GB T 45589-2025 番茄褐色皱果病毒检疫鉴定方法.pdf

ICS65 020 20 CCSB16 中华人民共和国国家标准 GB T45589 2025 番茄褐色皱果病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTobamovirusfructirugosum 2025 04 25发布2025 11 01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布 前 言 本文件按照GB T1 1 2020 标准化工作导则 第1部分 标准化文件的结构和起草规则 的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 SAC TC271 提出并归口 本文件起草单位 中国检验检疫科学研究院 北京市农林科学院 福州海关技术中心 广州海关技术 中心 中国农业科学院植物保护研究所 山东农业大学 本文件主要起草人 张永江 邱艳红 赵振兴 沈建国 冯藜霞 周雪平 李向东 董铮 杨秀玲 GB T45589 2025 番茄褐色皱果病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件描述了番茄褐色皱果病毒的血清学和分子生物学检测方法 本文件适用于番茄褐色皱果病毒的检疫鉴定 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中 注日期的引用文 件 仅该日期对应的版本适用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于 本文件 GB T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4 番茄褐色皱果病毒分类信息 中文名 番茄褐色皱果病毒 学 名 Tobamovirusfructirugosum 英文名 tomatobrownrugosefruitvirus 缩 写 ToBRFV 分类地位 马泰利病毒目 Martellivirales 帚状病毒科 Virgaviridae 烟草花叶病毒属 Tobamovirus 番茄褐色皱果病毒的其他信息见附录A 5 方法原理 番茄褐色皱病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 根据番茄褐色皱病毒与抗 体之间的特异性反应 对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定 DoubleAntibodySandwichEn zymeLinkedImmunosorbentAssay DAS ELISA 依据番茄褐色皱病毒的基因组特征建立RT PCR 和双重实时荧光RT PCR检测方法 通过这些方法的有效组合 判断样品是否带有番茄褐色皱病毒 6 试剂 仪器设备及用具 6 1 试剂 除另有规定外 所有试剂均为分析纯 试验用水应符合GB T6682中三级水的相关规定 DAS ELISA试剂应符合附录B中B 1 胶体金免疫层析试纸条试剂应符合附录C中C 1 1 GB T45589 2025 RT PCR试剂应符合附录D中D 1 双重实时荧光RT PCR试剂应符合附录E中E 1 6 2 仪器设备 高速冷冻离心机 电子天平 PCR仪 实时荧光PCR仪 水平电泳系统 4 冰箱 20 低温冰 箱 40 低温冰箱 80 超低温冰箱 凝胶成像分析系统 pH计 微波炉 磁力搅拌器 恒温水浴 锅 高压灭菌锅 超净工作台 分光光度计 酶标仪等 6 3 用具 酶联板 可调移液器 2 5 L 10 L 20 L 100 L 200 L 1000 L 移液器吸头 1 5mL离心 管 研钵等 7 制样 7 1 植物材料制样 待检样品为植物材料 小苗或叶片或果实 时 挑选有疑似症状的部位单独取样编号 症状描述见附 录A 未表现症状的植物材料随机取样编号后混合制样 取一定量的待检样品 如0 5g叶片 每1g 样品加入5mL 10mL样品抽提缓冲液 见B 1 5 研磨后离心取上清液 用于ELISA 胶体金免疫层 析试纸条检测及核酸提取 或称取一定量的待检样品 如0 1g叶片 提取核酸后用于RT PCR或双重 实时荧光RT PCR检测 7 2 种子制样 待检样品为种子时 随机抽取约3000粒种子 或根据实际情况随机抽取0 5g 3g种子 研磨成 粉末后 每1g样品加入5mL 10mL样品抽提缓冲液 见B 1 5 或1 PBS缓冲液 见D 1 1 常温浸 泡0 5h 1h或4 浸泡8h 12h后离心取上清液 用于核酸提取 或称取0 1g干粉样品提取核酸 后用于RT PCR或双重实时荧光RT PCR检测 8 检测鉴定 8 1 DAS ELISA测定 取第7章中制备的样品上清液进行DAS ELISA检测 试验应设置阳性对照 阴性对照和空白对 照 具体操作按照附录B规定的方法进行 8 2 胶体金免疫层析试纸条检测 取第7章中制备的样品上清液进行胶体金免疫层析试纸条检测 试验应设置阳性对照 阴性对照 和空白对照 具体操作按照附录C规定的方法进行 8 3 RT PCR检测 取第7章中制备的待检样品核酸进行RT PCR检测 试验应设置阳性对照 阴性对照和空白对 照 具体操作按照附录D规定的方法进行 8 4 双重实时荧光RT PCR检测 取第7章中制备的待检样品核酸进行双重实时荧光RT PCR检测 试验应设置阳性对照 阴性对 2 GB T45589 2025 照和空白对照 具体操作按照附录E规定的方法进行 8 5 序列测定和分析 PCR产物纯化后进行测序 测序获得的核苷酸序列与已知的ToBRFV相应序列进行比对和分 析 具体操作按照附录F规定的方法进行 9 结果判定 9 1 植物材料结果判定 植物材料类样品检测的结果判定按以下规则进行 DAS ELISA检测结果为阴性 则判定样品未携带ToBRFV DAS ELISA检测结果为阳性 则 采用RT PCR或双重实时荧光RT PCR方法进行验证 若验证结果为阳性 则判定样品携带 ToBRFV 若验证结果为阴性 则判定样品不携带ToBRFV 胶体金免疫层析试纸条检测结果为阴性 则判定样品未携带ToBRFV 胶体金免疫层析试纸 条检测结果为阳性 则采用RT PCR或双重实时荧光RT PCR方法进行验证 若验证结果为 阳性 则判定样品携带ToBRFV 若验证结果为阴性 则判定样品不携带ToBRFV RT PCR检测结果为阴性 则判定样品未携带ToBRFV RT PCR检测结果为阳性 且双重实 时荧光RT PCR检测结果为阳性 则判定样品携带ToBRFV RT PCR检测结果为阳性 且测定的序列为ToBRFV序列 则判定样品携带ToBRFV 双重实时荧光RT PCR检测结果为阴性 则判定样品未携带ToBRFV 双重实时荧光RT PCR检测结果为阳性 则判定样品携带ToBRFV 9 2 种子材料结果判定 种子材料类样品检测的结果判定按以下规则进行 DAS ELISA和胶体金免疫层析试纸条一般不适用于种子材料检测 RT PCR检测结果为阴性 则判定样品未携带ToBRFV RT PCR检测结果为阳性 且双重实 时荧光RT PCR检测结果为阳性 则判定样品携带ToBRFV RT PCR检测结果为阳性 且测定的序列为ToBRFV序列 则判定样品携带ToBRFV 双重实时荧光RT PCR检测结果为阴性 则判定样品未携带ToBRFV 双重实时荧光RT PCR检测结果为阳性 则判定样品携带ToBRFV 10 结果记录与样品保存 10 1 结果记录 记录包括样品来源 种类 检测时间 地点 方法和结果 检测人员签字 DAS ELISA检测应有酶 联反应数值 胶体金免疫层析试纸条检测应有试纸条照片 RT PCR检测应有电泳图片 双重实时荧光 RT PCR检测应有扩增曲线图 10 2 样品保存 阳性样品直接放于 80 超低温冰箱或冷冻干燥后放于 20 低温冰箱或 40 低温冰箱 至 少保存一年 保存的样品要做好标记和登记工作 以备复验 谈判和仲裁 保存期满后 应经灭活处理 3 GB T45589 2025 附 录 A 资料性 番茄褐色皱病毒其他信息 A 1 寄主范围 自然寄主主要为番茄 Solanumlycopersicum 和辣椒属 Capsiumsp 植物 A 2 地理分布 亚洲 中国 印度 伊朗 以色列 日本 约旦 黎巴嫩 沙特阿拉伯 叙利亚 泰国 乌兹别克斯坦 欧洲 阿尔巴尼亚 奥地利 比利时 保加利亚 克罗地亚 塞浦路斯 捷克 爱沙尼亚 芬兰 法国 德国 希腊 匈牙利 爱尔兰 意大利 拉脱维亚 立陶宛 马耳他 荷兰 挪威 波兰 葡萄牙 罗马尼亚 斯诺文尼亚 西班牙 瑞士 英国 北美洲 墨西哥 加拿大 美国 多米尼加 危地马拉 南美洲 阿根廷 智利 秘鲁 非洲 埃及 埃塞俄比亚 摩洛哥 西撒哈拉 大洋洲 澳大利亚 A 3 症状 侵染番茄引起的典型症状为叶片出现花叶 褪绿 斑驳 畸形和果实出现坏死斑点 黄色或褐色斑 块 褐色皱纹 发病严重时果梗坏死 见图A 1 侵染辣椒主要引起叶片出现花叶 斑驳 黄化 坏死斑点 和果实出现褐色皱纹等症状 见图A 2 注 a b c 番茄褐色皱果病毒侵染番茄植株症状 d e f 番茄褐色皱果病毒侵染番茄果实症状 图A 1 番茄褐色皱果病毒侵染番茄引起的症状 4 GB T45589 2025 a 番茄褐色皱果病毒侵染辣椒植株症状 b 番茄褐色皱果病毒侵染辣椒果实症状 图A 2 番茄褐色皱果病毒侵染辣椒引起的症状 A 4 传播途径 主要通过种子 机械摩擦传播 研究表明 也可通过授粉昆虫如熊蜂进行传播 A 5 粒体形态 病毒粒体呈杆状 长约300nm 宽约18nm A 6 基因组 基因组为正义单链RNA 全长约6 4kb 包含4个开放读码框 ORFs ORF1和ORF2编码病毒 复制相关蛋白 ORF3编码运动蛋白 MP ORF4编码外壳蛋白 CP 5 GB T45589 2025 附 录 B 规范性 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 DAS ELISA B 1 试剂 B 1 1 包被抗体 特异性的番茄褐色皱果病毒抗体 B 1 2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的番茄褐色皱果病毒抗体 B 1 3 底物 对硝基苯磷酸二钠 pNPP B 1 4 1 PBST缓冲液 pH7 4 氯化钠 NaCl 8 0g 磷酸二氢钾 KH2PO4 0 2g 磷酸氢二钠 Na2HPO4 1 15g 氯化钾 KCl 0 2g 吐温 20 Tween 20 0 5mL 叠氮钠 NaN3 0 2g 溶于900mL灭菌双蒸水中 并用灭菌双蒸水定容至1000mL 4 储存 B 1 5 样品抽提缓冲液 pH7 4 亚硫酸钠 Na2SO3 1 3g 聚乙烯基吡咯烷酮 PVP MW24000 40000 20 0g 溶于900mL的1 PBST缓冲液中 并用灭菌双蒸水定容至1000mL 4 储存 B 1 6 包被缓冲液 pH9 6 碳酸钠 Na2CO3 1 59g 碳酸氢钠 NaHCO3 2 93g 叠氮钠 NaN3 0 2g 溶于900mL灭菌双蒸水中 并用灭菌双蒸水定容至1000mL 4 储存 B 1 7 酶标抗体稀释缓冲液 pH7 4 牛血清白蛋白 BSA 2 0g 聚乙烯基吡咯烷酮 PVP MW24000 40000 20 0g 溶于1000mL1 PBST缓冲液中 4 储存 B 1 8 底物缓冲液 pH9 8 二乙醇胺97mL 6 GB T45589 2025 氯化镁 MgCl2 0 1g 叠氮钠 NaN3 0 2g 溶于800mL灭菌双蒸水 用浓盐酸 HCl 调pH至9 8 并用灭菌双蒸水定容至1000mL 4 储存 注 等效商品化试剂同等使用 B 2 试验步骤 B 2 1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体 每孔加100 L 37 孵育2h或4 冰 箱过夜 清空孔中溶液 用1 PBST缓冲液洗涤3次 5次 B 2 2 样品制备与加样 按100 L 孔分别加入制备好的待检样品 阴性对照 空白对照和阳性对照 37 孵育2h或4 冰箱过夜 清空孔中溶液 用1 PBST缓冲液洗涤3次 5次 B 2 3 加酶标抗体 将酶标抗体稀释至工作浓度并加入到酶联板中 100 L 孔 37 孵育2h 清空孔中溶液 用1 PBST缓冲液洗涤3次 5次 B 2 4 加底物 将底物对硝基苯磷酸二钠 pNPP 加入到底物缓冲液中 使终浓度为1mg mL 现配现用 100 L 孔加入酶联板中 B 2 5 读数 在不同的时间内 如30min 60min 90min 120min或更长时间 阳性对照孔明显显色后 用酶标 仪在405nm处读光密度 OD405 值 注 采用等效商品化试剂盒 具体操作按厂家说明书进行 B 3 结果判定 B 3 1 质量控制要求 阳性对照OD405值与阴性对照OD405值的比值不小于2 同一样品的重复性基本一致 B 3 2 结果判定 在满足B 3 1的质量控制要求后 样品OD405值与阴性对照OD405值的比值大于2 判定为阳性 样 品OD405值与阴性对照OD405值的比值小于2 判定为阴性 7 GB T45589 2025 附 录 C 规范性 胶体金免疫层析试纸条检测 C 1 试剂 样品抽提缓冲液配制方法见B 1 5 C 2 试纸条保存 试纸条应在2 8 冰箱内密封干燥保存 C 3 检测步骤 C 3 1 样品制备 待检的植物材料 种子材料分别按7 1 7 2制备样品 或按试纸条说明书进行 C 3 2 样品检测 检测前将试纸条恢复至室温 将试纸条含胶体金复合物的一端垂直插入样品液中 样品液高度不超过胶体金试纸条上的MAX 线 测试观察时间宜10min 20min 对于病毒浓度低的样品时间可适当延长 或按试纸条说明书进行 C 4 结果判定 结果判定按以下规则进行 质控C线显红色 测试T线显红色 检测结果为阳性 质控C线显红色 测试T线未显色 检测结果为阴性 质控C线和测试T线均未显色 说明试纸条失效 检测结果无效 C 5 试纸条是否有效的判断方法 试纸条是否有效按以下规则进行判定 用阳性对照进行测试 测试T线显红色 质控C线显红色 说明整个系统工作正常 用阳性对照进行测试 测试T线显红色 质控C线未显色 说明二抗失效 用阳性对照进行测试 测试T线未显色 质控C线显红色 说明测试T线的特异性抗体失效 用阳性对照进行测试 若测试T线未显色 质控C线也未显色 说明整个测试纸条失效 8 GB T45589 2025 附 录 D 规范性 RT PCR检测 D 1 试剂 D 1 1 1 PBS缓冲液 pH7 2 7 4 氯化钠 NaCl 8 0g 氯化钾 KCl 0 2g 磷酸氢二钠 Na2HPO4 1 15g 磷酸二氢钾 KH2PO4 0 2g 溶于800mL灭菌双蒸水中 并用灭菌双蒸水定容至1000mL 4 储存 D 1 2 核酸提取及扩增试剂 核酸提取试剂为总RNA提取试剂 TrizoL 或合格的RNA提取试剂盒 RT PCR扩增试剂盒为OneStepRT PCRKit D 1 3 电泳缓冲液TAE 50 三羟甲基氨基甲烷 Tris 242g 冰乙酸 C2H4O2 57 1mL 乙二胺四乙酸二钠 Na2EDTA 2H2O 37 2g 灭菌双蒸水定容至1000mL 用时稀释至1 TAE 注 TBE等电泳缓冲液同等使用 D 2 检测步骤 D 2 1 核酸提取 称取0 1g样品加液氮研磨成粉末状 迅速将其移入灭菌的1 5mL离心管中 或将7 2制备的上清 液100 L移入1 5mL离心管中 加入1mL的总RNA提取试剂 TrizoL 剧烈振荡3min 4 12000r min离心10min 将上清液移入一新离心管中 加入0 5mL三氯甲烷 猛烈振荡15s 4 12000r min离心15min 小心吸取上层无色水相到新离心管中 加入等体积异丙醇 混匀 室温静置 10min 4 12000r min离心10min 弃上清液 加入1mL75 的冷乙醇洗涤沉淀 4 10000r min离心10min 弃乙醇 沉淀于室温下充分干燥后溶于30 L 100 LRNase freeH2O 中 80 保存备用 注 此处以0 1g样品和100 L上清液为例进行核酸提取 实际检测时样品量有变化 加入的试剂按照比例调整 其他等效核酸提取试剂同等使用 包括商品化试剂盒 D 2 2 引物序列 正向引物ToBRF F 5 GTCCCGATGTCTGTAAGGCTTGC 3 反向引物ToBRF R 5 GCAGGTGCAGAGGACCATTGTAA 3 扩增片段长度约680bp 9 GB T45589 2025 D 2 3 RT PCR扩增 RT PCR反应体系 宜按表D 1配制 RT PCR反应程序 50 反转录30min 94 预变性3min 然后94 变性30s 57 退火30s 72 延伸60s 35个循环 72 继续延伸10min 表D 1 RT PCR反应体系 组分加入量 L 核酸1 5 正向引物ToBRF F 10 mol L 1 0 反向引物ToBRF R 10 mol L 1 0 ddH2O8 0 2倍一步法混合液 2 OneStepBuffer 12 5 一步法酶混合液 OneStepEnzymeMix 1 0 总体积25 0 注1 等效产品的RT PCR反应体系同等使用 注2 使用两步法RT PCR试剂时 根据说明书调整相应的反应体系及反应程序 注3 采用不同的仪器设备 适当调整反应程序 D 2 4 琼脂糖凝胶电泳 制备1 5 的琼脂糖凝胶 然后将PCR产物加入到样品孔中 同时加入DNA分子质量标准物作分 子质量标记 进行电泳 电泳结束后在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带 拍 照 并保存照片 D 3 结果判定 在阴性对照和空白对照无特异性扩增 阳性对照出现预期680bp大小的扩增片段条件下 样品未出现预期大小的片段 则判定RT PCR结果为阴性 样品出现预期大小的片段 则判定RT PCR结果为阳性 01 GB T45589 2025 附 录 E 规范性 双重实时荧光RT PCR检测 E 1 试剂 核酸提取试剂同D 1 2 E 2 引物探针 双重实时荧光RT PCR所用引物探针如表E 1 表E 1 引物探针序列 名称序列扩增片段大小 正向引物CaTa28 F5 GGTGGTGTCAGTGTCTGTTT 3 反向引物CaTa28 R5 GCGTCCTTGGTAGTGATGTT 3 探针CaTa28 P5 6FAM AGAGAATGGAGAGAGCGGACGAGG BHQ 1 3 139bp 正向引物CSP1325 F5 CATTTGAAAGTGCATCCGGTTT 3 反向引物CSP1325 R5 GTACCACGTGTGTTTGCAGACA 3 探针CSP1325 P5 Cy5 ATGGTCCTCTGCACCTGCATCTTGAGA BHQ 1 3 100bp E 3 核酸提取 方法同D 2 1 E 4 双重实时荧光RT PCR反应 双重实时荧光RT PCR反应体系及反应程序详见表E 2 表E 2 双重实时荧光RT PCR反应体系及程序 组分加入量 L 2倍探针法一步混合液 2 ProbeOne StepMix 10 0 探针法一步酶混合液 ProbeOne StepEnzymeMix 0 4 CaTa28 F 10 mol L 0 2 CaTa28 R 10 mol L 0 2 CaTa28 P 10 mol L 0 1 CSP1325 F 10 mol L 0 2 CSP1325 R 10 mol L 0 2 CSP1325 P 10 mol L 0 1 核酸4 0 RNase freeH2O4 6 45 15min 94 30s 94 5s 60 30s 45个循环 11 GB T45589 2025 注1 等效产品的实时荧光RT PCR反应体系同等使用 注2 采用两步法检测试剂盒时 按说明书进行操作 注3 采用不同的仪器设备 适当调整反应程序 E 5 结果判定 空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线 阳性对照Ct值不大于30并出现典型扩增曲线的条 件下 待检样品的两对引物探针Ct值不小于40时 判定ToBRFV阴性 待检样品的任意一对引物探针Ct值不大于35时 判定ToBRFV阳性 待检样品的一对引物探针Ct值不小于40 另一对引物探针Ct值大于35且不大于40时 或待 检样品的两对引物探针Ct值均大于35且不大于40时 应重新进行测试 如果重新测试的两 对引物探针Ct值不小于40 判定ToBRFV阴性 如果重新测试的任意一对引物探针Ct值小 于40 判定ToBRFV阳性 21 GB T45589 2025 附 录 F 规范性 序列测定和分析 F 1 直接测序 PCR产物回收纯化后 利用引物进行正反向测序 F 2 克隆测序 PCR产物回收纯化后连接到载体 连接产物转化到感受态细胞中 筛选阳性克隆子进行测序 F 3 序列分析 直接测序或克隆测序获得的序列拼接后 利用生物学软件将其与已知的ToBRFV相应序列进行序 列比对和分析 31 GB T45589 2025 参 考 文 献 1 石钰杰 马子玥 杨秀玲 等 警惕番茄褐色皱纹果病毒在我国的传播和危害 J 植物保 护 2022 48 6 42 48 2 刘明航 冯黎霞 余辛 等 一种新发植物病毒 番茄褐色皱纹果病毒 J 植物检疫 2020 34 5 57 60 3 李献锋 刘明航 魏霜 等 番茄褐色皱果病毒RT PCR检测方法的建立与评价 J 病毒学 报 2022 38 4 905 914 4 CarusoAG BertaccaS ParrellaG RizzoR DavinoS PannoS Tomatobrownrugose fruitvirus Apathogenthatischangingthetomatoproductionworldwide J AnnalsofAppliedBiol ogy 2022 181 3 258 274 41 GB T45589 2025