陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测_王志荣.pdf

２０１８，４４（２）８１－８８ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ收稿日期 ２０１７－０６－２３ 修订日期 ２０１７－０８－０６基金项目 国家自然科学基金 （３１３７２０７０，３１６７２１５３）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金 （ＣＡＲＳ－２３－Ａ１０）＊通信作者 Ｅ－ｍａｉｌｗａｎｇｘｉａｏｘｕａｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测王志荣１，李晓东２，朱玉１，黄泽军１，高建昌１，国艳梅１，杜永臣１，王孝宣１＊（１．中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京１０００８１；２．西安金鹏种苗有限公司，西安７１００１８）摘要近年来在陕西番茄生产区出现了一种新病害 ，病株表现为叶片褪绿 ，叶脉颜色变深及叶片增厚 ，果实变小发白 ，严重影响番茄产量及经济效益 ，２０１６年发病极为严重 ，部分产区甚至绝收 。该病疑似由番茄褪绿病毒 Ｔｏｍａｔｏｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＴｏＣＶ）引起 。利用ＴｏＣＶ特异引物对感病番茄样品进行 ＲＴ－ＰＣＲ检测，结果从所采集的４份病样中均检测到 ＴｏＣＶ预期大小的特异片段 。对 ＴｏＣＶ外壳蛋白 ＣＰ基因和类热激蛋白 ＨＳＰ７０ｈ基因进行克隆与序列分析 ，ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因 ７７４个核苷酸序列与已报道的 ＴｏＣＶＣＰ基因有较高的一致性 ，与山东青岛和山西晋中分离物同源性为 １００％。ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＨＳＰ７０ｈ基因 １６６５个核苷酸序列与已报道的 ＴｏＣＶＨＳＰ７０ｈ基因有较高的同源性 ，与中国 、韩国 、日本 、美国 、希腊分离物同源性达到 ９９％以上 。研究表明 ＴｏＣＶ已传播至陕西地区 。关键词番茄 ；番茄褪绿病毒病 ；ＣＰ基因 ；ＨＳＰ７０ｈ基因中图分类号 Ｓ ４３６．４１ 文献标识码 Ａ ＤＯＩ１０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０１７２４０Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｙａｎｇｌｉｎｇ，ＳｈａａｎｘｉＷＡＮＧ Ｚｈｉｒｏｎｇ１，ＬＩ Ｘｉａｏｄｏｎｇ２，ＺＨＵ Ｙｕ１，ＨＵＡＮＧ Ｚｅｊｕｎ１，ＧＡＯ Ｊｉａｎｃｈａｎｇ１，ＧＵＯ Ｙａｎｍｅｉ １，ＤＵ Ｙｏｎｇｃｈｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｘｕａｎ１（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ ＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｘｉ’ａｎ ＪｉｎｐｅｎｇＳｅｅｄｌｉｎｇＬｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｘｉ’ａｎ ７１００１８，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ａ ｎｅｗ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎ ｔｏｍａｔｏ ｈａｓ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｒｅａ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｔｏｍａｔｏ ｐｌａｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｖｅｓ，ｄａｒｋ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｖｅｉｎｓ ａｎｄ ｌｅａｆ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓ－ｅａｓｅｄ ｔｏｍａｔｏ ｐｌａｎｔｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｓ ｂｅｃａｍｅ ｐａｒｔｉａｌ ｗｈｉｔｅ ａｎｄ ｓｍａｌ，ｗｈｉｃｈ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍ－ｉｃ ｂｅｎｅｆｉｔｓ．Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｅｒｉｏｕｓ，ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｔｏｔａｌ ｙｉｅｌｄ ｌｏｓｓ ｉｎ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａｓ ｉｎ２０１６．Ｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｏｍａｔｏｅｓ ｉｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＴｏＣＶ）．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａｌ ４ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ＴｏＣＶ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ（ＣＰ）ａｎｄｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０（ＨＳＰ７０ｈ）ｇｅｎｅ ｏｆ ＴｏＣＶ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ ｔｈｅ ＣＰ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ｗａｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ＴｏＣＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｑｉｎｇｄａｏ ａｎｄＪｉｎｚｈｏｎｇ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨＳＰ７０ｈ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ｕｐ ｔｏ ９９％）ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ＴｏＣＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ，Ｊａｐａｎ，ＵＳＡ ａｎｄ Ｇｒｅｅｃｅ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔＴｏＣＶ ｈａｄ ｓｐｒｅａｄ ｔｏ Ｓｈａａｎｘｉ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｔｏｍａｔｏ；Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＣＰ；ＨＳＰ７０ｈ番茄褪绿病毒Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＴｏＣＶ）属于 长 线 形 病 毒 科Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ毛 形 病 毒 属Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ。ＴｏＣＶ基 因 组 含 有 两 条 正 义 单 链ＲＮＡ，是一种ＲＮＡ病毒 ，其中ＲＮＡ１有８ ５９４个核苷酸 ，ＲＮＡ２有８ ２４２个核苷酸 。ＴｏＣＶ是韧皮部病毒不能通过机械摩擦接种传播［１－２］。在自然条件下 ，ＴｏＣＶ只能依靠媒介昆虫烟粉虱传播［３］，Ｂ型烟粉虱Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ ｂｉｏｔｙｐｅ Ｂ、Ｑ型烟粉虱Ｂ．ｔａｂａｃｉｂｉｏｔｙｐｅ Ｑ、Ａ型烟粉虱Ｂ．ｔａｂａｃｉ ｂｉｏｔｙｐｅ Ａ、温室白粉虱Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ、银叶粉虱Ｂ．ａｒ－ｇｅｎｔｉｆｏｌｉｉ和纹翅粉虱Ｔ．ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ等介体均可传播ＴｏＣＶ［４］，该病毒是唯一能通过４种分属于两个２０１８属的粉虱传播的病毒［５－６］。ＴｏＣＶ寄主范围广泛 ，可以侵染茄科Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、菊科Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、藜科Ｃｈｅ－ｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、苋科Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ、番杏科Ａｉｚｏａｃｅａｅ、夹竹桃科Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ及白花丹科Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ等７科２５种植物 。其中 ，茄科寄主数最多 ，如番茄Ｓｏｌａ－ｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、辣椒Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ［７－８］、马铃薯Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ［４］、普通烟Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、本生烟Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ等多种烟草［９－１０］。番茄褪绿病毒病最早于１９８９年在美国佛罗里达州温室栽培番茄上出现 ，１９９８年在美国佛罗里达州该病原首次被鉴定为番茄褪绿病毒ＴｏＣＶ［１］。该病毒现已蔓延至世界各地 ，可危害多种作物［４，８，１１－１２］，在北美洲 、南美洲 、欧洲 、非洲和亚洲［１３－１７］均有报道 。我国最早于２００４年在台湾地区发现ＴｏＣＶ［１４］，２０１３年后在北京 、江苏 、山东 、河北 、天津 、河南 、辽宁 、广东等地区陆续有关于ＴｏＣＶ的报道［１８－２３］。２０１６年在陕西杨凌番茄主产区发现番茄疑似感染ＴｏＣＶ，感病面积较大 ，表现为番茄整株褪绿黄化 ，果实变小发白 ，严重影响番茄生长并造成很大经济损失 ，部分产区绝收 。本研究对采集的感病番茄样品进行了分子检测与鉴定 ，并对ＴｏＣＶ外壳蛋白ＣＰ基因和类热 激 蛋 白ＨＳＰ７０ｈ基 因 进 行 克 隆 与 序 列 分析 ，以探讨引起该病害的原因 ，并对其进行有效防控提供参考 。１ 材料与方法１．１ 试验材料１．１．１ 样品采集２０１６年１１月在陕西省杨凌番茄生产区的感病区采集４份感病番茄材料叶片 ，编号为ＴｏＣＶ－ＹＬ１～ＴｏＣＶ－ＹＬ４，同时采集该生产区非感病区健康番茄叶片作为对照 。１．１．２ 生化试剂和菌株 、载体ＲＮＡ提取试剂盒ＥａｓｙＰｕｒｅＰｌａｎｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ、反转录 试 剂 盒ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＯｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ、ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡ聚合酶 、凝胶回收试剂盒ＥａｓｙＰｕｒｅＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃ－ｔｉｏｎ Ｋｉｔ、克 隆 载 体ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏ ＣｌｏｎｇｉｎｇＫｉｔ、Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１感受态细胞均由北京全式金生物技术有限公司提供 。分子量标准ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＩＶ由天根生化科技有限公司提供 ，２ＤＮＡ ＴａｑＰＣＲＭｉｘ由北京依联轩科技有限公司提供 。１．２ 试验方法１．２．１ 番茄叶片总ＲＮＡ的提取及检测使用ＲＮＡ提取试剂盒提取番茄叶片总ＲＮＡ。取番茄编号为ＴｏＣＶ－ＹＬ１～ＴｏＣＶ－ＹＬ４和健康番茄样品的叶片０．１ｇ，依照试剂盒提取说明步骤提取总ＲＮＡ，最终将ＲＮＡ溶解于４０．０μＬ ＲＮＡｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ中 。保存于－８０℃用于后续试验 。以番茄叶片总ＲＮＡ作 为 模 板 ，使用反转录试剂盒反转录ＲＮＡ合成ｃＤＮＡ。反应体系２０．０μＬ及具体试验步骤如下 ＲＮＡ ５．０μＬ，０．５μｇ／μＬ Ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８Ｐｒｉｍｅｒ １．０μＬ，ＲＮＡｓｅ ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ ２．０μＬ；６５℃变性５ｍｉｎ，迅速冰浴２ｍｉｎ。再加２ＴＳ Ｒｅ－ａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ １０μＬ，ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＲＴ／ＲＩ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ１．０μＬ，ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ １．０μＬ，４２℃孵育３０ｍｉｎ，８０℃加 热５ｍｉｎ失 活ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＲＴ与ｇＤＮＡＲｅｍｏｖｅｒ。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对番茄褪绿病毒进行检测 ，以ｃＤＮＡ为模板利用引物ＴｏＣＶ－Ｆ／Ｒ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增 。反 应 体 系 为 ｃＤＮＡ １．０μＬ，上 下 游 引 物 各０．２μＬ，Ｍｉｘ ５．０μＬ，灭菌水３．６μＬ，总体积为１０．０μＬ。ＰＣＲ反应程序 预变性９４℃４ｍｉｎ；变性９４℃３０ｓ，退火５２℃３０ｓ，延伸７２℃３０ｓ，３２个循环 ；终延伸７２℃５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经３％的琼脂糖凝胶电泳检测 。１．２．２ ＴｏＣＶ特异引物设计根据ＮＣＢＩ网站上已公布的北京分离物ＴｏＣＶ基因组序列设计了４对特异引物 （表１）。ＴｏＣＶ－Ｆ／Ｒ是根据ＴｏＣＶ－ＢＪ ＲＮＡ１（登录号 ＫＣ８８７９９８）序列设计的特异引物 ，ＣＰ－１－Ｆ／Ｒ、ＨＳＰ－２－Ｆ／Ｒ、ＨＳＰ－３－Ｆ／Ｒ是根据ＴｏＣＶ－ＢＪ ＲＮＡ２（登录号 ＫＣ８８７９９９）序列设计的特异引物 。ＣＰ－１－Ｆ／Ｒ能扩增ＣＰ基因的７７４ｂｐ序列 ，ＨＳＰ－２－Ｆ／Ｒ、ＨＳＰ－３－Ｆ／Ｒ扩增序列进行拼接得到１ ６６５ｂｐ的ＨＳＰ７０ｈ基因序列 。１．２．３ ＴｏＣＶ的ＣＰ基因及ＨＳＰ７０ｈ基因扩增 、序列克隆及测序ＲＴ－ＰＣＲ扩增体系５０．０μＬ，包括ｃＤＮＡ ２．０μＬ，２ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ Ｍｉｘ ２５．０μＬ，上下游引物各１．０μＬ，灭菌水２１．０μＬ。ＰＣＲ反应程序 预变性９５℃３ｍｉｎ；变性９５℃３０ｓ，退火５６℃３０ｓ，延伸７２℃３０ｓ，４０个循环 ；终延伸７２℃５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测 ，使用凝胶回收试剂盒回收目的谱带 ，回收产物克隆到Ｂｌｕｎｔ Ｚｅｒｏ载体上 。转化到大肠杆菌Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１，经验证每对引物均得到５个阳性克隆后 ，再分别选取３个阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司进行测序 。２８４４卷第 ２期 王志荣等陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测表 １本试验中用到的引物信息Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ引物名称Ｐｒｉｍｅｒ引物序列 （５′－３′）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ引物中基因组中的位置Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ产物大小 ／ｂｐＳｉｚｅＴｏＣＶ－Ｆ ＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧ４５１－６８９ｂｐ ２３９ＴｏＣＶ－Ｒ ＣＧＡＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＰ－１－Ｆ ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡ４ ３０１－５ １３９ｂｐ ８３９ＣＰ－１－Ｒ ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＨＳＰ－２－Ｆ ＣＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＧ７１１－１ ５１１ｂｐ ８０１ＨＳＰ－２－Ｒ ＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡＡＣＨＳＰ－３－Ｆ ＣＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＣＡＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡＴ１ ４２０－２ ４２７ｂｐ １ ００８ＨＳＰ－３－Ｒ ＣＡＧＴＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＡＧＡＣＣ１．２．４ 序列分析将得到的ＣＰ基因序列和ＨＳＰ７０ｈ基因序列在ＮＣＢＩ网站中进行分析比对 ，根据比对结果 ，再选取ＮＣＢＩ上已发表的ＴｏＣＶ分离物的ＣＰ基因完整序列５１份和ＨＳＰ７０ｈ基因完整序列４２份 （表２～３）。利用ＤＮＡＳｔａｒ中的ＤＮＡＭＡＮ软件对选定的序列进行同源性比对 ，利用Ｍｅｇａ６．０软件的Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ法进行多序列比对分析以及邻接法 （ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎ－ｉｎｇ，ＮＪ）构建系统进化树 ，系统进化树中各分支置信度 （ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）进行１ ０００次重复分析 。２ 结果与分析２．１ ＴｏＣＶ ＲＴ－ＰＣＲ检测结果利用ＴｏＣＶ特 异 标 记ＴｏＣＶ－Ｆ／Ｒ进 行ＲＴ－ＰＣＲ分析 ，４份感病番茄材料均能检测到与预期大小一致的２３９ｂｐ特异片段 ，而健康番茄样品中未检测到目的片段 （图１ａ），结果表明陕西杨凌出现的新病害为番茄褪绿病毒病 。图 １番茄样品 ＴｏＣＶＲＴ－ＰＣＲ检测结果及 ＴｏＣＶＣＰ和 ＨＳＰ７０ｈ基因 ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ．１ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙｕｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＰａｎｄ ＨＳＰ７０ｈｇｅｎｅｓ ｏｆ ＴｏＣＶ２．２ ＴｏＣＶ ＣＰ基因序列分析利用ＴｏＣＶＣＰ基因的特异引物ＣＰ－１－Ｆ／Ｒ进行ＲＴ－ＰＣＲ分析 ，从感病材料中扩增出８３９ｂｐ片段 ，利用ＮＣＢＩ网站中ＢＬＡＳＴ功能对所得分离物的扩增序列进行比对 ，扩增产物包括完整ＣＰ基因（７７４个核苷酸 ），与预期结果相符 ，初步证明陕西杨凌番茄新病害是由番茄褪绿病毒的危害所致 。ＣＰ基因的３个阳性克隆测序结果一致 。将ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因全长７７４个核苷酸 （Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ登录号 ＭＦ３４６３８３）与在ＮＣＢＩ上收集的来自亚洲 、欧 洲 、北 美 洲 、南 美 洲 的９个 国 家 的５１份ＴｏＣＶＣＰ基因序列进行同源性分析及进化树构建 。结果 表 明ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因序列与山东青岛ＴｏＣＶ－ＳＤＱＤ（ＫＴ８０９４００）和山西晋中ＴｏＣＶ－ＳＸＪＺ（ＫＸ８５３５４０）序列同源性达到１００％，与国内其他地区及日本 、韩国 、美国地区的同源性在９９％以上 ，而３８２０１８与希腊 、巴西 、以色列 、西班牙等地样品基因序列同源性在９７％～９９％。这些结果表明 ，ＴｏＣＶ ＣＰ基因序列在不同地区存在一定差异 ，ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因与国内其他地区及亚洲地区ＣＰ基因具有较高同源性 ，相比之下 ，ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因与欧洲地区分离物ＣＰ基因同源性较低 （表２）。从构建的ＣＰ基因序列进化树可以看出 ，ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因与山东青岛和山西晋中分离物ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＣＰ基因在一个小分支上 ，亲缘关系一致 。中国的２３份材料的ＣＰ基因序列聚集在一个大的分支上 。不同地区的ＴｏＣＶ ＣＰ基因序列存在一定差异 ，同一国家的ＴｏＣＶ ＣＰ基因序列亲缘关系较近 ，亚洲与欧洲ＴｏＣＶ ＣＰ基因亲缘关系相对较远（图２）。表 ２用于序列比较和进化分析的 ＴｏＣＶＣＰ基因序列信息Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＴｏＣＶ ＣＰｇｅｎｅ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ病毒分离物Ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅＧｅｎＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．地理来源Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ同源性 ／％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ病毒分离物Ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅＧｅｎＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．地理来源Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ同源性 ／％ＩｄｅｎｔｉｔｙＴｏＣＶ－ＳＤＱＤ（ＣＰ）ＫＴ８０９４００ 中国 １００．００ ＴｏＣＶ－Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ（ＣＰ）ＫＲ１５０９８６ 中国 ９９．１０ＴｏＣＶ－ＳＸＪＺ（ＣＰ）ＫＸ８５３５４０ 中国 １００．００ ＴｏＣＶ－ＮＧＸＪＺ（ＣＰ）ＫＸ２７２７５５ 中国 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＨＮＡＹＨＸ（ＣＰ）ＫＰ２６４９８３ 中国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－ＨＢＬＦ（ＣＰ）ＫＰ２１７１９９ 中国 ９８．９７ＴｏＣＶ－Ｔｏｃｈｉｇｉ（ＣＰ）ＡＢ５１３４４３ 日本 ９９．６１ ＴｏＣＶ－ＴＪ６（ＣＰ）ＫＰ２１９７２２ 中国 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＨＳ（ＣＰ）ＫＰ１３７０９９ 韩国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｓｅ２０４２（ＣＰ）ＨＧ３８００８６ 希腊 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＨＰ（ＣＰ）ＫＰ１１４５３７ 韩国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｉｌ１８５７（ＣＰ）ＨＧ３８００８８ 希腊 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＪＮ１（ＣＰ）ＫＰ１１４５３６ 韩国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｉｌ１９７０（ＣＰ）ＨＧ３８００８５ 希腊 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＪＪ５（ＣＰ）ＫＰ１１４５３４ 韩国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｒｈ１９３３（ＣＰ）ＨＧ３８００８４ 希腊 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＹＧ（ＣＰ）ＫＰ１１４５２８ 韩国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－ＩＳ２９（ＣＰ）ＫＰ１１４５２９ 韩国 ９８．９７ＴｏＣＶ－ＪＪ３（ＣＰ）ＫＰ１１４５３３ 韩国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－ＩＳ１７（ＣＰ）ＫＰ１１４５２５ 韩国 ９８．９７ＴｏＣＶ－１４ＨＤ－１２（ＣＰ）ＫＰ３３５０４６ 中国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－ＨＢＳＪＺ（ＣＰ）ＫＰ２１７２００ 中国 ９８．８４ＴｏＣＶ－１５－ＰＧ－９（ＣＰ）ＫＴ７５１００８ 中国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｉｌ２００２（ＣＰ）ＨＧ３８００８９ 希腊 ９８．８４ＴｏＣＶ－ＨＢＨＳ（ＣＰ）ＫＰ２１７１９６ 中国 ９９．６１ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｉｌ２０１０（ＣＰ）ＨＧ３８００９０ 希腊 ９８．８４ＴｏＣＶ－ＳＤＬＣ（ＣＰ）ＫＣ８１２６２２ 中国 ９９．４８ ＴｏＣＶ－Ｔｏ－Ｒｈ１８３５（ＣＰ）ＨＧ３８００８７ 希腊 ９８．８４ＴｏＣＶ－ＨＮＺＺＺＭ１（ＣＰ）ＫＰ２６４９８４ 中国 ９９．４８ ＴｏＣＶ－Ｇｒ－５３５（ＣＰ）ＥＵ２８４７４４ 希腊 ９８．７１ＴｏＣＶ－ＳＤＳＧ（ＣＰ）ＫＣ７０９５１０ 中国 ９９．４８ ＴｏＣＶ－ＴｏＣ－Ｂｒ２（ＣＰ）ＪＱ９５２６０１ 巴西 ９８．５８ＴｏＣＶ－Ｎａｎｊｉｎｇ（ＣＰ）ＫＪ８１５０４５ 中国 ９９．４８ ＴｏＣＶ－ＩＳ（ＣＰ）ＤＱ２３４６７３ 以色列 ９８．４５ＴｏＣＶ－ＢＪ（ＣＰ）ＫＣ３１１３７５ 中国 ９９．４８ ＴｏＣＶ－ＢＲ（ＣＰ）ＫＹ５６９４０１ 巴西 ９８．３２ＴｏＣＶ－ＬＮＤＬ（ＣＰ）ＫＵ２０４７０７ 中国 ９９．３５ ＴｏＣＶ－Ｐｌ－１－２（ＣＰ）ＫＪ２００３０９ 西班牙 ９７．８０ＴｏＣＶ－ＪＬＣＣ（ＣＰ）ＫＵ３０６１１１ 中国 ９９．２２ ＴｏＣＶ－ＪＪ（ＣＰ）ＫＰ１３７１０１ 韩国 ９７．６７ＴｏＣＶ－ＳＤＺＢ（ＣＰ）ＫＲ０７２２１３ 中国 ９９．２２ ＴｏＣＶ－Ｆｒ（ＣＰ）ＥＵ６２５３５０ 法国 ９７．６７ＴｏＣＶ－ＨＢＣＺ（ＣＰ）ＫＰ２１７１９５ 中国 ９９．２２ ＴｏＣＶ－ＭＭ８（ＣＰ）ＫＪ２００３０７ 西班牙 ９７．５５ＴｏＣＶ－Ｆｌｏｒｉｄａ（ＣＰ）ＡＹ９０３４４８ 美国 ９９．２２ ＴｏＣＶ－ＡＴ８０／９９－ＩＣ（ＣＰ）ＫＪ７４０２５７ 西班牙 ９７．２９ＴｏＣＶ－Ｆｌｏｒｉｄａ（ＣＰ）ＮＣ＿００７３４１ 美国 ９９．２２ ＴｏＣＶ－ＡＴ８０／９９（ＣＰ）ＤＱ１３６１４６ 西班牙 ９７．１６ＴｏＣＶ－ＨＮＺＺＺＭ２（ＣＰ）ＫＰ２６４９８５ 中国 ９９．１０ ＴｏＣＶ－２．５（ＣＰ）ＫＪ２００３０５ 西班牙 ９７．１６ＴｏＣＶ－ＮＭＨＨＨＴ（ＣＰ）ＫＵ２０４７０９ 中国 ９９．１０２．３ ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因序列分析ＲＴ－ＰＣＲ扩 增 结 果 表 明 ，ＨＳＰ－２－Ｆ／Ｒ扩 增 出８０１ｂｐ片段 ，ＨＳＰ－３－Ｆ／Ｒ扩增出１ ００８ｂｐ片段 ，与预期结果相符 。分别将这两个扩增片段的３个阳性克隆进行测序拼接得到３个１ ８５１ｂｐ片段 ，该片段包括完 整ＨＳＰ７０ｈ基 因 （１ ６６５个 核 苷 酸 ），使 用ＤＮＡＭＡＮ软件对这３个１ ６６５ｂｐ片段进行比对 ，序列结果一致 ，重复性较好 。将陕西省杨凌分离物ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＨＳＰ７０ｈ基因全长１ ６６５个核苷酸 （ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＭＦ３４６３８４）与在ＮＣＢＩ上收集的来自亚洲 、欧洲 、北美洲 、南美洲的７个国家的４２份ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因序列进行同源 性 分 析 及 进 化 树 构 建 。结 果 表 明 ，ＴｏＣＶ－ＹＬ１ ＨＳＰ７０ｈ基因与中国大部分地区 、日本 、韩国大部分地区 、美国 、巴西分离物ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因同源性在９９％以上 ，与西班牙的５个地区分离物ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因同源性在９８％以上 ，而与中国广东分离物ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因同源性最低 ，为８０．３７％（表３）。从构建的ＨＳＰ７０ｈ基因序列进化树可以看出 ，ＴｏＣＶ－ＹＬ１分离物ＨＳＰ７０ｈ基因与中国大部分地区ＨＳＰ７０ｈ基因在一个分支上 。不同地区的ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因序列存在一定差异 ，同一国家的ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因序列亲缘关系较近 ，亚洲地区的ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因亲缘关系较近 ，亚洲与欧洲ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈ基因亲缘关系相比较远 （图３）。这个结果与ＴｏＣＶ－ＹＬ１的ＣＰ基因有相似之处 。４８４４卷第 ２期 王志荣等陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测图 ２基于 ＣＰ基因核苷酸序列构建的 ＴｏＣＶ－ＹＬ１与其他 ５１个地区分离物 ＴｏＣＶＣＰ基因的系统进化树Ｆｉｇ．２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＴｏＣＶ－ＹＬ１ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ５１ＴｏＣＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＣＰｇｅｎｅ５８２０１８表 ３用于序列比较和进化分析的 ＴｏＣＶ类热激蛋白 ７０基因序列信息Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＴｏＣＶ ＨＳＰ７０ｈｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ病毒分离物Ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅＧｅｎＢａｎｋ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．地理来源Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ同源性 ／％ＩｄｅｎｔｉｔｙＴｏＣＶ－ＨＰ ＫＰ１１４５３７ 韩国 ９９．７０ＴｏＣＶ－Ｔｏｃｈｉｇｉ ＡＢ５１３４４２ 日本 ９９．７０ＴｏＣＶ－ＨＳ ＫＰ１３７０９９ 韩国 ９９．６４ＴｏＣＶ－ＹＧ ＫＰ１１４５２８ 韩国 ９９．６４ＴｏＣＶ－ＪＮ１ ＫＰ１１４５３６ 韩国 ９９．６４ＴｏＣＶ－ＪＪ３ ＫＰ１１４５３３ 韩国 ９９．６４ＴｏＣＶ－ＪＪ５ ＫＰ１１４５３４ 韩国 ９９．６４ＴｏＣＶ－ＨＢＣＺ ＫＰ２１７２０１ 中国 ９９．５８ＴｏＣＶ－ＳＤＳＧ ＫＣ７０９５１０ 中国 ９９．５８ＴｏＣＶ－ＪＬＣＣ ＫＸ８８０３８４ 中国 ９９．５２ＴｏＣＶ－ＳＤＴＡＦＣ ＫＣ８１２６２５ 中国 ９９．５２ＴｏＣＶ－Ｈａｎｄａｎ ＫＭ６５５８２９ 中国 ９９．５２ＴｏＣＶ－ＳＤＬＣ ＫＣ８１２６２６ 中国 ９９．５２ＴｏＣＶ－ＳＤＴＡＭＺ ＫＣ８１２６２７ 中国 ９９．５２ＴｏＣＶ－ＨＢＨＳ ＫＰ２１７１９７ 中国 ９９．４６ＴｏＣＶ－ＳＤＴＡＤＰ ＫＣ８１２６２４ 中国 ９９．４６ＴｏＣＶ－Ｆｌｏｒｉｄａ ＮＣ＿００７３４１ 美国 ９９．４０ＴｏＣＶ－ＨＮＺＺＺＭ２ ＫＰ２６４９８８ 中国 ９９．４０ＴｏＣＶ－ＨＮＡＹＨＸ ＫＰ２６４９８６ 中国 ９９．４０ＴｏＣＶ－ＬＮＤＬ ＫＵ２０４７０８ 中国 ９９．４０ＴｏＣＶ－ＴｏＣＶ－ＢＪ ＫＣ８８７９９９ 中国 ９９．４０ＴｏＣＶ－Ｆｌｏｒｉｄａ ＡＹ９０３４４８ 美国 ９９．４０ＴｏＣＶ－ｚｂ ＫＲ０７２２１４ 中国 ９９．３４ＴｏＣＶ－ＨＮＺＺＺＭ１ ＫＰ２６４９８４ 中国 ９９．２８ＴｏＣＶ－ＳＸＪＺ ＫＸ８５３５３９ 中国 ９９．２８ＴｏＣＶ－ＮＭＨＨＨＴ ＫＵ２０４７１０ 中国 ９９．２８ＴｏＣＶ－Ｎａｎｊｉｎｇ ＫＪ８１５０４５ 中国 ９９．２８ＴｏＣＶ－ＨＢＬＦ ＫＰ２１７２０２ 中国 ９９．２２ＴｏＣＶ－ＨＢＳＪＺ ＫＰ２１７１９８ 中国 ９９．２２ＴｏＣＶ－Ｂｒ２ ＪＱ９５２６０１ 巴西 ９９．２２ＴｏＣＶ－ＴｏＣＶ－ＴＪ６ ＫＰ２２６６９８ 中国 ９９．１６ＴｏＣＶ－ＩＳ２９ ＫＰ１１４５２９ 韩国 ９９．１６ＴｏＣＶ－ＩＳ１７ ＫＰ１１４５２５ 韩国 ９９．１６ＴｏＣＶ－Ｇｒ－５３５ ＥＵ２８４７４４ 希腊 ９９．１０ＴｏＣＶ－Ｔｉａｎｊｉｎ ＫＰ８９３１２０ 中国 ９９．０４ＴｏＣＶ－ＪＪ ＫＰ１３７１０１ 韩国 ９８．８０ＴｏＣＶ－ＡＴ８０／９９－ＩＣ ＫＪ７４０２５７ 西班牙 ９８．５０ＴｏＣＶ－ＡＴ８０／９９ ＤＱ１３６１４６ 西班牙 ９８．４４ＴｏＣＶ－Ｐｌ－１－２ ＫＪ２００３０９ 西班牙 ９８．３８ＴｏＣＶ－２．５ ＫＪ２００３０５ 西班牙 ９８．３８ＴｏＣＶ－ＭＭ８ ＫＪ２００３０７ 西班牙 ９８．３８ＴｏＣＶ－ＧＤ０１ ＫＴ９６２２７５ 中国 ８０．３７３ 讨论本研究对西北地区陕西杨凌番茄疑似感病株进行ＴｏＣＶ分子检测 ，确定该地区番茄已经感染ＴｏＣＶ，而且有扩大的趋势 。提醒西北地区番茄生产者注意该病毒病的危害 ，加强防控 ，减少经济损失 。本研究对陕西省杨凌分离物ＴｏＣＶ－ＹＬ１的外壳蛋白ＣＰ基因 （ＧｅｎＢａｎｋ登 录 号 ＭＦ３４６３８３）和 类 热 激 蛋 白ＨＳ７０ｈ基因 （ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＭＦ３４６３８４）片段进行克 隆 与 序 列 分 析 ，ＣＰ基因序列与中国各地区ＴｏＣＶ分离物同源性较高 ，和山东青岛 、山西晋中ＴｏＣＶ分离物ＣＰ基因同源性达到１００％，相比之下 ，与欧洲其他国家同源性较低 。ＨＳＰ７０ｈ基因与中国各地区及亚洲地区的韩国 、日本ＴｏＣＶ分离物同源性较高 ，而与欧洲国家ＴｏＣＶ分离物ＨＳＰ７０ｈ基因同源性较低 。由此可见 ，番茄褪绿病毒在不同地区其基因组保守区域有一定差异性 ，该差异是否影响其对作物的侵染作用尚不清楚 。近几年 ，番茄褪绿病毒病传播迅速 ，寄主范围也进一步扩大 ，除目前报道的茄科植物外 ，在国外有研究表明野生萝卜 、芝麻菜 （ｇａｒｄｅｎ ｒｏｃｋｅｔ）、龙葵 、苦苣菜 、反枝苋 、藜等植物都是番茄褪绿病毒的寄主植物［２４］，但和番茄相比其传播病毒的效率较低 ，目前受该病毒危害最严重的仍是番茄［２４］。番茄褪绿病毒的传播介体主要是烟粉虱 ，而Ｑ型烟粉虱是粉虱中传毒效率较高的传播载体［２５］。另外 ，番茄褪绿病毒还会和番茄黄化曲叶病毒一起复合侵染番茄 ，导致番茄严重减产甚至绝收 。在我国番茄褪绿病毒目前在 东 北 、华 北 、华 中 、华东和华南地区均有分布［１８－２３］，现已蔓延至西北地区 。该病害在我国迅速传播的原因可能是带毒种苗的运输以及带毒烟粉虱的传播 。番茄褪绿病毒病具有暴发性和流行性 ，较难防治 。针对番茄褪绿病毒对番茄的侵害 ，在保护地中育苗和定植后利用６０目以上的网纱进行物理隔离 ，并从播种 、定植至采收的全过程喷施杀虫剂可防止各类烟粉虱对ＴｏＣＶ的传播 ，从而达到控制ＴｏＣＶ的目的 。在栽培管理方面 ，适当调整播种和定植期 ，高温 、干燥的气候条件对粉虱的发生 、繁殖及传播有利 ，各种植基地根据具体情况可适当提前或延迟定植时间 ，尽量避开粉虱的活动高峰期 ，选择无虫 、无毒健苗定植 ，严禁将带虫 、带毒苗移入棚室［１０］。防治ＴｏＣＶ的最好手段是利用抗病番茄品种 ，而国内外目前尚未有抗病品种育成的报道 ，因此培育抗ＴｏＣＶ番茄品种将是未来番茄育种的重点 。６８４４卷第 ２期 王志荣等陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测图 ３基于 ＨＳＰ７０ｈ基因核苷酸序列构建的 ＴｏＣＶ－ＹＬ１与其他 ４２个地区 ＴｏＣＶ分离物的系统进化树Ｆｉｇ．３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＴｏＣＶ－ＹＬ１ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ４２ＴｏＣＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＨＳＰ７０ｈｇｅｎｅ参考文献［１］ＷＩＳＬＥＲ Ｇ Ｃ，ＬＩ Ｒ Ｈ，ＬＩＵ Ｈ Ｙ．Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓａｎｅｗ ｗｈｉｔｅｆｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ，ｐｈｌｏｅｍ ｌｉｍｉｔｅｄ，ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｃｌｏｓｔｅｒｏ－ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，８８（５）４０２－４０９．［２］ＷＩＳＬＥＲ Ｇ Ｃ，ＤＵＦＦＵＳ Ｊ Ｅ，ＬＩＵ Ｈ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｗｈｉｔｅｆｌｙ－ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ７８２０１８Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９８，８２（３）２７０－２８０．［３］王富 ，李文丽 ，王辉 ．番茄褪绿病毒病与黄化曲叶病毒病的区别及防控 ［Ｊ］．长江蔬菜 ，２０１６（５）４５－４６．［４］刘永光 ，魏家鹏 ，乔宁 ，等 ．番茄褪绿病毒在山东暴发及其防治措施 ［Ｊ］．中国蔬菜 ，２０１４（５）６７－６９．［５］ＷＩＮＴＥＲＭＡＮＴＥＬ Ｗ Ｍ，ＷＩＳＬＥＲ Ｇ Ｃ，ＡＮＣＨＩＥＴＡ Ａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａ－ｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５，１５０２２８７－２２９８．［６］ＫＡＴＡＹＡ Ａ，ＳＴＡＶＲＩＤＯＵ Ｅ，ＦＡＲＨＡＮ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏ－ｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｇｒｅｅｋ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｔｏｍａ－ｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００８，５７（５）８１９－８２４．［７］ＧＡＲＣＡ－ＣＡＮＯ Ｅ，ＮＡＶＡＳ－ＣＡＳＴＩＬＬＯ Ｊ，ＭＯＲＩＯＮＥＳ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｗｉｌｄ ｔｏｍａｔｏ ｓｐｅ－ｃｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｍｐａｉｒ ｖｉｒｕｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１０，１００５８２－５９２．［８］ＬＡＮＤＥＯ－Ｒ－ＯＳＹＭ，ＮＡＶＡＳ－ＣＡＳＴＩＬＬＯ Ｊ，ＭＯＲＩＯＮＥＳＥ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆｔｈｅ ｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏａｎｄ ｓｗｅｅｔ ｐｅｐｐｅｒ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，２０１５，５１２８３－２８９．［９］ＷＩＮＴＥＲＭＡＮＴＥＬ Ｗ Ｍ，ＷＩＤＥＲ Ｇ Ｃ．Ｖｅｃｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｈｏｓｔｒａｎｇｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ，２００６，９０（６）８１４－８１９．［１０］王志荣 ，王孝宣 ，杜永臣 ，等．番茄褪绿病毒病研究进展［Ｊ］．园艺学报 ，２０１６，４３（９）１７３５－１７４２．［１１］ＩＳＡＢＥＬ Ｍ．ＦＯＲＴＥＳ，ＪＥＳＳ ＮＡＶＡＳ－ＣＡＳＴＩＬＬＯ．Ｐｏｔａｔｏ，ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｈｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉ－ｒｕｓ［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２，１３４８１－８６．［１２］周涛 ，杨普云 ，赵汝娜 ，等．警惕番茄褪绿病毒在中国的传播和危害 ［Ｊ］．植物保护 ，２０１４，４０（５）１９６－１９９．［１３］ＴＳＡＩ Ｗ Ｓ，ＳＨＩＨ Ｓ Ｌ，ＧＲＥＥＮ Ｓ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｔｏｍａｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２００４，８８（３）３１１．［１４］ＷＩＮＴＥＲＭＡＮＴＥＬ Ｗ Ｍ，ＰＯＬＳＴＯＮ Ｊ Ｅ，ＥＳＣＵＤＥＲＯ Ｊ，ｅｔａｌ．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２００１，８５（２）２２８．［１５］ＳＥＧＥＶ Ｌ，ＷＩＮＴＥＲＭＡＮＴＥＬ Ｗ Ｍ，ＰＯＬＳＴＯＮ Ｊ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ－ｅａｓｅ，２００４，８８（１０）１１６０．［１６］ＢＡＲＢＯＳＡ Ｊ Ｃ，Ｔｅｉｘｅｉｒａ Ａ Ｐ Ｍ，Ｍｏｒｅｉｒａ Ａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｒｓｔ ｒｅ－ｐｏｒｔ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｏｍａｔｏ ｃｒｏｐｓ ｉｎ Ｂｒａｚｉｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２００８，９２（１２）１７０９．［１７］ＬＥＴＴ Ｊ Ｍ，ＨＯＡＲＥＡＵ Ｍ，ＲＥＹＮＡＵＤ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｏｎ Ｍａｕｒｉｔｉｕｓ Ｉｓｌａｎｄ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２００９，９３（１）１１１．［１８］高利利 ，孙国珍 ，王勇 ，等．天津地区番茄褪绿病毒的分子检测和鉴定 ［Ｊ］．华北农学报 ，２０１５，３０（３）２１１－２１５．［１９］孙国珍 ，高利利 ，陆文利 ，等．河北省设施番茄褪绿病毒分子检测和鉴定研究 ［Ｊ］．北方园艺 ，２０１５（９）９５－９８．［２０］ＺＨＡＯ Ｌｉｍｉｎｇ，ＬＩ Ｇａｎｇ，ＧＡＯ Ｙｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃ－ｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙ－ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，１６２（１０）６２７－６３４．［２１］汤亚飞 ，何自福 ，佘小曼 ，等．侵染广东番茄的番茄褪绿病毒分子鉴定 ［Ｊ］．植物保护 ，２０１７，４３（２）１３３－１３７．［２２］王翠琳 ，冯佳