HNZ118-2016生姜脱毒及检测技术规程.pdf

湖南省农业技术规程HNZ118 2016生姜脱毒及检测技术规程Technical regulations for virus free and detection of ginger 湖南省农业农村厅发布发布日期 2016年12月31日 HNZ118 2016 2 生姜脱毒检测技术规程为规范生姜脱毒及检测技术 制定本规程 1基本要求1 1实验室条件具备生姜脱毒 组织培养 病毒检测所需的实验场所 仪器设备和实验条件 1 2实验人员要求实验人员应具备生姜脱毒 组织培养及分子检测技术操作的能力 能力应根据相应的专业教育 培训 经验或可证明的技能进行资格确认 2种姜的选择与处理 2 1种姜的选择9 11月 在生姜叶片全部枯萎前 于种姜生产田上选取感染烟草花叶病毒 TMV 和黄瓜花叶病毒 CMV 症状较轻的生姜植株 挖取其种姜 所挖取的每块种姜单独为一个株系 并进行编号 2 2种姜的处理在人工光照培养箱内 温度 40 湿度 70 光照 0 催芽 约4 6周 待新芽 外植体 长至2cm 3cm时 备用 3培养基的配制3 1 MS培养基的配制3 1 1母液的配制 按照附件1的成分表 100倍液 配制MS大量元素母液 微量元素母液 有机母液 铁盐母液 3 1 2 MS培养基配制方法先在烧杯中放入适量蒸馏水 置于电炉上加热 依次加入上述母液各10ml 蔗糖30g 溶解后加入琼脂粉5 5g左右 边加热边搅拌至完全溶解 加蒸馏水定容至1L 用0 1mol L的盐酸或0 1mol L的氢氧化钠调节pH至5 7 5 8 根据不同需要定量分装 盖好瓶盖 或用封口膜封口并扎绳 分装好的培养基置于0 8kg cm2 1 1kg cm2消毒锅120 高压灭菌20min 为检验培养基灭菌效果 须放置5天未发现杂菌污染才能使用 培养基贮存时间不超过一个月 3 2初代培养基的配制在MS培养基的基础上 加入激素NAA 0 5mg L 6 BA 2 0mg L和病毒唑40 mg L 其见操作同3 1 2 HNZ118 2016 3 3 3增殖培养基的配制在MS培养基的基础上 将蔗糖用量调整至80g L 不加任何激素 其它操作同3 1 2 4茎尖接种4 1接种前准备4 1 1在接种前应准备酒精灯或电热灭菌器 酒精或新洁尔灭 无菌脱脂棉或纱布以及接种器械 培养基 接种用外植体等 4 1 2 超净工作台提前30min开机通风 打开接种用电热灭菌器 同时开启操作间 更衣间及缓冲间的紫外灯 30min后关掉紫外灯 4 1 3接种人员应在准备室消毒后在更衣室更换拖鞋 穿白大褂 戴上帽 口罩后方能进入接种室 4 1 4超净工作台消毒 用75 酒精消毒仔细擦拭一遍 4 1 5操作人员洗手后 用75 酒精喷或擦手 在操作台内自然吹干 4 2外植体的消毒灭菌将备用的外植体用解剖刀切下 放入器皿中用洗衣粉等清洁剂冲洗20 min 转入超净工作台进行操作 将芽段放入灭菌后的烧杯内 用75 酒精清洗30s 无菌水冲洗1次 0 1 HgCl溶液浸泡20 min 最后用无菌水冲洗5 6次 4 3茎尖剥离及接种将完成消毒灭菌操作的生姜芽段放在无菌滤纸上吸干水分 在30 40倍解剖镜下用无菌的解剖刀 解剖针剥取带一个叶原基的茎尖 大小约0 2mm 0 5mm 将生长点迅速按无菌操作程序接入初代培养基中 每个株系的芽点分别编号 5茎尖苗的初代培养 观察接入初代培养基的芽点 约30天左右 芽点转绿 60 80天后成苗 待苗长至2 3cm时 整株取出接入增殖培养基中进行增殖培养 6茎尖苗的增殖培养初代培养的组培苗接入增殖培养基后 约40 50天 发出4 6个丛生芽 切取其丛生芽转入增殖培养基中进行增殖培养 约30天后 选取高度 5cm的分化苗 去除基部老化组织 切取其丛生芽继续进行增殖培养 增殖培养的周期以30 40天为宜 增殖率为4 6 继代3 4次后 抽取一定数量的增殖苗用于病毒检测 经检测脱毒成功的株系方可进一步扩繁 7培养室环境调控培养室温度应控制在25 2 相对湿度保持在30 50 如果相对湿度高于50 则必须采用除湿机进行除湿 光照强度控制在1500lx 3000lx 光照培养时间为16h d 黑暗培养8h d 8病毒检测 HNZ118 2016 4 8 1检测对象烟草花叶病毒 Tobacco Mosaic Virus TMV 和黄瓜花叶病毒 Cucumber Mosaic Virus CMV 8 2抽样每个株系随机抽取1 2 的增殖苗进行检测 每个株系至少取样3个以上 8 3检测方法A逆转录 聚合酶链式反应法 Reverse Transcription PCR RT PCR A 1植物总RNA的提取 1 取样品适量放入无菌研钵中 加入液氮充分研磨组织至粉末状 转移至1 5ml离心管中 加入1ml提取液 用匀浆仪进行匀浆处理 室温静置5min 2 往上述离心管中加入200uL氯仿 剧烈震荡30s 室温孵育3 min 3 10 000rpm 4 条件下离心15 min 4 取上清液转移至新的1 5ml离心管中 加入与上清液相同体积的异丙醇 颠倒混匀 室温孵育10 min 5 10 000rpm 4 条件下离心10 min 6 去掉上清液 加入1ml 75 的乙醇 剧烈涡旋 7 7500rpm 4 条件下离心5 min 8 去掉上清 室温晾干约5 min 溶于50 uL 100uL RNA溶解液中 9 55 60 孵育10 min 将样品保存在 70 中 A 2反转录操作步骤 1 用移液枪吸取2 5uLRNA样品于1 5ml离心管中 65 孵育8min 2 冰上冷却3min 往离心管中加入7 5uL RTmix 7 5uL RTmix中包含dNTPs 5mmol L 2uL 5 RT buffer 2uL RNasin 0 125uL 反义链引物 10umol ul 0 5uL M MLV反转录酶0 5uL 超纯水2 375uL 3 42 水浴1h 4 将离心管从水浴锅中取出 92 孵育2min终止反应 冰上冷却得到CDNA A 3 PCR扩增单重及双重RT PCR体系 采用50uLPCR反应体系 包含模版2uL 正向和反向引物 引物序列见表1 各2uL 10 TransTaq T buffer 5uL 2 5mM dNTPs 4uL TransTaq T DNApolymerase0 5uL 最后加ddH2O至50uL HNZ118 2016 5 表1病毒病检测引物序列表病害上游引物下游引物目的片段CMV CCCACTCTTAACCACCCAACC GACGCAGCATACTGATAAACCAA 323TMV TAGACCCGCTAGTCACAG CAGAGGTCCAAACCAAAC 237PCR反应条件为 92 预变性2min 92 变性30s 62 退火30s 72 延伸1 min 循环4次后 92 变性30s 60 退火30s 72 延伸1 min 循环5次后 92 变性30s 58 退火30s 72 延伸1 min 循环14次后 92 变性30s 55 退火30s 72 延伸1 min 循环14次后 最后72 延伸10min A 4 PCR扩增产物的凝胶电泳 取8uL PCR扩增产物 用1 5 的琼脂糖凝胶进行电泳 5V cm恒压条件下电泳30min左右 在柯达凝胶成像系统下观察并照相保存 根据DNA分子量标准为参照 观察是否有目的基因大小的条带出现 A 5检测对照在样品检测的PCR和凝胶电泳操作过程中 同时设置阳性对照和空白对照 阳性对照的PCR模版为从经过分子生物学检测和生物学检测确诊的病原样品中提取的核酸物质 空白对照的PCR模版为PCR反应所用的灭菌去离子水 A 6结果判定根据凝胶电泳的结果进行判定 检测样品盒阳性对照均出现目的片段大小的扩增条带 空白对照无目的片段扩增条带 该检测样品判为阳性 即该样品携带病原 阳性对照出现目的片段大 小的扩增条带 检测样品盒空白对照中均无目的片段扩增条带 该检测样品判为阴性 即该检测样品未携带病原 B酶联免疫吸附法 Enzyme Linked ImmunoSorbentAssay ELISA B 1双抗体夹心法 DAS ELISA 1 根据稀释说明 用coating buffer稀释coating antibody至适当浓度 往每个反应孔中加入100uL稀释后的coating antibody 2 用保鲜膜或者湿毛巾包裹反应板 置于恒温箱中37 孵育4h 3 使用PBST 磷酸盐缓冲液 吐温20 清洗酶联板三次 4 取1g植物材料用10ml提取缓冲液研磨提取 可根据实际情况调整 用纱布过滤或者让其自然沉淀 取上清备用 HNZ118 2016 6 5 按照说明书稀释阳性对照和阴性对照 往反应孔中加入样品 阳性对照 阴性对照 空白对照 空白对照为提取缓冲液 各100uL 6 根据步骤2的方法包裹酶联板 然后在4 培育过夜 16h以上 7 根据步骤3洗板3 4次 8 按照适当的比例稀释antibody enzyme conjugate 往各反应孔中加入100uL稀释后的antibody enzyme conjugate 9 重复步骤2 37 孵育1h 10 按照步骤3洗板4次 11 配制适当浓度的substrate 过程中应注意避光 往每个反应孔中加入100uL配制好的substrate 12 重复步骤2 包裹酶联板 在黑暗的室温环境下培养1h 13 使用酶标仪在波长为405nm下 读取吸光值 OD值 B 2结果判定根据酶标仪中测定的吸光值进行定量判定 阳性对照的OD值 阴性和空白对照的2倍 样品的OD值大于阳性对照 该检测样品判为阳性 即该样品携带病原 样品的OD值小于阳性对照 该检测样品判为阴性 即该样品未携带病原 9脱毒苗的扩繁根据病毒检测结果 使用上述检测方法检测到病原的样品视为感病样品 其相对应的株系未脱毒成功 应停止扩繁 作为废弃物处理 使用上述检测方法未检测到病原的样品视为未感病的样品 其相对应的株系为脱毒组培苗 可进行大量扩繁 10引用和参考资料NY T 404 2000脱毒生姜种姜 苗 病毒检测技术规程编写单位 湖南省湘西自治州农业科学研究院 湖南农业大学园艺园林学院 湖南省农科院蔬菜所 编写人员 雷艳肖雅左小义胡新喜吴光辉杨建国刘昱卉肖骋 HNZ118 2016 7 附件1 MS大量元素各类母液成分表 100倍 母液名称药品名称重量药品名称重量大量元素母液NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl2 2H2O 44gMgSO4 7H2O 37g微量元素 母液KI 0 083g Na2MoO4 2H2O 0 025gH3BO3 0 62g CuSO4 5H2O 0 0025gMnSO4 H2O 1 69g CoCl2 6H2O 0 0025gZnSO4 7H2O 0 86g有机母液肌醇10g盐酸硫胺素 VB1 0 01g烟酸0 05g甘氨酸0 2g盐酸吡哆醇 VB6 0 05g铁盐母液EDTA二钠3 73g FeSO4 7H2O 2 78g