花粉没有条件从柱头表 2 正交试验中微型月季 Unconditional love 花粉的萌发率和花粉管长度花粉萌发率 /02.030.182.610.162.540.172.540.173.240.314.490.554.510.293.540.211.970.422.180.3311.000.2416.441.4918.730.7318.431.4217.210.3925.101.3913.471.1314.551.019.980.629.020.3512.441.2113.972.366.270.906.081.39花粉管长度 /μm0127.3020.75181.2912.63176.071.88127.9133.10213.5648.94160.6341.60109.4011.0383.783.1858.948.7958.452.98251.0019.38232.5148.85247.8143.89246.799.18135.8235.11251.1332.9052.019.13153.3527.62168.5528.79235.1158.23210.0629.72252.3417.54117.5313.21142.336.46Ca（ NO3）24H2O/（ mg/L）050150200100050100200150500150200100501002001500015020050100编号12345678910111213141516171819202122232425蔗糖 /（ g/L）000005050505050100100100100100150150150150150250250250250250H3BO3/（ mg/L）0257512520075125200250020075125257512502002512525750200表 3 方差 分 析结果F66.12*13.56*8.78*MS553.08113.4173.478.37变异来源蔗糖H3BO3Ca（ NO3）24H2O误差总变异SS2 212.30453.63293.865 18.6399 445.00df4446275花粉萌发率F8.09*19.50*1.28MS22 132.7053 342.373 488.652 735.07SS88 530.82213 369.4713 954.60169 574.132416 718.53df4446275花粉管长度注 * 表示差异达到 0.05 的显著水平 。宋 杰等 微型月季花粉离体萌发培养基组分的优化323 山西农业科学 2018 年第 46 卷第 3 期和花柱内获取硼和钙， 要满足花粉的萌发和 花粉管的正常生长，就必须在培养基中添加一定量的外源硼和钙 。植物种类不同，其花粉萌发和花粉管生长所需的最适硼酸和钙离子的浓度也不同。 本试验结果表明，微型月季花粉离体培养最适宜的硼酸质量浓度为 75～125 mg/L，这与 CHRYSOTHEMIS 等[17]、王岚 岚 等[11]的研究结果一致 ； 最适的钙质量浓度是100～150 mg/L，远高于 CHRYSOTHEMIS 等[17]研究得出的 10 mg/L为最适浓度，这可能是由微型月季的特殊性所致。镁在植物核酸和蛋白质代谢中起重要作用；钾在植物的糖类物质代谢 、蛋白质代谢及呼吸作用中起重要作用，同时钾也是构成植物细胞渗透势的重要物质；锌是吲哚乙酸合成所必需的元素，进而对蛋白质的合成有促进作用 。本试验结果表明，适宜浓度的镁 、钾 、锌对微型月季花粉的萌发均有促进作用，且其对微型月季花粉萌发促进作用的大小依次为镁 、锌 、钾 。这与王岚岚等[11]的研究结果认为，镁 和 钾的浓度梯度变化对月季花粉萌发率无显著性差异的结果有出入 。究其原因，应该是本试验是在含有蔗糖 、硼酸和钙的基本培养基中再添加镁 、钾和锌元素所致，也说明该 3 种矿质元素与蔗糖 、硼酸和钙对促进花粉萌发起协同作用，而单独使用并没有效果。本研究通过正交试验设计，确定微型月季花粉萌发最佳的基本培养基为蔗糖 150 g/L＋H3BO3125 mg/L＋Ca（ NO3）24H2O100 mg/L。培养基组分中蔗糖 、硼酸对微型月季花粉萌发和花粉管的生长有显著影响，钙对花粉萌发和花粉管生长的影响弱于蔗糖和硼酸，其主要是通过协助蔗糖和硼酸而发挥作用，但这种作用也是微型月季花粉萌发所不可或缺的。参考 文 献 ［ 1］李 奎 ，胡晓雪 . 微型月季创造神奇价值 [J]. 中国花卉园艺， 2014（ 3） 58- 59.［ 2］孙佳，曾丽，刘正宇，等 . 微型月季品种分类的花粉形态学 [J]. 中国农业科学， 2009， 42（ 5） 1867- 1874.［ 3］梁峥，贾民隆，李永平，等 . 微型月季组培快繁关键技术研究 [J].山西农业科学， 2017， 45（ 11） 1751- 1754， 1822.［ 4］汪有良 . 微型月季扦插生根能力初步研究 [J]. 江苏林业科技，2012， 39（ 5） 16- 19.［ 5］武慧，吕杰，付智坤，等 . 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