利用改良SOE_PCR技术定点突变TuMVC4_VPg基因_李国亮.pdf

利用改良 SOE-PCR 技术定点突变 TuMV C4-VPg 基因李国亮 钱 伟 张淑江 李 菲 章时蕃 张 慧 谢露露 武 剑 王晓武 孙日飞*（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）摘 要 芜菁花叶病毒（ Turnip mosaic virus，TuMV）是白菜类蔬菜生产上的重要病害，其中 TuMV VPg 基因在 TuMV 侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用，且不同 TuMV 株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸 PCR（SOE-PCR）技术，以 TuMV C4-VPg 基因序列为模板，定点突变 TuMV C4-VPg 与 TuMV CDN1-VPg 基因间 5 个差异核苷酸位点（决定 5个氨基酸差异）。结果表明通过 SOE-PCR 技术获得了 5 个 TuMV C4-VPg 基因的单点突变体，即 TuMV C4-VPg-Ⅰ、TuMVC4-VPg-Ⅱ、TuMVC4- VPg-Ⅲ、TuMVC4- VPg-Ⅳ和 TuMVC4- VPg- Ⅴ。关键词 白菜类蔬菜；芜菁花叶病毒； VPg 基因；重叠延伸 PCR 技术；单点突变的互作，但 eIF4E 其他位置的突变对二者的互作没有影响。由此可知，关键氨基酸位点的变化对其功能的表达具有重要的影响，通过重叠延伸PCR技术（splicing byoverlapextensionPCR，SOE-PCR），可以快速、高效地获得单点突变体，为验证关键氨基酸位点的功能奠定基础。重叠延伸PCR技术利用具有互补末端的特定引物，将两条PCR产物形成重叠链，在下一轮的扩增反应中，通过重叠链延伸来实现不同片段的拼接（熊爱生 等，2000；帅勇 等，2009）。该技术不需要限制性内切酶和连接酶的处理（Horton etal.，1989；Senanayake Brian，1995），也不受突变位置及突变类型的限制，可以在DNA的任何位点插入突变（Urbanetal.，1997；Gangetal.，2011）。重叠延伸PCR技术在生命科学领域已有广泛应用。翟玲等（2012）利用重叠延伸PCR技术，对 LacZ报告基因的一些位点随机插入目标内含子，再对LacZ 报告基因的活性进行比较分析，结果表明该方法与In-Fusion克隆相比有一定的优越性；李诺敏等（2013）利用重叠延伸 PCR 技术，对人 tau 基因进行定点突变，获得 tau 基因的 6 种同工异构体的克隆，进而在蛋白水平上验证了 tau 蛋白表达。该技术无需利用限制性内切酶，可以对基因的多个null李国亮，博士研究生，专业方向蔬菜遗传育种，E-mailli_guo_liang * 通讯作者（Corresponding author）孙日飞，研究员，博士生导师，专业方向蔬菜遗传育种，E-收稿日期2017-07-11；接受日期2017-08-30基金项目 国家自然科学基金项目（31372069），“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD01B04-03），农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目芜菁花叶病毒（ Turnip mosaic virus，TuMV）属于马铃薯Y病毒科Y病毒属，是白菜类蔬菜生产上的主要病害之一。TuMV VPg 蛋白是一种多功能蛋白，共价连接在病毒 RNA 的 5′末端，类似帽子结构，在病毒复制的过程中起重要作用（Miyoshi etal.，2008），可与寄主拟南芥的翻译起始因子 eIF（ iso） 4E 互作，调控病毒 RNA 翻译的起始（Dupratetal.，2002）。Gallois 等（2010）通过酵母双杂交试验发现寄主翻译起始因子 eIF（ iso） 4E 可以与VPg 蛋白互作，通过调控病毒翻译的起始，从而对病毒的侵染产生干扰（Wittmann etal.，1997），在拟南芥 eIF（ iso） 4E 基因的帽结合蛋白中，将第46 位和第 92 位氨基酸 Trp 突变为 Leu 后， eIF（ iso）4E 就不能与病毒 VPg 互作（Miyoshi etal.，2006）；Dinkova 等（2016）发现辣椒 eIF4E 的第 94 位和第107 位氨基酸突变后，将影响 TuMV VPg 与 eIF4E39新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2017（10）39-44位置进行剪切和连接，具有很大的灵活性和简便性。重叠延伸PCR技术即在体外定点突变基因位点，是一种获得单点突变基因的技术。芜菁花叶病毒（TuMV）侵染白菜类蔬菜后，TuMV VPg 蛋白通过与白菜翻译起始因子 eIF（ iso） 4E 互作，促进病毒自身的增殖。为了进一步阐明不同 TuMV 株系间VPg 基因的差异对 TuMV 致病性的影响，本试验采用改良的重叠延伸 PCR 技术，以 TuMV C4-VPg 基因为模板，定点突变核苷酸，克隆了 5 个单点突变基因，以期为揭示特定氨基酸位点对病毒致病机制的影响奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料试验于 2016 年 9 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所分子遗传实验室进行。TuMV C4株系、大肠杆菌 trans5α 菌株由中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜育种课题保存。质粒小提试剂盒、DNAMarker、DNA Polymerase、DNA 回 收 试 剂 盒购自天根生化科技（北京）有限公司；克隆载体pEASY-T1CloningKit 购自全式金（北京）有限公司；卡那霉素购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限 公司。1.2 重叠延伸 PCR 引物设计及第 1 轮 PCR 反应体系重叠延伸PCR引物设计遵循常规引物设计原则，突变碱基位于引物中央偏3′端，引物长度 0 bp 左右为佳，引物过短不利于 2 个长片段的融合。在每个差异核苷酸位点处分别设计正、反向引物。TuMVC4-VPg 和 TuMV CDN1-VPg 氨基酸序列存在5个差异位点，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，分别设计 5 对引物，即 bioC4-Ⅰ-R/F、bioC4-Ⅱ-R/F、bioC4-Ⅲ-R/F、bioC4-Ⅳ-R/F 和 bioC4-Ⅴ-R/F（表 1），TuMV C4-VPg 基因的两端引物分别为bio120213/bio120214。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。第1轮重叠延伸PCR反应体系为 50 μL，其中包括 10PCR 缓冲液 5 μL，0.8mmolL-1dNTPs4μL，1.0 μmolL-1上、下游引物各 1μL，50ngL-1模板 DNA5μL，1U Taq 酶1μL，ddH2O 补齐 50 μL。PCR 反应程序94 ℃变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 个循环。利用 2 琼脂糖凝胶电泳对PCR 扩增产物进行鉴定，利用 TIANGEN 胶回收试剂盒对目标长度条带进行切胶回收。表 1 重叠延伸 PCR 引物引物名称 引物序列（5′-3′）bio120213 CCCATATGATGGCGAAAGGCAAGAGGCbio120214 CCCCGGGTCACTCGTGGTCCACTGGGAbioC4-Ⅰ-R GTTTTTGTGTCCGAGACCACGTGTCCTGCbioC4-Ⅰ-F GCAGGACACGTGGTCTCGGACACAAAAACbioC4-Ⅱ-R CCAAAGTGCTTTTGCACAAGGGTGATGTCbioC4-Ⅱ-F GACATCACCCTTGTGCAAAAGCACTTTGGbioC4-Ⅲ -R GCAAGTTCATTCTTATGTCACCAAAGTGCbioC4-Ⅲ -F GCACTTTGGTGACATAAGAATGAACTTGCbioC4-Ⅳ -R CTCCCCGAGCAAGTCCATTCTTATGTTACCbioC4-Ⅳ -F GGTAACATAAGAATGGACTTGCTCGGGGAGbioC4-Ⅴ -R GTCTTATTCATACGTACTTCATTTGGATCCAGCbioC4-Ⅴ -F CGAGCTGGATCCAAATGAAGTACGTATG1.3 重叠延伸 PCR 技术过程解析重叠延伸PCR技术利用变异位点处正、反向引物以及该基因两端引物进行第1轮PCR扩增，PCR产物形成包含overlap的重叠链；在第2轮PCR扩增中，通过overlap重叠链的延伸，可以将重叠链连接起来，如图1所示。以TuMV C4-VPg质粒为模板，进行第 1 轮 PCR 扩增。TuMV C4-VPg 和 TuMV CDN1-VPg 氨基酸序列存在 5 个差异位点，将 VPg 基因序列分为 6 个片段，分别为 P1、P2、P3、P4、P5、P6，以 TuMVC4- VPg 质粒为模板，以 bio120213/bioC4-Ⅰ-R 和 bioC4-Ⅰ-F/bio120214组合为引物，分别扩增短片段 P1和P23456。利用 2 琼脂糖凝胶电泳分别对 P1和P23456的PCR 扩增产物进行检测鉴定，并利用 TIANGEN 胶回收试剂盒回收目标条带DNA，等比例混合。取上述混合 DNA 为模板，以 bio120213/bio120214 为引物，扩增包含第 1 个突变位点的 P1-23456片段。第2 轮 PCR 反应体系亦为 50μL，其中包括 10PCR缓 冲 液 5 μL，0.8 mmolL-1dNTPs4μL，1.0μmolL-1上、下游引物各1 μL，两端片段PCR图 1 重叠延伸 PCR 扩增示意图40新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES产物都调至 100 ngL-1，各取 5 μL，1 UTaq 酶 1μL，ddH2O 补齐 50 μL。PCR 反应程序94 ℃变性 5 min；94 ℃变性 30 s，50～65 ℃退火（当两条片段融合时，通过设置退火温度梯度，寻找最合适的退火温度）30 s，72 ℃延伸 40 s，35 个循环。对PCR扩增产物进行切胶回收，回收的DNA片段作为目标基因与 pEASY-T1 载体重组，均匀涂抹在固体 LB 培养基上，37 ℃过夜培养 12 h。挑取若干单菌落，重悬在 1 mL 液体 LB 培养基中，在 37 ℃、200rmin-1的摇床上摇菌4 h。取3 μL菌液为 模板，以 bio120213/bio120214 为引物，进行 PCR鉴定。克隆载体过程参考全式金（北京）有限公司关于克隆载体 pEASY-T1CloningKit 的操作指南。2 结果与分析2.1 TuMV CDN1-VPg 与 TuMV C4-VPg 氨基酸差异位点分析利 用 DNAMAN 5.0 软 件 对 TuMV C4-VPg 和TuMVCDN1-VPg 氨基酸序列进行比对，发现二者存在5个差异氨基酸位点，即第52位异亮氨酸I/亮氨酸L，二者同为非极性疏水性氨基酸；第97位谷氨酸E/赖氨酸K，前者为酸性氨基酸，后者为碱性氨基酸；第101位和第105位天冬酰胺N/天冬氨酸 D，前者为极性氨基酸，后者为酸性氨基酸；第 117 位异亮氨酸 I/ 缬氨酸 V，二者都为非极性疏水性氨基酸（图 2）。图 2 TuMV CDN1/C4-VPg 氨基酸序列比对结果2.2 利用改良 SOE-PCR 技术定点突变 TuMV C4-VPg- Ⅰ 基因经过序列比对，TuMVC4-VPg 与 TuMVCDN1-VPg 蛋白间存在 5 个氨基酸差异位点，在这 5 个差异氨基酸位点所对应的核苷酸位点处，设计正、反向引物（表 1），即 bioC4-Ⅰ-R/F、bioC4-Ⅱ-R/F、bioC4-Ⅲ-R/F、bioC4-Ⅳ-R/F 和 bioC4-Ⅴ-R/F。第 1 轮 PCR 扩增获得 P1（160bp）和 P23456（448bp），第2轮PCR扩增获得P1-23456，即 C4 VPg-Ⅰ （576 bp）。两轮 PCR 扩增后，将获得的 PCR 产物通过 2 琼脂糖凝胶电泳检测，确认在退火温度为53℃的 PCR 反应体系中，可以获得目标片段长度的产物（图3）。同时，通过梯度PCR仪，分别找到适于 TuMV C4-VPg 另外4个差异位点的退火温度，分别为 58、50、55、55℃。第2轮PCR扩增后，将扩增产物通过2琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，采用天根胶回收试剂盒对目标长度的条带进行切胶回收纯化（由于第 2 轮PCR 反应中会出现非特异性扩增，所以此时不宜用PCR 产物纯化试剂盒进行纯化，应该通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切取目标长度的条带进行回收），纯化产物连接到 pEASY-T1 载体，转化到大肠杆菌trans 5α。挑取2个阳性克隆菌液送美吉生物科技有限公司进行Sanger测序检测。通过上述方法，图 3 P1、 P23456以及 C4 VPg-Ⅰ 目标片段电泳检测结果M，Mark Ⅰ。41新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES分别对 TuMV C4/CDN1-VPg 基因序列存在的5个核苷酸差异位点进行定点突变，经过Sanger测序检测，5 个突变位点均达到预期要求，获得 5 个单点突变体即 TuMVC4- VPg-Ⅰ、TuMVC4- VPg- Ⅱ、TuMVC4-VPg-Ⅲ、TuMV C4-VPg-Ⅳ和 TuMV C4-VPg-Ⅴ（图 4）。3 结论与讨论Rusholme 等（2007）利用大白菜抗 / 感病亲 本，定位克隆了 retr01 与 ConTR01 基因，其中retr01 为隐性抗病基因， ConTR01 为显性抗病基因，这2个基因分别位于R4和R8染色体上，共同控制 TuMV CDN1 株系；Qian 等（2013）以大白菜感病材料极早春和抗病材料 BP8407 为亲本，采用 BSA 法，通过筛选 SSR 和 InDel 标记，最终定位克隆 retr02 基因，该基因为隐性抗病基因，具有广谱抗性，尤其对TuMV C4株系表现高度抗性。白菜类蔬菜中不同的抗病毒基因对 TuMV 不同株系的抗性也不一样，通过探究TuMV CDN1与C4株系间的差异，可以为揭示白菜类蔬菜抗病毒基因的抗病机制奠定基础。李国亮等（2017）通过酵母双杂交试验和双分子荧光互补试验表明TuMV-C4 与白菜 eIF（ iso）4E.a 可以相互作用，而与白菜 eIF（ iso） 4E.c 不能相互作用；TuMV-UK1 与白菜 eIF（ iso） 4E.c 可以相互作用，而与白菜 eIF（ iso） 4E.a 不能相互作用，通过对 TuMV-UK1 VPg 与 TuMV-C4 VPg 氨基酸序列进行比对，发现二者间存在4个氨基酸差异位点，且相对集中，分别是第 89 位（F/L）、第 105 位 （N/D）、第 114 位（P/S）和第 119 位（M/V）氨基酸，因此推测，某个关键氨基酸位点的变化可以影响其图 4 5 个单点突变体基因的测序检测Ⅰ，TuMVC4- VPg-Ⅰ；Ⅱ，TuMVC4- VPg-Ⅱ；Ⅲ，TuMVC4- VPg-Ⅲ；Ⅳ，TuMVC4- VPg-Ⅳ；Ⅴ，TuMVC4- VPg- Ⅴ。功能的表达。重叠延伸PCR技术可以在体外定点突变核苷酸，制备单点突变体用于其功能研究，该技术已有很多报道，但其反应体系尚待优化。雒丽娜等（2012）采用重叠延伸PCR技术，以重组的人组织型纤溶酶原激活剂 r PA 基因为模板，成功实现 3 个位点的定点突变，为 r PA 基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。孟祥平等（2013）通过优化中间引物互补长度、SOE-PCR 体系的模板浓度、起始模板的纯度以及循环次数等条件，成功获得特异性强和保真度高的 BTRCP-Cyp A 融合基因。常规获得一段 DNA 的方法包括限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等。基因功能的研究往往集中于其中的若干个碱基变化，重叠延伸PCR技术对于研究体外基因突变的功能，提供了一种有利的方法。在该技术过程中经常出现扩增条带弥散和非特异性扩增等情况，因此需要整理一个优化的技术流程，来快速、准确地定点突变基因。重叠延伸PCR依据两条模板链中间的overlap进行重叠，互为模板进行延伸，因此overlap长度对第2轮PCR扩增比较重要，建议中间引物长度为 30 bp 左右，引物过短容易出现扩增条带弥散现象；引物中 GC 含量在 55 以上，有利于第2轮PCR扩增过程中两段DNA片段融合；第2轮PCR扩增前，应将第1轮PCR扩增产物进行纯化，避免第1轮PCR扩增过程中剩余的中间42新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES引物对第2轮PCR扩增产生影响；在第2轮PCR扩增过程中，模板过多或过少都易产生弥散或非特异扩增，应将第1轮PCR扩增的两组产物等量混合（各取 500 ng 左右，50 μL 扩增体系），作为第2轮PCR扩增的模板；另外，在第2轮PCR扩增过程中，通过设置退火温度梯度，可以快速找到扩增该位点的适宜退火温度，节约时间。本试验通过梯度 PCR 仪，找到适于 TuMV C4-VPg5 个差异位点的退火温度，分别为 53、58、50、55、55℃。随着植物基因定位、克隆的不断发展，科学家们发现野生型个体和突变型个体往往只在某个基因上有若干个碱基的变化，最终导致其表型的巨大变化，但目前植物体内基因的定点突变技术受转基因技术及植物组织培养技术的影响，推广比较困难。重叠延伸 PCR（SOE-PCR）技术是在植物体外对目标基因定点突变，成本低、简单易操作，可以高效用于验证目标氨基酸位点的功能。随着二代、三代高通量测序的成熟，对目标基因上的SNP位点不断深入挖掘，通过重叠延伸PCR技术，以SNP位点为桥梁，可以将基因定向转化为单点突变体，为深入研究氨基酸位点的功能奠定基础。参考文献李国亮，钱伟，张淑江，李菲，章时藩，张慧，谢露露，武剑，王晓武，孙日飞．2017．白菜翻译起始因子 eIF（ iso） 4E.a/c 与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析．园艺学报， 44（7）1299-1308．李诺敏，刘可夫，李灵芸，何放，顾文彬，董一名，庆宏．2013．改进重叠延伸PCR克隆 tau 基因6种同工异构体．北京理工大学学报，33（88）871-875．雒丽娜，王盛，王玉炯．2012．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究．安徽农业科学，40（4）719-722．孟祥平，杨建英，乔晓岚，梁玲霞，席守民．2013．优化重叠延伸PCR条件构建 BTRCP-CypA 融合基因．生物技术，23（6）51-54．帅勇，胡兴旺，易朵，王成，赵晓蒙，周畅．2009．重叠延伸 PCR法构建小鼠 Sumf1 基因的定点突变真核表达载体．生命科学研究，13（5）430-436．熊爱生，彭日荷，陈建民，李贤，姚泉洪．2000．透明颤菌血红蛋白（ 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田间成株自然发病病情指数与苗期人工接种鉴定病情指数的相关系数r0.789，呈极显著相关。结合田间抗性调查和人工接种抗性鉴定结果，利用 12 对与 L 基因连锁的分子标记对 13 份 TMV 抗病种质进行分子鉴定，6 份材料中共检测到 6 个抗性分子标记。抗 TMV 辣椒种质的主要农艺性状表现出一定的多样性。关键词 辣椒；种质资源；TMV 抗性；鉴定素，常引起辣椒叶片坏死、枯斑、褪绿，植株矮化，落花、落果，对辣椒生产造成严重损失。目前，世界各地鉴定出侵染辣椒的病毒有 30 余种，其中烟草花叶病毒（ Tobacco mosaic virus，TMV）是威胁辣椒生产的主要病毒。TMV在世界范围内普遍发生，尤其易感染烟草、番茄、辣椒等茄科作物。TMV主要通过植物种子和汁液摩擦传毒，通过植物的维管组织，迅速侵染植株幼嫩组织，在叶片上产生浅绿或深绿色的秦蕾，女，博士研究生，主要从事辣椒 TMV 抗性基因挖掘与功能研究，E-* 通讯作者（Corresponding author）梁燕，教授，博士生导师，主要从事番茄遗传育种及蔬菜种质资源研究，E-mailliangyannwsuaf. 收稿日期2017-03-13；接受日期2017-08-14基金项目 “十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD01B04-14）辣椒（ CapsicumannuumL.）为茄科辣椒属一年生或多年生植物，在全国20多个省、市、自治区都有栽培。病毒病一直是威胁辣椒生产的重要因Site-directed Mutagenesis of TuMV C4-VPg Gene by Optimized Splicing by Overlap Extension PCRLIGuo-liang，QIAN Wei，ZHANG Shu-jiang，LI Fei，ZHANG Shi-fan，ZHANG Hui，XIE Lu-lu，WUJian，WANGXiao-wu，SUNRi-fei*（ InstituteofVegetablesandFlowers， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing100081， China）Abstract Turnip mosaic virus（TuMV）was animportantdiseaseforBrassica rapaL.ssp.pekinensisproduction，and theTuMVVPggenehadplayedavitalroleinfectingproductionprocess．While，the pathogenicityofdifferentTuMVstrainswasdiverse．This experimentadoptedimprovedsplicingbyoverlapextensionPCR（SOE-PCR）technology，took TuMV-C4VPggenesequenceastemplate，carried outsite-directedmutagenesison5differentsingle-nucleotidesbetweenTuMVC4-VPgandTuMVCDN1-VPg genes．Theresultsindicatedthat5singlepointmutantsofTuMVC4-VPgwereobtainedbytheoptimizedSOE-PCR，i.e.TuMVC4-VPg- Ⅰ，TuMVC4- VPg- Ⅱ，TuMVC4- VPg- Ⅲ，TuMVC4- VPg- ⅣandTuMVC4- VPg- Ⅴ．Key words Brassica rapaL.ssp.pekinensis； Turnip mosaic virus（TuMV）； VPg gene；Splicing byoverlapextensionPCR（SOE-PCR）；Singlepointmutant44新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2017（10）44-50