白菜翻译起始因子eIF（iso）4E.a/c与芜菁花叶病毒TuMV-C4/UK1蛋白互作分析

p园艺学报， 2017， 44 7 1299– 1308. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0168； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 1299 收稿日期 2017– 03– 17； 修回日期 2017– 05– 09 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31372069） ； ‘十二五’国家科技支撑计划项目（ 2013BAD01B04-03） ；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 对本文贡献相同 nbsp;** 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ； Tel 010-82109511） nbsp;白菜翻译起始因子 eIFiso4E.a/c 与芜菁花叶病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 nbsp;李国亮*，钱 nbsp;伟*，张淑江，李 nbsp;菲，章时藩，张 nbsp;慧，谢露露，武 nbsp;剑，王晓武，孙日飞**（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 nbsp;100081） nbsp;摘 nbsp;要 为阐明白菜翻译起始因子异构体 eIFiso4E 的表达特性，以及该异构体与芜菁花叶病毒（ TuMV）的互作关系，在白菜‘极早春’中克隆了 eIFiso4E.a 基因，在‘ BP8407’中克隆了 eIFiso4E.c基因。这两个基因长度一致，均编码 200 个氨基酸。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明 eIFiso4E.a仅与 TuMV-C4 株系互作，而不与 TuMV-UK1 株系互作； eIFiso4E.c 仅与 TuMV-UK1 株系互作，而不与TuMV-C4 株系互作。对白菜 eIFiso4E 蛋白氨基酸序列及空间结构分析发现 eIFiso4E 蛋白包含帽结合蛋白结构， eIFiso4E.a 和 eIFiso4E.c 蛋白间存在 20 个差异氨基酸，其中 17 个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上； TuMV-C4 VPg 与 TuMV-UK1 VPg 蛋白有 4 个氨基酸差异位点。通过对 TuMV 不同株系的 VPg蛋白（病毒基因组连接蛋白）氨基酸序列频率分析发现，在 4 个氨基酸差异位点处，氨基酸的使用频率具有选择性。 nbsp;关键词 白菜； eIFiso4E； TuMV； VPg（ virus genome-linked protein） ；互作关系 nbsp;中图分类号 S 634 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2017） 07-1299-10 Analysis of the Protein Interaction of eIFiso4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis nbsp;LI Guoliang*， QIAN Wei*， ZHANG Shujiang， LI Fei， ZHANG Shifan， ZHANG Hui， XIE Lulu，WU Jian， WANG Xiaowu， and SUN Rifei**（ Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China） nbsp;Abstract To clarify the expression characteristics of eukaryotic initiation factors [eIFiso4E] and the interaction relationship of eIFiso4E with TuMV VPg， the eIFiso4E.a and eIFiso4E.c genes were cloned from the Brassica rapa ssp. chinensis materials‘ Jizaochun’ and‘ BP8407’ ， respectively. Both of the two genes could encode 200 amino acids. The yeast two-hybridand bimolecular fluorescence complementation（ BiFC） results showed that TuMV-C4 could only interact with eIFiso4E.a， instead of eIFiso4E.c； the TuMV-UK1 could only interact with eIFiso4E.c， instead of eIFiso4E.a. Analyzing the nbsp;Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIFiso4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1300 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 7 1299– 1308. amino acid sequence and the domain tertiary structure of eIFiso4E protein revealed that it contained the cap-reception site. There were 20 different amino acids between eIFiso4E.a and eIFiso4E.c， 17 of which were located in the cap-reception site（ accounting for 85） . Through aligning the TuMV-C4/UK1 VPg amino acid sequences， four different amino acids were found； and after comparative analyzing the sequences from different TuMV strains， the frequency of the amino acids had certain selectivity in the four amino acid points. Keywords Brassica rapa ssp. chinensis； eIFiso4E； TuMV； VPg（ virus genome-linked protein） ；protein interaction nbsp;翻译起始因子 eIF4E 所编码的蛋白又称为帽结合蛋白（ cap binding protein， CBP） ，是真核生物中一种相对分子量为 24 000 的细胞质蛋白，能够与 mRNA 帽子或帽子同系物特异地交叉结合，在蛋白质翻译的过程中起核心作用（卢航 nbsp;等， 2007） 。 nbsp;芜菁花叶病毒（ Turnip mosaic virus， TuMV）是引起白菜病害的主要病原。 TuMV VPg 蛋白是一种多功能蛋白，在病毒侵染过程中起重要作用，可与寄主拟南芥的翻译起始因子 eIFiso4E 互作，调控病毒 RNA 翻译的起始 （ Duprat et al.， 2002） ； 酵母双杂交试验表明， 拟南芥的翻译起始因子 eIF4E以及其异构体 eIFiso4E 可以同 TuMV-VPg 相互作用（ Wittmann et al.， 1997； Lonard et al.， 2000） ，而烟草 eIF4E 和 eIFiso4E 仅与 TuMV-NIa 相互作用（ Schaad et al.， 2000） ； Gallois 等（ 2010）通过酵母双杂交试验发现， TuMV 的 UK1 和 CDN1 株系 VPg 蛋白只能和拟南芥的 eIFiso4E 拷贝互作，而不能和 eIF4E 拷贝互作；在拟南芥 eIFiso4E 基因的帽结合蛋白中，将第 46 和 92 位氨基酸 Trp突变为 Leu 后， eIFiso4E 就不能与病毒 VPg 互作（ Miyoshi et al.， 2006） ； Dinkova 等（ 2016）发现辣椒 eIF4E 的 94、 107 位氨基酸突变后，将影响 TuMV VPg 与 eIF4E 的互作，但 eIF4E 其他位置的突变，对二者的互作没有影响，由此可知关键氨基酸位点的变化对其功能的表达具有重要的影响。 nbsp;白菜 eIFiso4E 有 3 个拷贝，为 eIFiso4E.a、 eIFiso4E.b 和 eIFiso4E.c，其中 eIFiso4E.b 为假基因（ Jenner et al.， 2010） 。以白菜抗 TuMV 高代自交系‘ BP8407’和感 TuMV 高代自交系‘极早春’为亲本，构建 F2家系，通过遗传分析和基因定位研究发现， eIFiso4E.a 基因序列存在 SNP多态性，与病毒抗性密切相关（ Qian et al.， 2013） 。目前白菜抗 TuMV 研究中， eIF4E、 eIFiso4E不同拷贝与 TuMV 不同株系间的互作关系并不明确，互作过程中的关键氨基酸位点也需深入探究。 nbsp;本研究中在白菜‘极早春’中克隆了 eIFiso4E.a 基因，在‘ BP8407’中克隆了 eIFiso4E.c 基因，通过酵母双杂交试验和双分子荧光互补试验发现， eIFiso4E.a 和 eIFiso4E.c 可以与 TuMV 的不同株系进行互作；蛋白结构分析表明，决定 eIFiso4E 与 TuMV VPg 互作的关键氨基酸位于帽结合蛋白和帽状蛋白上，且特定位点上的氨基酸具有选择偏好性。白菜中抗 TuMV 的不同基因，对TuMV 不同株系的抗性也不一样，通过进一步明确白菜 eIFiso4E 与 TuMV 的互作关系，阐明不同抗性材料对 TuMV 的抗性范围，为白菜抗 TuMV 的性状改良提供理论依据，同时也为揭示二者互作的分子机制奠定基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料 nbsp;白菜‘ BP8407’ ，为抗 TuMV 的高代自交系；白菜‘极早春’ ，为感 TuMV 的高代自交系；芥李国亮，钱 nbsp;伟，张淑江，李 nbsp;菲，章时藩，张 nbsp;慧，谢露露，武 nbsp;剑，王晓武，孙日飞 . 白菜翻译起始因子 eIFiso4E.a/c 与芜菁花叶病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 园艺学报， 2017， 44 7 1299– 1308. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1301 菜‘ Tendgreen’ ，为高感 TuMV 材料，由英国华威大学的 John A. Walsh 惠赠。上述 3 种材料于 2016年 4 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所玻璃温室种植。 pGBKT7/pGADT7 酵母载体、酵母 AH109菌株、 pSPYNE/pSPYCE 载体以及农杆菌 EHA105 菌株由中国农业科学院蔬菜花卉研究所大白菜遗传育种实验室保存。 nbsp;质粒小提试剂盒、 DNA 标记、 DNA 扩增酶、 DNA 回收试剂盒以及 RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司； RNA 反转录试剂盒和克隆载体 pEASY-T1 Cloning Kit 购自全式金（北京）有限公司； T4 连接酶， EcoRⅠ、 BamHⅠ、 ClaⅠ和 XhoⅠ限制性内切酶购自 NEB 公司；酵母双杂交系统（ Matchmarker Gold Yeast Two-Hybrid System） 、 Aureobasidin A（ AbA） 、 X-α-Gal、 YPD、YPDA 及各种酵母缺陷型培养基购自 Clontech 公司。 nbsp;1.2 nbsp;白菜 eIFiso4E 和 TuMV VPg 基因克隆及酵母载体的构建 nbsp;白菜 eIFiso4E.a 基因编号为 Bra035393， eIFiso4E.c 基因编号为 Bra035531（ http // brassicadb.org/brad/） 。在基因 3′和 5′端设计引物 bio120854/bio120855（已加入 EcoRⅠ和 XhoⅠ的酶切位点，表 1） 。 2016 年 5 月，取白菜‘ BP8407’和‘极早春’的新鲜叶片，提取 RNA，反转录后进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系为 15 μL， 包括 10 PCR 缓冲液， 0.25 mmol L-1 dNTPs， 1.0 μmol L-1上、下游引物， 50 ng μL-1模板 DNA， 1 U Taq。 PCR 循环程序为 94 ℃变性 5 min， 94 ℃变性 40 s， 55 ℃退火 40 s， 72 ℃延伸 50 s， 35 个循环。 2的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目标片段，获得eIFiso4E.a 和 eIFiso4E.c 基因，分别连接到 pEASY-T1 载体上（参考全式金 pEASY-T1 载体克隆说明书）进行测序验证。经验证后将上述两个基因分别构建酵母诱饵质粒 pGADT7︰ eIFiso4E.a 和pGADT7︰ eIFiso4E.c 载体。 nbsp;表 1 nbsp;扩增 eIFiso4E 和 TuMV VPg 的引物序列 nbsp;Table 1 nbsp;The primers of amplifying eIFiso4E and TuMV VPg 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence（ 5′– 3′） nbsp;bio120213 CCCATATGATGGCGAAAGGCAAGAGGCbio120214 CCCCGGGTCACTCGTGGTCCACTGGGAbio120854 GGAATTCATGGCGACAGAGGATGTGAACGAbio120855 CCTCGAGGTCAGACACTAAATCGACTTCTTCBiFC-120213-In CGCCACTAGTGGATCCATGGCGAAAGGCAAGAGG BiFC-120214-In GAGCGGTACCCTCGAGCTCGTGGTCCACTGGGACGAG BiFC-120854-In CGCCACTAGTGGATCCATGGCGACAGAGGATGTGBiFC-120854-In GAGCGGTACCCTCGAGGACACTAAATCGACTTCTTCTuMV-C4 毒源扩繁材料选用易感 TuMV 的芥菜材料‘ Tendgreen’ ， 2016 年秋季玻璃温室播种，三叶期人工摩擦接种 TuMV-C4 株系。取– 80 ℃保存的 TuMV-C4 毒源病叶 1 g，放入高温灭菌过的研钵中，加入磷酸盐缓冲液（ 0.05 mol L-1， pH 7.0） 5 mL，研磨成浆，双层纱布过滤毒液。在三叶期芥菜叶片表面撒少量金刚砂，人工摩擦接种， 20 d 后取感病叶片提取 RNA，进行 RT-PCR 验证接种效果。 以 bio120213/bio120214 为引物 （包含 XmaⅠ和 NdeⅠ酶切位点， 表 1） ， 扩增 TuMV-C4/UK1 VPg 基因，分别克隆到 pEASY-T1 载体上，进行测序验证。将上述 TuMV-C4/UK1 VPg 基因分别构建酵母猎物质粒 pGBKT7︰ C4 VPg 和 pGBKT7︰ UK1 VPg。 nbsp;1.3 nbsp;酵母质粒自激活与毒性检测及酵母双杂交试验 nbsp;参考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手册。从 YPDA 固体培养基上挑选直径Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIFiso4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1302 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 7 1299– 1308. 为 2 3 mm 的酵母 AH109 单菌落，制备酵母感受态细胞。采用醋酸锂激活转化法，分别将重组质粒 pGBKT7︰ TuMV VPg 和 pGADT7︰ eIFiso4E 转化到酵母 AH109 感受态细胞中， 同时将酵母双杂交系统自带的 pGBKT7-Lam 阴性对照和 pGADT7-53 阳性对照分别转化到酵母 AH109 感受态细胞中。上述酵母转化子分别涂在 SD/– Trp 和 SD/– Leu 固体平板上， 30 ℃培养 3 5 d，进行自激活和毒性检测。阳性对照正常生长，阴性对照不长菌，说明该酵母双杂交系统严谨可靠（酵母双杂交实验具体流程请参考 Clontech 公司操作说明书） 。 nbsp;从酵母 AH109 转化子中分别挑取单个阳性克隆于 450 L 液体 YPDA 培养基中混匀， 30 ℃中培养 20 24 h，取适量混合菌液涂于 SD/– Trp、 SD/– Leu 和 SD/– Leu/– Trp（以下简称 -TL）固体培养基上， 30 ℃倒置培养 3 5 d 至阳性克隆出现。在 SD/– Leu/– Trp 固体培养基上挑取阳性克隆分别涂于 SD/– Leu/– Trp/– AbA（以下简称 -TAL）和 SD/– Leu/– Trp/– AbA/– His（以下简称 -THAL）固体培养基上， 30 ℃培养 3 5 d，观察是否有阳性克隆出现。 nbsp;1.4 nbsp;双分子荧光互补试验 nbsp;双分子荧光互补试验（ BiFC）即将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复，则表明两个目标蛋白发生了相互作用。在白菜 eIFiso4E 基因 3′和 5′端设计引物 BiFC-120854-In/BiFC-120855-In（已加入 BamHⅠ和 XhoⅠ的酶切位点， 表 1） ， 将白菜 eIFiso4E.a和 eIFiso4E.c 基因构建 pSPYNE 载体；在 TuMV VPg 基因 3′ 和 5′ 端设计引物BiFC-120213-In/BiFC-120214-In（已加入 ClaⅠ和 XhoⅠ的酶切位点，表 1） ，将 TuMV-C4/UK1 VPg基因构建 pSPYCE 载体。将上述载体组合转化至农杆菌 EHA105 菌株中，注射到 4 6 叶期的本氏烟叶片中进行瞬时表达， 2 3 d 后取叶片背面表皮细胞，在共聚焦激光扫描显微镜（ Laser Scanning Confocal Microscope）下进行观察鉴定。 nbsp;1.5 nbsp;白菜 eIFiso4E 和 TuMV VPg 蛋白序列和结构分析 nbsp;利用 SWISS-MODLE 软件（ http //swissmodel.expasy.org/）对 eIFiso4E 蛋白的三维结构进行预测； 利用 Protscale 软件对 eIFiso4E 和 TuMV VPg 蛋白序列进行亲水 /疏水性分析； 利用 WebLogo（ http //weblogo.berkeley.edu/）对 eIFiso4E 蛋白氨基酸序列频率进行预测；利用 DNAMAN 软件（ DNAMAN Vision 4.0）进行序列比对，酶切位点分析及克隆载体分析。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;酵母双杂交试验分析 TuMV 与白菜 eIFiso4E 的互作关系 nbsp;将白菜‘极早春’中克隆的 eIFiso4E.a 基因和白菜‘ BP8407’中克隆的 eIFiso4E.c 基因，分别构建酵母诱饵质粒 pGADT7︰ eIFiso4E.a 和 pGADT7︰ eIFiso4E.c 载体。将已构建好的酵母猎物质粒 pGBKT7︰ C4 VPg 和 pGBKT7︰ UK1 VPg 分别与上述酵母诱饵质粒组合，转化到酵母 AH109 菌株中，在 SD/– Leu/– Trp 固体培养基上， 30 ℃培养 3 5 d。阳性对照生长白色菌落，阴性对照未长菌。挑取 SD/– Leu/– Trp 固体培养基上的单菌落，转接到 SD/– Leu/– Trp/– His 和 SD/– Leu/– Trp/– His/– Ade固体培养基上， 30 ℃培养 3 5 d。 nbsp;酵母双杂交试验表明（图 1） ， pGBKT7︰ C4 VPg 与 pGADT7︰ eIFiso4E.a 组合，在 – THAL 培养基上正常生长，而 pGBKT7︰ C4 VPg 与 pGADT7︰ eIFiso4E.c 组合，仅能在 – TL 培养基上生长，李国亮，钱 nbsp;伟，张淑江，李 nbsp;菲，章时藩，张 nbsp;慧，谢露露，武 nbsp;剑，王晓武，孙日飞 . 白菜翻译起始因子 eIFiso4E.a/c 与芜菁花叶病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 园艺学报， 2017， 44 7 1299– 1308. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1303 说明 TuMV-C4 VPg 仅与 eIFiso4E.a 互作，而与 eIFiso4E.c 不互作； pGBKT7UK1 VPg 与pGBKT7C4 VPg 的结果相反，即 TuMV-UK1 VPg 仅与 eIFiso4E.c 互作，而与 eIFiso4E.a 不互作。 nbsp;图 1 nbsp;利用酵母双杂交检测 UK1/C4 VPg 和 eIFiso4E.a/c 之间的互作关系 nbsp;Fig. 1 nbsp;The interactions relationship between UK1/C4 VPg and eIFiso4E.a/c in yeast two-hybrid assays TL SD/-Leu/-Trp； THAL SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade. 2.2 nbsp;双分子荧光互补试验确定白菜 eIFiso4E 与 TuMV 的互作关系 nbsp;为了进一步验证酵母双杂交的结果，分别将 TuMV VPg 和 eIFiso4E 构建双分子荧光互补载体pSPYNE 和 pSPYCE， 即为 YNE︰ C4 VPg， YNE︰ UK1 VPg， YCE︰ eIFiso4E.a 和 YCE︰ eIFiso4E.c。将上述载体组合，联同共转化载体 P15 转化到农杆菌 EHA105 中，注射到烟草叶肉细胞进行瞬时表达。取叶片下表皮在共聚焦激光扫描显微镜下观察（图 2） ，发现 YNE︰ C4 VPg/ YCE︰ eIFiso4E.a和 YNEUK1 VPg/ YCE︰ eIFiso4E.c 组合能够检测到较强黄色荧光信号，表明上述两个组合在烟草叶肉细胞内发生相互作用；而 YNE︰ C4 VPg/ YCE︰ eIFiso4E.c 和 YNE︰ UK1 VPg/ YCE︰ eIFiso4E.a组合未检测到黄色荧光信号，表明二者在烟草体内未发生互作。 nbsp;图 2 nbsp;烟草叶片下表皮细胞的荧光共聚焦检测 nbsp;Fig. 2 nbsp;Identification in the mesophyll cells of Nicotiana by bimolecular fluorescence complementation technology Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIFiso4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1304 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 7 1299– 1308. 2.3 nbsp;白菜 eIFiso4E 蛋白和 TuMV VPg 蛋白氨基酸性质分析 nbsp;利用 Protscale 软件对 eIFiso4E.a 蛋白序列进行亲水 /疏水性分析。 氨基酸分值越高疏水性越强，分值越低亲水性越强。图 3 显示，第 144 位氨基酸 Leu 分值最高（ 1.82） ，疏水性最强；第 194 位氨基酸 Arg 分值最低（– 2.83） ，亲水性最强。由图 3 还可以看出 eIFiso4E.a 蛋白亲水性氨基酸数量明显多于疏水性氨基酸，在蛋白序列中不均匀分布，推断为可溶性蛋白。同时对 TuMV-C4 VPg 蛋白序列进行亲 /疏水性分析，如图 4 所示，第 3 位氨基酸 Gly 的分值最低（– 2.9） ，亲水性最强；第152 位氨基酸 Leu 分值最高（ 1.3） ，疏水性最强，尤其从第 158 位到 162 位氨基酸分值骤降，从 1.3降到– 2.7 左右；亲 /疏水性严重失衡，亲水性氨基酸明显多于疏水性氨基酸，推断该蛋白也为可溶性蛋白，可以进行酵母双杂交试验。 nbsp;图 3 nbsp;eIFiso4E.a 蛋白的亲 /疏水性分布曲线 nbsp;Fig. 3 nbsp;The distributing curve of hydrophobicity of eIFiso4E.a protein 图 4 nbsp;TuMV-C4 VPg 蛋白的亲 /疏水性分布曲线 nbsp;Fig. 4 nbsp;The distributing curve of hydrophobicityof TuMV-C4 VPg protein 2.4 nbsp;白菜 eIFiso4E 蛋白氨基酸序列及空间结构分析 nbsp;经过对白菜 eIFiso4E.a 与 eIFiso4E.c 的氨基酸序列进行比对，发现二者包括 200 个氨基酸，二者之间存在 20 个氨基酸差异 （图 5） ， 其中 17 个差异氨基酸位点处于帽结合蛋白结构上 （占 85） ，进一步表明 eIFiso4E 帽状结构蛋白在病毒侵染白菜的过程中起着重要作用。 nbsp;李国亮，钱 nbsp;伟，张淑江，李 nbsp;菲，章时藩，张 nbsp;慧，谢露露，武 nbsp;剑，王晓武，孙日飞 . 白菜翻译起始因子 eIFiso4E.a/c 与芜菁花叶病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 园艺学报， 2017， 44 7 1299– 1308. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1305 图 5 nbsp;白菜 eIFiso4E.a/c 氨基酸序列比对 nbsp;* 表示一致； ∶ 表示强相似； . 表示弱相似；空白表示不一致。 nbsp;Fig. 5 nbsp;Alignment of eIFiso4E.a/c amino acid sequence * represent identity； ∶ represent strong similarity； . represent weak similarity； Blank represent not identity. 利用 SWISS-MODLE（ http //swissmodel.expasy.org/）对白菜 eIFiso4E 蛋白的三维结构进行同源模建[以 eIFiso4E.a 为例]，如图 6，该蛋白由帽结合蛋白（ CBP）组成，能够与病毒的 VPg（帽状结构蛋白）特异地交叉结合，二者互作来促使病毒的翻译、增殖。 nbsp;图 6 nbsp;eIFiso4E.a 蛋白结构域三级结构分析 nbsp;Fig. 6 nbsp;Analysis of eIFiso4E.a protein domain tertiary structure 2.5 nbsp;TuMV VPg 蛋白氨基酸序列及差异氨基酸偏好性分析 nbsp;利用 DNAMAN 软件，对 TuMV-UK1 VPg 与 TuMV-C4 VPg 氨基酸序列进行序列比对，发现二者间存在 4 个氨基酸差异位点，且相对集中（图 7） ，分别是第 89（ F/L） 、 105（ N/D） 、 114（ P/S）和 119（ M/V）位氨基酸。 nbsp;在 NCBI 数据库中，对 TuMV C4 VPg 氨基酸序列进行 blast，在检索到的结果中选取 TuMV UK1/C1/C2/C3/C4/C5 等 6 个株系的 VPg 序列（检索号分别为 AF169561_1、 AF394601_1、AF395674_1、 AF395675_1、 AF395676_1 和 AF395677_1） ，对 81 130 个氨基酸残基进行序列频率分析（图 8） 第 89 位氨基酸为苯丙氨酸（ F）或亮氨酸（ L） ，前者为芳香性氨基酸，而后者为脂肪族氨基酸，二者间替换，对 VPg 蛋白的空间结构影响较大，其中亮氨酸（ L）的使用频率高于苯丙Li Guoliang， Qian Wei， Zhang Shujiang， Li Fei， Zhang Shifan， Zhang Hui， Xie Lulu， Wu Jian， Wang Xiaowu， Sun Rifei. Analysis of the protein interaction of eIFiso4E.a/c with TuMV-C4/UK1 in Brassica rapa ssp. chinensis. 1306 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 7 1299– 1308. 氨酸（ F） 。第 105 位氨基酸为天冬氨酸（ D）或天冬酰胺（ N） ，前者为酸性氨基酸，后者为极性氨基酸，距离氨基较远的羧基换成酰胺，酸性明显降低，二者间的替换使局部蛋白性质发生变化，如图 8 所示，天冬氨酸（ D）的使用频率较高。第 114 位氨基酸为丝氨酸（ S）或脯氨酸（ P） ，第 119位氨基酸为甲硫氨酸（ M）或缬氨酸（ V） ，在上述两个氨基酸位点处，前者都为极性氨基酸，而后者都为非极性氨基酸， 二者侧链 R 基团的极性不同， 相互替换后导致蛋白的极性发生改变。 在第 114位氨基酸位点处，脯氨酸（ P）的使用频率明显高于丝氨酸。在 119 位氨基酸位点处，缬氨酸（ V）的使用频率明显比甲硫氨酸（ M）高。不同的 TuMV 株系在特定氨基酸位点处，对氨基酸具有一定的选择性，不同氨基酸间的替换，决定了其蛋白质空间结构和功能表达的差异。 nbsp;图 7 nbsp;TuMV-UK1/C4 VPg 氨基酸序列分析 nbsp;* 表示一致； ∶ 表示强相似； . 表示弱相似。 nbsp;Fig. 7 nbsp;Sequence analysis of TuMV-UK1/C4 VPg amino acid * represent identity； ∶ represent strong similarity； . represent weak similarity. 图 8 nbsp;TuMV VPg 氨基酸（ 81 130）序列频率分析 nbsp;Fig. 8 nbsp;Sequence frequency analysis of TuMV VPg amino acids 3 nbsp;讨论 nbsp;白菜作物中翻译起始因子 eIF4E 以及其异构体 eIFiso4E，在 mRNA 翻译起始过程中发挥着重要作用。二者通过与 TuMV-VPg 或 TuMV-HC 蛋白相互作用，对病毒 mRNA 翻译起始进行干扰，从而影响病毒的侵染（ Freire， 2014） 。 Jenner 等（ 2010）在白菜中分离出 eIFiso4E 的 3 个拷贝，即BraA.eIFiso4E.a、 BraA.eIFiso4E.b 和 BraA.eIFiso4E.c，其中在白菜 BAC 文库中未检测到BraA.eIFiso4E.b，推测该拷贝为假基因。 Rusholme 等（ 2007）以大白菜感病材料（ R-o-18）和抗病材料（ BP058）为亲本，鉴定了 TuMV 的抗病基因 retr01 和 ConTR01，其中， retr01 为BraA.eIFiso4E.a， ConTR01 为 BraA.eIFiso4E.c。 Qian 等（ 2013）以白菜感 TuMV 的高代自交系材料‘极早春’和抗 TuMV 的高代自交系‘ BP8407’为亲本，构建 F2分离群体，通过人工磨擦接李国亮，钱 nbsp;伟，张淑江，李 nbsp;菲，章时藩，张 nbsp;慧，谢露露，武 nbsp;剑，王晓武，孙日飞 . 白菜翻译起始因子 eIFiso4E.a/c 与芜菁花叶病毒 TuMV-C4/UK1 蛋白互作分析 . 园艺学报， 2017， 44 7 1299– 1308. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1307 种 TuMV-C4 株系， 采用 ELISA 进行植株抗感病鉴定， 进行抗病性遗传分析， 定位了抗 TuMV 的 retr02基因。 retr02 也对应 BraA.eIFiso4E.a。由此推测 retr01 和 retr02 基因应该为同一个基因BraA.eIFiso4E.a（ Nellist et al.， 2014） 。 Li 等（ 2016）根据 BraA.eIFiso4E.a 抗性基因中 SNP 位点，开发 dCAPS 和 KASP 标记，可高通量鉴定 BraA.eIFiso4E.a 位点，用于分子标记辅助选择育种（ MAS） 。 nbsp;目前白菜中已定位 13 个抗 TuMV 基因， 分别为 TuRB01（ Walsh et al.， 1999） 、 TuRB01b（ Fujiwara et al.， 2011） 、 TuRB02（ Walsh et al.， 2002） 、 TuRB03（ Hughes et al.， 2003） 、 TuRB04（ Walsh amp; Jenner，2002） 、 TuRB05（ Walsh amp; Jenner， 2002） 、 retr01/C/p