重瓣百合LiAGL6基因的克隆与表达分析_隋娟娟.pdf

华北农学报2018，33 2 87-94收稿日期2018 －01 －27基金项目国家自然科学基金项目31471904;安徽省教育厅自然科学研究重点项目KJ2016A871;安徽省高校质量工程项目2015jyxm221作者简介隋娟娟1981 －，女，山东潍坊人，副教授，博士，主要从事园林植物栽培生理与生物技术研究。重瓣百合LiAGL6基因的克隆与表达分析隋娟娟1，李晓昕2，吴 健2，曹 兴3，吴 泽2，何俊娜2，义鸣放21．阜阳师范学院生物与食品工程学院，安徽阜阳 236037;2．中国农业大学观赏园艺与园林系，花卉发育与品质调控北京市重点实验室，北京 100193;3．聊城大学农学院，山东聊城 252059摘要为了深入研究重瓣百合花形成的分子机制，以重瓣百合比罗尼卡为试验材料，从中分离得到1 个 AGL6 基因，其开放阅读框为744 bp，共编码247 个氨基酸，蛋白质分子量为28． 3 ku。亲水性平均系数为 － 0． 748，等电点为8．23。蛋白结构分析显示，百合AGL6 蛋白具有典型的MADS-box结构域、K-box区及2个AGL6 基序。系统进化树分析结果显示，百合AGL6 编码的蛋白属于AP1/AGL9 亚家族AGL6 分枝的单子叶植物类群，与同为单子叶植物的风信子亲缘关系最近，相似度达到78，说明克隆得到的基因即为AGL6 的同源基因，将其命名为LiAGL6。亚细胞定位表明，LiAGL6 在洋葱表皮细胞的细胞核中表达，具备转录因子的基本特征。实时荧光定量 PCR 结果分析表明，LiAGL6基因在花中表达量最高，在茎、叶中几乎不表达;在整朵花中，LiAGL6 在第7轮花瓣中的相对表达量最高，其次依次是第6轮和第3轮，第2轮花瓣中几乎检测不到表达。研究表明，LiAGL6基因可能在百合重瓣花形成方面发挥了调控作用。关键词重瓣百合;MADS-box;基因克隆;LiAGL6 基因;表达分析中图分类号Q78;S644．03 文献标识码A 文章编号1000 －7091201802 －0087 －08doi10．7668/hbnxb．2018．02．013Cloning and Expression Analysis of LiAGL6 in Double LilySUI Juanjuan1，LI Xiaoxin2，WU Jian2，CAO Xing3，WU Ze2，HE Junna2，YI Mingfang21． Biology and Food Engineering School，Fuyang Normal University，Fuyang 236037，China;2． Beijing Key Laboratory of Development and Quality Control of Ornamental Crops，Department ofOrnamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China; 3． College of Agronomy，Liaocheng University，Liaocheng 252059，ChinaAbstractTo explore flower development molecular mechanism of the Double lily，the AGL6 homologous genewas cloned from Double lily cv． Belonica． The open reading frame of LiAGL6 gene was 744 bp，encoded a protein of247 amino acids． The LiAGL6 protein molecular weight was 28． 3 ku，the grand average of hydropathicity was－0．748 and the theoretical pI was 8．23． The protein structure analysis showed that LiAGL6 protein had a typicalMADS-box domain，a K-box region and two AGL6 motifs． Phylogenetic tree analysis showed that LiAGL6 belongedto monocotyledon group，AGL6 branch of the AP1/AGL9 subfamily，and had the highest similarity with Hyacinthusorientalis which was also belonged to monocotyledons，the similarity reached 78． All the results indicated LiAGL6was the homologous gene of AGL6，so named it LiAGL6． Cellular localization assay revealed LiAGL6 expressed in thenucleus of onion epidemical cells，which was the basic characteristics of the transcription factors． The qRT-PCR re-sult showed the highest expression of LiAGL6 was in flowers while no expression occurred in leaves and stems． LiA-GL6 was expressed most in the seventh whorl petals followed by the sixth and third whorl petals，however，there wasalmost no expression in the second whorl petals． The research showed the LiAGL6 gene might play a regulatory roleon ation of Double lily flowers．Key wordsDouble lily;MADS-box;Gene cloning;LiAGL6 gene;Expression analysis88 华 北 农 学 报 33 卷显花植物从营养生长转变为生殖生长是生活史中的一个重要历程，花是显花植物重要的繁殖器官，花的形成和发育受到多个基因的调控。Coen等［1］研究提出了花器官发育的ABC模型，将调控花发育的基因分为A、B、C这3 类，在花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊的发育过程中发挥着不同的作用。随着研究的进一步深入，人们又发现了调控胚珠发育的 D类基因以及对各轮花器官发育均有调控作用的 E类基因，因此，ABC 模型进一步扩展为 ABCDE模型［2］。MADS-box 家族基因广泛分布于动物、植物及真菌中，其编码的蛋白是一类重要的转录调控因子，能调节其他基因的表达，对植物的生长发育具有重要的调控作用［3］。植物的开花过程精密而复杂，受到很多基因的调控，其中，MADS-box 基因在植物的花形态建成方面发挥了重要作用。MADS-box基因是一个庞大的基因家族，在长期进化过程中分化为TypeⅠ和 TypeⅡ两大类，其中，TypeⅡ基因含有4 个不同的结构域，分别为MADS M、Inter-vening I、Keratin-like K和 Carboxyl-terminal C，因此被称为MIKC基因;而TypeⅠ基因缺少Keratin-like K结构域，目前发现的调控植物花发育的相关基因大部分属于MIKC亚家族基因［4 －6］。AGL6 AGAMOUS like 6 亚家族基因是一个古老的遗传冗余基因，属于 MIKC 家族的 AP1/AGL9组，该组由AP1、AGL6/AGL13 以及SEP这3 个分枝组成，AGL6 与SEP互为姊妹系，在300 万年以前就已经出现在被子植物与裸子植物的共同祖先中［3，5，7 －8］。目前，已经从多种植物中克隆得到AGL6的同源基因，如裸子植物辐射松 Pinus radiata［9］、挪威云杉 Picea abies［10］、柳杉 Cryptomeria japoni-ca［11］，被子植物玉米 Zea mays［12］、水稻 Oryzasativa［13 －14］、拟南芥 Arabidopsis thaliana［15］、矮牵牛 Petunia hybrida［16］等。前人研究表明，AGL6 基因与花器官发育密切相关，主要表现在调节开花时间、生殖分生组织及花器官的决定性方面［17］。在拟南芥中将AGL6 基因过表达或由T-DNA插入使其表达增强后，会导致拟南芥早花现象［18 －19］;水稻中的AGL6-like基因 OsMADS6 突变后，水稻会丧失花分生组织属性的决定性，导致小穗的分生组织形成额外的小穗［14，20］;玉米中的 AGL6-like 基因 ZAG3 突变后，雌花和雄花的表型会发生多样化［21］;樊金会等［22］研究表明，风信子中的 HoAGL6 能够通过促进SOC1、LFY 基因的表达调节开花时间，通过激活AG、SEP1 基因参与花器官发育，在拟南芥中异位过表达后引起开花提前、植株矮小及器官之间发生同源转化的现象; Melzer 等［23 －24］研究认为，AGL6/SEP1/SQUA-like转录因子家族是花发育调控网络的中心，其通过相互作用将分生组织和花器官的决定性联合起来，最终发育形成有正常功能的花器官。百合 Lilium spp．属于单子叶植物，是百合科百合属观赏花卉，单瓣百合花器官主要由3 枚瓣化的萼片、3 枚花瓣、6 枚雄蕊及1 枚雌蕊组成。花的发育是影响百合花品质的生物学基础，目前，市场上百合多以单瓣品种为主，复瓣和重瓣百合品种繁育技术尚不成熟，品种较少，市场认知度不高，因此，开展百合花瓣发育相关基因的研究，对通过生物技术改善百合观赏瓣性，提高百合品种多样性与稳定性，具有重要的意义。本研究以雌雄蕊瓣化的重瓣百合比罗尼卡为试验材料，从中克隆了 AGL6基因，并对其蛋白特性和表达特性进行了分析，以期探讨出 AGL6 基因在百合重瓣花中的表达模式，为进一步揭示E类基因AGL6 在花发育方面的作用机制以及通过基因工程改善百合的观赏瓣性提供理论参考。1 材料和方法1．1 试验材料以重瓣百合比罗尼卡 Belonica 为试验材料，种球购自荷兰，规格为18 ～20 cm，种植于北京市盛斯通生态科技有限公司南口试验基地，常规栽培管理。比罗尼卡的花器官由外至内共由 7 轮花瓣组成，雌雄蕊全部瓣化，其中最内侧的第7 轮花瓣上偶见残存的花药图1。A．重瓣花;B．1 ～7 轮花瓣。A． The double flower;B．1 －7 wheel petals．图1 百合比罗尼卡的重瓣花及花瓣Fig．1 The double flower pattern and thepetals of lily Belonica2 期 隋娟娟等 重瓣百合LiAGL6 基因的克隆与表达分析 89试验所用的 RNA 提取试剂盒购自天根生化科技北京有限公司; DNA 片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;pMD18-T 载体、SYBRPremix Ex TaqTMⅡ TliRNaseH Plus荧光定量试剂盒以及试验中所用的各种常规酶类均购自 TaKaRa 公司;卡那霉素 Kan、氨苄青霉素 Amp购自 Sigma 公司;大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司;扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成;DNA 测序由北京华大科技有限公司完成。1．2 试验方法1．2．1 总RNA提取及 AGL6 基因的克隆 取比罗尼卡盛花期的花瓣，用液氮速冻并保存于 －80 ℃的超低温冰箱中备用，按照RNA提取试剂盒中的说明书提取 RNA，并用1的琼脂糖凝胶电泳检测完整性。利用 Reverse Transcriptase M-MLV 进行 cDNA第1 链的合成，并以其为模板进行PCR扩增。根据中国农业大学观赏植物栽培生理与生物技术实验室前期从百合中克隆得到的 AGL6 基因 ORF开放阅读框序列未发表设计1 对引物 F15-ATGGGTAGAGGAAGAGTTGAGTTGAAGAG-3;R15-CTACCATCCCATACTCAAAGAACCCAAACC-3，以重瓣百合比罗尼卡花瓣的 cDNA 为模板，使用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行反应，PCR反应条件98 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 延伸10 min。PCR产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，连接到pMD18-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，Amp 抗性培养基过夜培养后，挑取单克隆进行菌落PCR检测，将含有目的基因片段的阳性克隆送北京华大科技有限公司测序，获得比罗尼卡AGL6基因的ORF全长序列。1．2．2 基因序列分析 将获得的基因 ORF 序列使用NCBI http / /www． ncbi． nlm． nih． gov/在线工具进行序列分析;使用 ProtParam http / /www． web．expasy． org/protparam在线工具预测分析百合AGL6蛋白的基本性质; 使用 NCBI http / /www． ncbi．nlm． nih． gov/的 Blast 功能搜索同源基因并进行蛋白的相似性分析;使用 DNAMAN 5． 0 软件对 AGL6蛋白进行多重比对分析;使用 MEGA 5． 0 软件进行系统进化树的构建。1．2．3 亚细胞定位分析 结合 pCAMBIA1300 载体特点，使用DNAMAN 5． 0 软件对百合 AGL6 基因的 ORF 序列进行酶切位点分析，选用 Sal Ⅰ和Spe Ⅰ作为构建融合表达载体的酶切位点，设计特异引物 F25-GTCGACATGGGTAGAGGAAGAGTTGAG-3，R25-ACTAGTCTACCATCCCATACTCAAAG-3进行PCR扩增。将pCAMBIA1300 空载质粒和PCR扩增产物分别进行双酶切，之后将酶切产物纯化并用T4连接酶16 ℃连接过夜，获得重组表达载体。通过基因枪轰击法将构建好的重组表达载体轰击到经过MS培养基预培养24 h的洋葱 Allium cepa表皮细胞中，24 h后在激光共聚焦显微镜 Nikon E-clipse TE2000-E下进行观察及拍照，以空载pCAM-BIA1300-GFP为对照。1．2．4 基因表达分析 分别取比罗尼卡盛花期的茎、叶、整朵花瓣及1 ～7 轮不同花瓣用液氮速冻并保存于－80 ℃的超低温冰箱中备用，按照说明书提取RNA，电泳检测完整性，并进行cDNA第1 链的合成方法同 1． 2． 1。用 ABI Step One Plus SystemPCR仪，以上述材料反转录的cDNA为模板，将百合AGL6 基因 ORF 序列结合3端 UTR 序列设计定量特异引物 F35-GGTTCTACTGAAGAAGCTATGCCAT-3;R35-CGATCCAATCCGAAATAAAGTTCG-3，进行重瓣百合AGL6 基因的实时荧光定量 PCR 分析。以18S rRNA为内参18SF5-AGTTGGTGGAGCGATTTGTCT-3，18SR5-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3进行百合 AGL6 基因的相对表达水平检测。PCR 反应体系为95 ℃ 3 min;95 ℃ 3 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40 个循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s，1 个循环。每个样品设3 个生物学重复，采用2－ΔΔCT法对基因相对表达量进行分析。2 结果与分析2．1 百合LiAGL6 基因克隆将重瓣百合花瓣提取的RNA进行反转录，并以其为模板进行PCR扩增，获得比罗尼卡重瓣百合基因ORF 序列744 bp，共编码247 个氨基酸图2。Blast的结果显示，百合 AGL6 基因与其他物种的AGL6 基因有较高的同源性，因此，将其命名为 LiA-GL6 基因。2．2 百合LiAGL6蛋白特性与同源比对分析ProtParam在线工具预测百合LiAGL6 蛋白的分子式为C1216H1956N364O384S15，分子量为28．3 ku，半衰期在大肠杆菌 Escherichia coli中大于10 h，在酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 中大于20 h，亲水性平均系数 GRAVY为－0．748。对氨基酸组成成分进行分析，结果表明，LiAGL6 蛋白肽链负电荷残基天冬氨酸 Asp 谷氨酸 Glu 为30，正电荷残基精氨酸Arg 赖氨酸Lys为32，预测等电点PI为8．23 ＞7，推测LiAGL6蛋白为碱性蛋白。将LiAGL690 华 北 农 学 报 33 卷图2 百合LiAGL6基因开放阅读框及编码的氨基酸序列Fig．2 The open reading frame of LiAGL6 andthe amino acid sequences encoded by LiAGL6与拟南芥、番红花 Crocus sativus、春兰 Cymbidiumgoeringii、油棕 Elaeis guineensis、风信子 Hya-cinthus orientalis 及海枣 Phoenix dactylifera 的AGL6 氨基酸序列进行同源比对，结果表明，百合Li-AGL6 蛋白与其他物种的 AGL6 蛋白一样，在 N 端1 －60个氨基酸残基内含有一个典型的 MADS-box结构域，在中间90 －155 氨基酸残基内含有一个K-domain区，在靠近C 端部分含有2 个特有的 AGL6-Ⅰmotif和AGL6-Ⅱmotif基序图3。2．3 百合LiAGL6系统进化树分析为确定百合LiAGL6 基因的系统发育位置，对其进行了系统进化树分析，结果显示，AP1/AGL9 亚家族有3 个分枝，分别为 SEP 分枝、AP1 分枝及 AGL6分枝，其中 AGL6 分枝与 SEP 分枝互为姊妹分枝。AGL6 分枝可分为3 个类群，分别为裸子植物类群、单子叶植物类群及双子叶植物类群，百合 LiAGL6归属于AP1/AGL9 亚家族AGL6 分枝的单子叶植物LiAGL6． 百合AGL6;AtAGL6． 拟南芥 AGL6 NP_182089． 1; CsAGL6． 番红花 AGL6 ABK35281． 1; CgAGL6． 春兰 AGL6 ADI58464． 1;EgAGL6． 油棕AGL6 XP_010934013．1;HoAGL6． 风信子AGL6 AAT88088．1;PdAGL6． 海枣AGL6 XP_008797646．1。LiAGL6． Peptide sequences of AGL6s from Lily;AtAGL6． Peptide sequences of AGL6s from Arabidopsis thaliana NP_182089． 1;CsAGL6． Peptidesequences of AGL6s from Crocus sativus ABK35281．1;CgAGL6． Peptide sequences of AGL6s from Cymbidium goeringii ADI58464． 1; EgAGL6．Peptide sequences of AGL6s from Elaeis guineensis XP _ 010934013． 1; HoAGL6． Peptide sequences of AGL6s from Hyacinthus orientalis AAT88088．1;PdAGL6． Peptide sequences of AGL6s from Phoenix dactylifera XP_008797646．1 ．图3 百合LiAGL6与其他植物AGL6氨基酸序列同源比对Fig．3 Homology alignment of the amino acid sequences of LiAGL6 and AGL6 from other plants2 期 隋娟娟等 重瓣百合LiAGL6 基因的克隆与表达分析 91▲． 百合LiAGL6。▲． Lily LiAGL6．图4 LiAGL6蛋白与其他物种AP1/AGL6亚家族蛋白系统进化树分析Fig．4 Analysis of phylogenetic relationship between LiAGL6 protein and subfamily protein of AP1/AGL6 in other species类群，与风信子的亲缘关系最近图4，Blast 的结果显示，其相似度达78，进一步说明百合 LiAGL6基因为AGL6 的同源基因。2．4 百合LiAGL6 基因亚细胞定位利用基因枪将构建好的重组表达载体 pCAM-BIA1300-GFP-LiAGL6 轰击到经过24 h 预培养的洋葱表皮细胞中，24 h 暗培养后放置于激光共聚焦显微镜下观察，结果表明，空载对照 pCAMBIA1300-GFP的绿色荧光分布在整个洋葱表皮细胞中，包括细胞膜、细胞质、细胞核及质体中，而重组表达载体pCAMBIA1300-GFP-LiAGL6 的绿色荧光则主要分布在细胞核中图5，说明百合 LiAGL6 主要在核内发挥作用，具备转录因子的基本特征。2．5 百合LiAGL6 基因的表达分析为了确定LiAGL6 基因在百合地上部位不同组织及不同轮数花瓣中的表达差异，分别对重瓣百合的花、茎、叶及1 ～7 轮花瓣中的LiAGL6 基因进行了实时荧光定量表达分析，结果表明，在不同的地上组织部位中，LiAGL6 基因主要在花中表达，在茎和叶中几乎检测不到表达，差异达显著水平 P ＜0．05图6-A;在第1 轮及3 ～7 轮花瓣中能检测到LiAGL6 基因的表达，第2 轮花瓣中几乎检测不到表达，其中，在第7 轮花瓣中的表达量显著高于1 ～6 轮花瓣中的表达量 P ＜0．05，其次依次为第6 轮和第3 轮花瓣，第1，4，5 三轮花瓣中的表达量基本一致，差异不显著图6-B。92 华 北 农 学 报 33 卷图5 LiAGL6在洋葱表皮中的亚细胞定位Fig．5 Subcellular localization of LiAGL6 in onion epidermal cellsA． LiAGL6 在花、茎、叶的表达;B． LiAGL6 在不同花瓣中的表达;不同小写字母表示差异显著 P ＜0．05;相同小写字母表示差异不显著。A．The expression of LiAGL6 in flower，stem and leaf; B． The expression ofLiAGL6 in different petals;The different small-letter means significant differ-ence P ＜0．05; The same small-letter means no significant difference．图6 重瓣百合不同组织及不同花瓣中LiAGL6基因的表达分析Fig．6 LiAGL6 expression in different plantorgans and different petals in double lily3 讨论与结论MADS-box基因家族成员众多，在拟南芥基因组中，即有107个成员，该家族基因参与了植物多方面的生长发育过程，特别是在生殖生长阶段发挥了重要的调控作用［25 －26］。早在20 世纪90 年代，Coen等［1］即提出了调控花发育的 ABC 模型来解释植物花发育的分子机理，之后随着拟南芥中D类和E 类基因的发现，ABC 模型逐渐完善为 ABCDE 模型［2］。本研究以雌雄蕊均发生瓣化的重瓣百合比罗尼卡为试验材料，从中克隆了1 个 E 类基因 AGL6，将其命名为 LiAGL6。同源比对结果显示，LiAGL6 与其他物种的 AGL6 具有很高的同源性，除了具有典型的MADS-box结构域、K-domain区外，在靠近C 端部分还具有 2 个特有的 AGL6-Ⅰmotif 和 AGL6-Ⅱ motif的结构特征。系统进化树分析的结果表明，LiAGL6归属于AP1/AGL9 亚家族AGL6 分枝的单子叶植物群，亚细胞定位的结果也显示该基因编码的蛋白主要在核内发挥作用，符合转录因子的基本特征，这说明本试验克隆得到的LiAGL6 基因应该为AGL6 的同源基因。常规单瓣百合的花器官具有6 枚花被片、6 枚雄蕊和1 枚雌蕊，而重瓣百合比罗尼卡缺乏正常的雌雄蕊，仅在第7 轮花瓣上偶见残存的花药。对重瓣百合地上组织部位进行LiAGL6 基因的表达检测，结果表明，LiAGL6 基因在花中的表达量最高，在茎和叶中几乎检测不到表达，该结果与 AGL6 基因主要在单子叶植物花中表达的模式一致［27］，LiAGL6基因可能与其他植物中的 AGL6 基因功能类似，在花器官的形成和发育过程中发挥了重要功能。但前人研究表明，在核心真双子叶植物中 AGL6 基因不仅在花器官中有表达，在营养器官中也有表达，如葡萄中的 VvAGL6a 基因主要在其卷须中表达，VvMADS3 基因则在花和卷须中都有表达，说明AGL6基因在百合不同组织部位中的表达模式与核心真双子叶植物存在差异［27］。在重瓣百合1 ～7 轮花瓣中LiAGL6 基因在第7 轮中的表达量最高，其次依次为第6 轮和第3 轮花瓣，但在第2 轮花瓣中几乎检测不到表达。尽管在绝大多数植物中 AGL6 基因主要表达部位为花，但不同植物花器官中的表达模式仍存在某些不同，如在矮牵牛中 AGL6 基因在4 轮花器官中均有表达［28］，在单子叶植物水稻中 AGL6类基因OsMADS6 在雄蕊中不表达，但另一个 AGL6类基因 OsMADS17 则在雄蕊中有表达［20］。在观赏植物春兰中也含有 CgAGL6-1 和 CgAGL6-3 2 个2 期 隋娟娟等 重瓣百合LiAGL6 基因的克隆与表达分析 93AGL6 基因，其存在部分功能冗余，CgAGL6-1 在正常花的萼片、侧瓣、唇瓣及蕊柱中有表达，但 CgAGL6-3在侧瓣中几乎不表达［29］。由此推测，可能在比罗尼卡原种单瓣百合的雄蕊中 LiAGL6 基因也不表达或表达量极低，在百合雄蕊群发生瓣化形成3 ～6 轮花瓣的过程中 LiAGL6 基因发挥了调控功能，而在第7轮花瓣中LiAGL6 基因表达量突然增加，推测第7 轮花瓣有可能是雌蕊发生瓣化而来，LiAGL6 基因通过增加表达量发挥了调控功能。重瓣百合中的第2 轮花瓣中几乎检测不到LiAGL6 基因的表达，推测LiA-GL6 在百合中可能也属于一个功能冗余基因，极有可能存在另外的 AGL6 同源基因在第2 轮花瓣的形成过程中发挥作用，需要进一步试验验证。本研究以重瓣百合比罗尼卡为试验材料，从中分离得到 1 个 E 类花发育相关基因，命名为 LiA-GL6。试验结果表明，该基因含有744 bp 的核苷酸，编码247 个氨基酸，具有典型的 MADS-box 结构域、K-box区及2 个AGL6 基序，属于AP1/AGL9 亚家族AGL6 分枝的单子叶植物类群;亚细胞定位结果显示，LiAGL6 蛋白主要在核内发挥作用; 荧光定量PCR技术分析表明，LiAGL6 基因主要在花中表达，其中，在第7 轮花瓣中的表达量最高，推测 LiAGL6可能在重瓣百合雌雄蕊瓣化过程中发挥了一定的推动作用。参考文献［1］ Coen E S，Meyerowitz E M． The war of the whorlsgeneticinteractions controlling flower development［J］． Nature，1991，353633931 －37．［2］ Theissen G． Development of floral organ identity storiesfrom the MADS house［J］． Current Opinion in Plant Biol-ogy，2001，4175 －85．［3］ Dreni L，Zhang D． Flower development the evolutionaryhistory and functions of the AGL6 subfamily MADS-boxgenes［J］． Journal of Experimental Botany，2016，6761625 －1638．［4］ Jin Y，Wang Y，Zhang D，et al． Floral organ MADS-boxgenes in Cercidiphyllum japonicum CercidiphyllaceaeImplications for systematic evolution and bracts definition［J］． PloS One，2017，12 5e0178382．［5］ 敬 帆，罗登攀，马 婧，等． 蜡梅CpAGL6 基因启动子的克隆及功能初步分析［J］． 园艺学报，2015，426 1139 －1149．［6］ Cheng Z，Ge W，Li L，et al． Analysis of MADS-Boxgene family reveals conservation in floral organ ABCDEmodel of moso bamboo Phyllostachys edulis［J］． Fron-tiers in Plant Science，2017，8 656．［7］ Yu X，Chen G，Guo X，et al． Silencing SlAGL6，a to-mato AGAMOUS-LIKE6 lineage gene，generates fusedsepal and green petal［J］． Plant Cell Reports，2017，3661 －11．［8］ Shulga O A，Shchennikova A V，Beletsky A V，etal． Transcriptome-wide characterization of theMADS-Box family in Pinesap Monotropa hypopitys re-veals flowering conservation in Non-photosyntheticMyco-heterotrophs［J］． Journal of Plant Growth Reg-ulation，2017111 －16．［9］ Chen F，Zhang X ，Liu X ，et al． Evolutionary analysisof MIKCc-Type MADS-Box genes in gymnosperms andangiosperms［J］． Frontiers in Plant Science，2017，8 895．［10］ Carlsbecker A，Sundstrm J F，Englund M，et al． Mo-lecular control of normal and acrocona mutant seed conedevelopment in norway spruce Picea abies and the e-volution of conifer ovule-bearing organs［J］． The NewPhytologist，2013，2001 261 －275．［11］ Katahata S I，Futamura N，Igasaki T，et al． Functionalanalysis of SOC1-like and AGL6-like MADS-box genes ofthe gymnosperm Cryptomeria japonica［J］． Tree Genet-ics ＆ Genomes，2014，10 2 317 －327．［12］ Alter P，Bircheneder S，Zhou L Z，et al． Floweringtime-regulated genes in maize include the transcriptionfactor ZmMADS1［J］． Plant physiology，2016，1721 389 －404．［13］ Duan Y，Xing Z，Diao Z，et al． Characterization of os-mads6-5，a null allele，reveals that OsMADS6 is a criticalregulator for early flower development in rice Oryza sa-tiva L． ［J］． Plant Molecular Biology，2012，804/5429 －442．［14］ Li H，Liang W，Jia R，et al． The AGL6-like gene Os-MADS6 regulates floral organ and meristem identities inrice［J］． Cell Research，2010，203299 －313．［15］ Zhao T，Holmer R，Bruijn S，et al． Phylogenomic synte-ny network analysis of MADS-Box transcription factorgenes reveals Lineage-specific transpositions，ancienttandem duplications，and deep positional conservation［J］． The Plant cell，2017 ，29 6 1278．［16］ Tsuchimoto S，Mayama T，Van Der Krol A，et al． Thewhorl-specific action of a petunia class B floral homeoticgene［J］． Genes to Cells，2000，5289 －99．［17］ 王珍华，胡立霞，钟 丹，等． AGAMOUS like 6 亚家族基因研究进展［J］． 西北植物学报，2012，32 71480 － 1487．［18］ Koo S C，Bracko O，Park M S，et al． Control of lateralorgan development and flowering time by the