云南蓝莓根癌病病原鉴定及其防控药剂的筛选_张荣琴.pdf

中国农学通报 ChineseAgriculturalScienceBulletin 中国农学通报 2021 37 16 119 126 ChineseAgriculturalScienceBulletin 基 金 项 目 国 家 重 点 研 发 计 划 项 目 主 要 经 济 作 物 重 要 及 新 成 灾 害 绿 色 综 合 防 控 技 术 2019YFD1002000 云 南 省 万 人 计 划 产 业 技 术 领 军 人 才 专 项 YNWR CYJS 2019 046 云南省重点研发 农业领域 计划项目 蓝莓病虫害诊断和绿色防控综合体系建设 2018BB016 第 一 作 者 简 介 张 荣 琴 女 1994 年 出 生 云 南 楚 雄 人 硕 士 主 要 从 事 植 物 病 害 防 治 研 究 通 信 地 址 661300 云 南 省 红 河 州 河 口 县 沙 坝 云 南 省 红 河 热带农业科学研究所 E mail 382429016 通 讯 作 者 魏 兰 芳 女 1971 年 出 生 河 南 遂 平 人 高 级 实 验 师 硕 士 研 究 方 向 微 生 物 资 源 开 发 与 利 用 通 信 地 址 650201 云 南 省 昆 明 市 盘 龙 区 沣 源 路452 号 云 南 农 业 大 学 E mail 1121942876 姬 广 海 男 1970 年 出 生 河 南 睢 县 人 教 授 博 士 研 究 方 向 植 物 细 菌 病 害 通 信 地 址 650201 云南省昆明市盘龙区沣源路452 号 云南农业大学 E mail jghai001 收稿日期 2020 08 03 修回日期 2021 03 21 云南蓝莓根癌病病原鉴定及其防控药剂的筛选 张荣琴 1 2 万效琰 1 张晋豪 1 代真林 1 郑建立 3 崔兴国 3 赵项武 3 魏兰芳 1 姬广海 1 1 云南农业大学 农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室 昆明650201 2 云南省红河热带农业科学研究所 云南河口661300 3 曲靖佳沃现代农业有限公司 云南曲靖655000 摘 要 研 究 旨 在 确 定 云 南 省 蓝 莓 主 产 区 发 生 的 蓝 莓 根 癌 病 病 原 菌 种 类 并 进 行 田 间 防 治 药 剂 筛 选 采 集 云 南 省 蓝 莓 主 产 区 蓝 莓 根 癌 病 样 品 通 过 发 病 症 状 菌 落 形 态 观 察 致 病 性 测 定 Biolog 分 析 16S rDNA 序 列 分 析 比 较 进 行 系 统 鉴 定 在 发 病 严 重 的 蓝 莓 基 地 采 用 噻 霉 酮 申 嗪 霉 素 等8 种 药 剂 进 行 田 间 防 治 试 验 从 蓝 莓 根 癌 病 样 品 中 分 离 纯 化 获 得 的 菌 株L 11 接 种 向 日 葵 番 茄 蓝 莓 植 株 均 能 发 病 且 发 病 症 状 与 田 间 症 状 相 同 重 新 分 离 得 到 形 态 相 同 的 菌 株 16SrDNA 序 列 分 析 和 系 统 进 化 树 结 果 表 明 L 11 菌 株 序 列 与 根 癌 土 壤 杆 菌 Agrobacterium tumefaciens 菌 株Ell 7 登 录 号FJ613554 1 同 源 性 高 达 97 65 与 根 癌 土 壤 杆 菌 处 于 同 一 分 支 上 菌 株L 11 利 用ipt 基 因 的 特 异 性 引 物AtP3F AtP3R 能 扩 增 出 155bp 的 特 异 性 片 段 进 一 步 证 实 蓝 莓 根 癌 病 由 根 癌 土 壤 杆 菌 引 起 田 间 药 效 试 验 结 果 表 明 1 5 噻 霉 酮 水 乳 剂 对 蓝 莓 根 癌 病 有 较 好 的 防 治 效 果 相 对 防 效 为52 这 是 云 南 首 次 报 道 由 根 癌 土 壤 杆 菌 引 起 蓝莓根癌病 关键词 蓝莓根癌病 病原菌 分离 鉴定 根癌土壤杆菌 药剂筛选 中图分类号 S436 文献标志码 A 论文编号 casb2020 0315 Pathogen Identification of Blueberry Crown Gall Disease in Yunnan Province and Screening of Control Agents in Field Zhang Rongqin 1 2 Wan Xiaoyan 1 Zhang Jinhao 1 Dai Zhenlin 1 Zheng Jianli 3 Cui Xingguo 3 Zhao Xiangwu 3 Wei Lanfang 1 Ji Guanghai 1 1 Key Laboratory of Agriculture Biodiversity for Plant Disease Management of the Ministry of Education Yunnan Agricultural University Kunming 650201 2 Honghe Tropical Agricultural Science Institute of Yunnan Hekou Yunnan 661300 3 Qujing Jiawo Modern Agriculture Co Ltd Qujing Yunnan 655000 Abstract The study aims to d etermine the species of blueberry crown gall pathogenic bacteria currently occurring in the main blueberry producing areas of Yunnan Province and screen the field control agents Collecting blueberry crown gall disease samples from the main blueberry production areas in Yunnan the symptoms of the disease colony morphology pathogenicity test Biolog analysis and 16 S rDNA sequence analysis were carried out for systematic identification The agent screening test was conducted at the blueberry base with serious disease and eight kinds of pesticides such as thiazinone and shenzemycin were used for field control experiments The strain L 11 isolated and purified from blueberry crown gall disease samples could infect sunflower tomato and blueberry plants and the symptoms were simila r to those in field The strain with中国农学通报 0 引言 蓝 莓 Vaccinium spp 又 称 越 桔 属 杜 鹃 花 科 越 桔 属 灌 木 分 布 在 热 带 亚 热 带 温 带 等 地 区 蓝 莓 果 实 风味独特 营养丰富 具有较高的经济价值和广阔的栽 培 前 景 1 近 年 来 蓝 莓 在 云 南 省 的 种 植 面 积 逐 年 增 加 各 种 蓝 莓 病 害 也 频 繁 发 生 2 其 中 蓝 莓 根 癌 病 是 一 种为害蓝莓根部的重要病害 使蓝莓产量急剧下降 经 济 损 失 严 重 根 癌 病 是 一 种 普 遍 发 生 的 细 菌 性 病 害 由具有致瘤性的根瘤菌科菌株引起 包括土壤杆菌属 异 根 瘤 菌 属 和 根 瘤 菌 属 的 多 个 种 可 侵 染 多 种 果 树 和 一 些 多 年 生 观 赏 植 物 3 危 害 根 颈 主 根 侧 根 4 为 果 园 及 苗 圃 带 来 重 大 经 济 损 失 2010 年 阿 根 廷 首 次 发 现 和 报 道 了 由 根 癌 农 杆 菌 引 起 的 蓝 莓 根 癌 病 5 同 年 国内研究人员在辽宁 吉林 山东及黑龙江省发现了蓝 莓 根 癌 病 6 目 前 未 见 云 南 省 蓝 莓 根 癌 病 的 研 究 报 道 为 阐 明 云 南 省 发 生 的 蓝 莓 根 癌 病 病 原 菌 种 类 笔 者采用多点采样 进行病原菌分离培养 致病性测定和 病 原 菌 的 系 统 鉴 定 以 期 为 蓝 莓 根 癌 病 的 研 究 和 防 治 提供参考 1 材料与方法 1 1 样品采集 蓝莓根癌病样品分别采集自云南省蓝莓主栽区曲 靖 市 麒 麟 区 马 龙 区 玉 溪 市 澄 江 县 昆 明 市 石 林 县 蓝 莓基地发病地块 采集具有根癌病病症的根部肿瘤组 织 保存于纸质采样袋中 1 2 菌株分离和培养 参照文献 7 8 中根癌菌的分离方法 选取根部肿瘤 组 织 白 色 幼 嫩 部 分 清 洗 干 净 后 用75 乙 醇 表 面 消 毒 60s 再 用 无 菌 水 漂 洗3 次 用 无 菌 研 钵 将 组 织 研 碎 转 移 至 无 菌 三 角 瓶 中 加 入45mL 无 菌 水 28 160r min 振荡30min 将上清 液梯度 稀释 10 1 10 5 各取100 L 在YEM 和MW 培 养 基 按 低 浓 度 至 高 浓 度 进 行 涂 布 分 离 28 培 养48h 参 考 文 献 9 中 根 癌 土 壤 杆 菌 代 表 菌 株 的 菌 落 特 征 和 生 物 学 特 性 测 定 方 法 筛 选 具 有 根 癌 土 壤 杆 菌 特 征 的 单 菌 落 纯 化 培 养2 代 后 保 存 备 用 表1 1 3 致病性测定 1 3 1 向 日 葵 番 茄 接 种 试 验 选 取 向 日 葵 和 番 茄 为 指 示 植 物 10 将 分 离 得 到 的20 株 纯 培 养 菌 株 表1 分 别 接 种 到50 mLKB 液 体 培 养 基 中 28 过 夜 培 养 制 备 浓 度 为1 10 9 CFU mL 的 菌 悬 液 采 用 针 刺 法 接 种 健 康 向 日 葵 和 番 茄 植 株 的 茎 基 部 并 用 脱 脂 棉 保 湿 对 照 用 无 菌 水 接 种 处 理 每 个 处 理5 个 重 复 每 天 观 察 植 株 发 病 情 况 2 周 后 开 始 观 察 并 记 录 肿 瘤 的 生 长 情 况 根 据 柯 赫 氏 法 则 对 发 病 部 位 进 行 再 分 离 根 据 菌 株的形态特征判断分离得到的病菌是否与原接种菌株 相同 1 3 2 蓝 莓 回 接 试 验 选 取 致 病 性 较 强 的 菌 株 回 接 蓝 莓 菌 悬 液 制 备 方 法 同1 3 1 灌 根 生 长 健 壮 的 蓝 莓 植 株 对 照 用 无 菌 水 灌 根 处 理 每 个 处 理5 个 重 复 每 天 观 察 植 株 发 病 情 况 30 天 后 开 始 观 察 记 录 肿 瘤 的 生 长 情况 1 4 病原菌的分子生物学鉴定 1 4 1 病 原 菌DNA 的 提 取 将 供 试 菌 株L 11 2JK11 芽 孢 杆 菌 1 BT 186 假 单 胞 菌 1 BT 22 冬 青 节 杆 菌 2 BT 19 黄 杆 菌 RG 4 根 瘤 菌 接 种 至NA 培 养 identical morphology was obtained by re isolation 16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree analysis showed that the sequence of L 11 strain and Agrobacterium tumefaciens strain Ell 7 accession number FJ 613554 1 homology was up to 97 65 and L 11 was on the same branch as A tumefaciens The specific fragment of 155 bp was amplified by the ipt specific primer AtP 3F AtP 3 R in L 11 which further confirmed that blueberry crown gall disease was caused by A tumefaciens The field efficacy test results showed that 1 5 thiazinone emulsion in water had a better control effect on blueberry crown gall disease with a relative control effect of 52 This is the first report of blueberry crown gall disease caused by A tumefaciens in Yunnan Keywords blueberry crown gall disease pathogenic bacteria isolation identification Agrobacterium tumefaciens pharmacy screening 表 1 蓝莓根部肿瘤中分离获得的菌株 编号 L4 P4 P4 12 P4 14 P4 1 Jh 4 P2 13 P2 14 P2 1 P2 2 采集地点 昆明市石林县 昆明市石林县 昆明市石林县 玉溪市澄江县 玉溪市澄江县 玉溪市澄江县 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 编号 L 11 L 12 P2 3 P2 5 P2 6 P2 12 L 3 L 5 L4 20 P4 21 采集地点 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市麒麟区 曲靖市马龙区 曲靖市马龙区 曲靖市马龙区 曲靖市马龙区 120基 28 培 养24 h 用 接 种 环 挑 取 少 量 菌 体 接 种 于LB 液 体 培 养 基 28 160r min 过 夜 培 养 后 收 集 菌 体 按 照 细 菌DNA 提 取 试 剂 盒 天 根DP302 02 说 明 书 提 取 细菌基因组DNA 1 4 2 16S rDNA 序 列 分 析 及 其 同 源 性 比 较 根 据 已 发 表 的 细 菌16SrDNA 通 用 引 物 11 27F 和1492R 对 供 试 菌 株 进 行 PCR 扩 增 引 物 序 列 为 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 参 照 Taq PCR Master Mix catTSE030 擎 科 配 制25 LPCR 反 应 体 系 PCR 扩 增 程 序 为 95 预 变 性5min 94 变 性30s 55 退 火30 s 72 延 伸1 min 35 个 循 环 72 延 伸 10 min 扩 增 产 物 用1 0 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 检 测 扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序 将 得 到 的16SrDNA 序 列 与BLAST 中 的 分 析 结 果 进 行 比 较 使用MEGA6 0 构建系统发育进化树 1 4 3 特 异 性 引 物 设 计 及 检 测 将 根 癌 土 壤 杆 菌 的ipt 基 因 在BLAST 中 进 行 同 源 性 比 对 并 将 靶 片 段 序 列 通 过BLASTn 进 行 同 源 性 比 对 设 计 出 特 异 性 较 强 的 蓝 莓 根 癌 病 菌 特 异 性 引 物 12 14 由 昆 明 擎 科 生 物 技 术 公 司 合 成 引 物 序 列 为AtP3F 5 GCAACGAGTTAGCAGAC GAG 3 AtP3R 5 CCCATCGATCCCTTCCAGTA 3 预 期 片 段 为155bp 利 用AtP3F AtP3R 对 菌 株L 11 和5 株 非 靶 标 菌 株 2JK11 1 BT 186 1 BT 22 2 BT 19 RG 4 进 行PCR 扩 增 参 照TaqPCRMasterMix catTSE030 擎 科 配 制 25 LPCR 反 应 体 系 PCR 扩 增 程 序 同1 4 2 扩 增 产 物 用1 0 琼脂糖凝胶进行电泳检测 1 5 Biolog 生理生化特性测定 采 用 美 国BIOLOG 公 司 的MicrostationTMV 4 01 系 统 革 兰 氏 阴 性 菌 微 板 GN 和 数 据 库 Biolog GN 板 反 应 底 物 如 表2 试 验 程 序 按 公 司 的 操 作 指 南 进 行 将 供 试 菌 株L 11 在YEM 培 养 基 上 转 接2 次 划 线 接 种 到Bug 琼 脂 培 养 基 上 28 培 养24h 用 无 菌 棉 签 轻 轻 擦拭培养基上的菌落 移入无菌稀释缓冲液中 混匀得 到 菌 悬 液 测 定 其 浊 度 为98 用 移 液 器 将 菌 悬 液 加 入GN 微 孔 板 每 孔150 L 共96 孔 对 照 孔 加150 L 无菌水 置于28 培养 4 24 48h 后读数记录结果 1 6 田间药剂筛选 1 6 1 供试蓝莓 试验蓝莓园位于曲靖市麒麟区越州镇 大梨树村 试验于2018 年12 月开始 2019 年5 月结束 1 6 2 供 试 药 剂 化 学 药 剂 包 括50 氯 溴 异 氰 尿 酸 粉 剂 南 京 南 农 农 药 科 技 发 展 有 限 公 司 1 5 噻 霉 酮 水 乳 剂 陕 西 西 大 华 特 科 技 实 业 有 限 公 司 1 申 嗪 霉 素 悬 浮 剂 上 海 农 乐 生 物 制 品 有 限 公 司 叶 斑 宁 60 亿 芽 孢 mL 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌Lx 11 水 剂 江 苏 苏 科 农 化 有 限 公 司 生 防 菌 剂 为WR13 6 C3 13 6 枯 草 芽 孢 杆 菌 均由本实验室提供 表 2 Biolog GN 微孔板上 96 种碳氮源底物 编号 A B C D E F G H 编号 A B C D E F G H 1 水 赤藓糖醇 D 蜜二糖 乙酸 p 对羟基苯乙酸 溴丁二酸 L 组氨酸 尿刊酸 7 N 乙酰 D 氨基半乳糖 肌醇 蔗糖 D 葡萄糖酸 丙二酸 L 丙氨酰甘氨酸 L 焦谷氨酸 2 氨基乙醇 2 环糊精 D 果糖 甲基 D 葡萄糖苷 顺式乌头酸 亚甲基丁二酸 琥珀酰胺酸 羟基 L 脯氨酸 肌苷 8 N 乙酰 D 氨基葡萄糖 D 乳糖 D 海藻糖 D 氨基葡萄糖酸 丙酸 L 天门冬酰胺 D 丝氨酸 2 3 丁二醇 3 糊精 L 海藻糖 D 阿洛酮糖 柠檬酸 丁酮酸 葡糖醛酰胺 L 亮氨酸 尿苷 9 金盏花醇 乳果糖 松二糖 D 葡萄糖醛酸 奎宁酸 L 天冬氨酸 L 丝氨酸 丙三醇 4 淀粉 D 半乳糖 D 棉子糖 蚁酸 酮戊二酸 氨基丙酰胺 L 鸟氨酸 胸苷 10 L 阿拉伯糖 麦芽糖 木糖醇 羟丁酸 D 砂糖酸 L 谷氨酸 L 苏氨酸 D L 吲哚甘油磷酸 5 吐温40 龙胆二塘 L 鼠李糖 D 半乳糖酸内酯 氧代戊酸 D 丙氨酸 L 苯丙氨酸 苯乙胺 11 D 阿拉伯醇 D 甘露醇 丙酮酸甲酯 羟丁酸 癸二酸 甘氨酰 L 天冬氨酸 D L 肉毒碱 葡萄糖1 磷酸盐 6 吐温80 D 葡萄糖 D 山梨醇 D 半乳糖醛酸 D L 乳酸 L 丙氨酸 L 脯氨酸 腐胺 12 2 纤维素二塘 D 甘露醇 单甲琥珀酸 g 羟丁酸 丁二酸 甘氨酰 L 谷氨酸 g 氨基丁酸 葡萄糖6 磷酸盐 张 荣 琴 等 云 南 蓝 莓 根 癌 病 病 原 鉴 定 及 其 防 控 药 剂 的 筛 选 121中国农学通报 1 6 3 试验方法 1 药 剂 施 用 方 法 选 择 基 地 中 发 病 严 重 的 蓝 莓 植 株 进 行 药 剂 试 验 共9 个 处 理 8 个 药 剂 处 理 1 个 空 白 处 理 每 个 处 理30 株 蓝 莓 供 试 药 剂 稀 释 至 相 应 浓 度 表3 每 隔10 天 灌 根1 次 每 株 每 次 灌1000mL 共 灌 根5 次 2 试验结果调查及统计方法 坐 果 率 调 查 花 期 结 束 后 每 隔15 天 调 查1 次 坐 果 情 况 直 至 果 实 子 房 膨 大 成 形 不 再 出 现 生 理 落 果 为 止 坐果 率 子房 膨 大果实总数 单花总 数 10 0 1 田 间 药 剂 防 效 评 估 最 后 一 次 灌 根10 天 后 进 行 病 情 调 查 每 个 小 区 随 机 选 取5 株 蓝 莓 进 行 调 查 3 次 生 物 学 重 复 依 据 根 瘤 情 况 进 行 分 级 表4 按 照 式 2 4 计算各处理的发病率 病情指数以及防效 发病率 调 查病株数 调 查总株数 10 0 2 病情指 数 病级株 数 该 级代表数 总株 数 最高级 代表数值 10 0 3 防效 1 A B D C 1 00 4 式 中 A 为 试 验 区 处 理 后 的 病 情 指 数 B 为 试 验 区 处 理 前 的 病 情 指 数 C 为 对 照 区 处 理 后 的 病 情 指 数 D 为 对 照区处理前的病情指数 2 结果与分析 2 1 田间症状 蓝莓根部肿瘤早期呈圆形 黄白色 后期瘤体慢慢 变 大 并 由 黄 褐 色 变 为 暗 褐 色 根 部 肿 瘤 倾 向 于 木 质 化 表 皮 粗 糙 近 圆 形 或 不 规 则 直 径 可 达2 3 cm 严 重 可 达10 15cm 田 间 调 查 发 现 根 癌 发 病 早 期 在 苗 木 根 部 形 成 较 小 的 白 色 或 者 肉 色 粗 糙 瘤 状 物 图 1D 感 染 根 癌 病 后 植 物 根 部 吸 收 水 分 及 营 养 物 质 受阻 根系发育不良 发病后期 植株生长缓慢 叶片变 黄 干枯甚至整株死亡 12 2 2 致病性测定 2 2 1 向 日 葵 番 茄 接 种 试 验 20 株 供 试 菌 株 接 种 向 日 葵 幼 苗2 周 后 接 种P2 2 L 3 L 11 L 5 的 向 日 葵 在 茎 基 部 开 始 出 现 不 规 则 的 瘤 状 突 起 接 种 其 他 菌 株 的 向 日 葵 和 对 照 无 瘤 状 突 起 图2A 接 种30 天 后 瘤 状 突 起 逐 渐 增 大 形 成 明 显 肿 瘤 接 种L 11 的 植 株 瘤 状 突 起 最 大 其 余16 株 菌 株 和 对 照 仍 无 瘤 状 突 起 L 11 接 种 番茄幼苗14 天后 接种部位出现瘤状突 起 图2B 从 接 种 发 病 部 位 重 新 分 离 病 原 菌 获 得 纯 培 养 物 通 过 菌 株 形 态 学 特 征 判 断 分 离 得 到 的 病 菌 与 原 接 种 菌 株 相 同 2 2 2 蓝 莓 植 株 回 接 试 验 L 11 灌 根 蓝 莓60 天 后 在 接 种 植 株 根 部 形 成 不 规 则 的 结 节 状 突 起 对 照 植 株 的 接 种 部 位 无 瘤 状 突 起 90 天 后 瘤 状 突 起 逐 渐 增 大 形 成 明显的冠瘿瘤 图3B 对照植株无肿瘤形成 图3A 2 3 病原菌鉴定 2 3 1 Biolog 生 理 生 化 鉴 定 将L 11 菌 悬 液 接 种 到 Biolog 革 兰 氏 阴 性 菌 微 孔 板 GN 中 4 24 48 h 后 分 别 测 定 其 对 碳 氮 源 的 利 用 情 况 并 与 数 据 库 中 的 标 准 菌 株 进 行 比 较 L 11 与 数 据 库 中 的 放 射 根 瘤 菌 土 壤 杆 菌 属 Rhizobium radiobacter Agrobacetrum sp 相 似 程 度 较 高 表5 碳 源 氮 源 利 用 情 况 完 全 相 同 均 不 能 利 用 亚 甲 基 丁 二 酸 E2 氧 代 戊 酸 E5 D 丝 氨 酸 G8 表 4 根癌病分级标准 表 3 药剂施用浓度 药剂 化学药剂 50 氯溴异氰尿酸粉剂 1 5 噻霉酮水乳剂 叶斑宁 1 申嗪霉素悬浮剂 稀释比例 1 2000 1 2000 1 50 1 1500 药剂 生物菌剂 枯草芽孢杆菌 13 6 WR13 6 C3 稀释比例 1 200 1 30 1 10 1 30 级别 级 级 级 级 分级标准 健康 有1 5 个冠瘿瘤植株生长基本正常 瘤子在5 个以上根茎部冠瘿瘤占相应段周面积1 3 瘤子在较多并愈合成片根茎部冠瘿瘤占相应段周面积1 3 代表数值 0 1 2 3 122A 不同菌株接种向日葵产生的症状 B L 11 接种番茄产生的症状 图 2 L 11 致病性检测 A 接种灭菌水后蓝莓根部 B 接种L 11 后蓝莓根部 图 3 L 11 接种蓝莓幼苗的症状 A 田间蓝莓健康植株 B 田间蓝莓健康根部 C 田间蓝莓发病植株 D 田间发病蓝莓根部形态 图 1 田间蓝莓发病症状 张 荣 琴 等 云 南 蓝 莓 根 癌 病 病 原 鉴 定 及 其 防 控 药 剂 的 筛 选 B A A B A B C D 123中国农学通报 2 3 2 分子生物学鉴定 1 16S rDNA 分 子 鉴 定 以L 11 基 因 组DNA 为 模 板 用16S rDNA 通 用 引 物27F 1492R 进 行PCR 扩 增 扩 增 产 物 约1500bp L 1116SrDNA 测 序 序 列 登 录 号MK910214 1 进 行BLAST 比 对 与 根 癌 土 壤 杆 菌 Agrobacterium tumefaciens Ell 7 序 列 登 录 号 FJ613554 1 相 似 度 达 到97 65 将L 11 的16S rDNA 序列与其他农杆菌属的序列进行比较并构建系统发育 树 图4 表 明L 11 与 标 准 菌 株Ell 7 亲 缘 关 系 最 近 因 此 云 南 省 蓝 莓 根 癌 病 的 病 原 菌 鉴 定 为 根 癌 土 壤 杆 菌 Agrobacterium tumefaciens 2 特 异 性 引 物 扩 增 结 果 图5 利 用 根 癌 土 壤 杆 菌 特 异 性 引 物AtP3F AtP3R 对L 11 2JK11 1 BT 186 1 BT 22 2 BT 19 RG 4 基 因 组DNA 进 行PCR 扩 增 L 11 扩 增 出155bp 的 特 异 性 片 段 其 他 菌 株 均 未 表 5 L 11 菌株在 Biolog GN 微板中的代谢活性 195 mm 132 mm 96 96 dpi 编号 A B C D E F G H 1 0 296 534 258 281 635 526 2 372 330 307 718 163 345 526 423 3 391 469 523 525 439 435 4 374 532 454 794 589 574 5 424 575 610 797 41 6 444 573 422 762 568 544 607 7 457 464 603 849 464 704 539 8 387 540 601 573 297 861 42 430 9 352 506 523 471 675 777 530 425 10 352 334 376 591 402 433 11 391 310 289 310 452 319 397 12 493 384 216 276 366 584 375 553 注 表 格 中 为 数 字 表 明 反 应 阳 性 说 明 该 菌 株 可 以 利 用 表 格 中 为 数 字 表 明 阴 性 反 应 说 明 菌 株 不 能 利 用 表 格 中 为 说 明 反 应 在 阴 阳 之 间 图 4 基于 16 S rDNA 序列的蓝莓根癌病原菌相关种系统发育树 1 为DL2000Marker 2 为L 11 3 为2JK11 4 为1 BT 186 5 为1 BT 22 6 为2 BT 19 7 为RG 4 图 5 特异性引物 AtP 3F AtP 3R 扩增产物凝胶电泳图谱 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 124扩增出条带 可将L 11 鉴定为根癌土壤杆菌 2 4 田间药剂筛选 药 剂 筛 选 结 果 表6 表 明 1 5 噻 霉 酮 水 乳 剂 防 治 效 果 最 好 52 1 申 嗪 霉 素 悬 浮 剂 C3 生 防 菌 剂 50 氯 溴 异 氰 尿 酸 粉 剂 防 治 效 果 次 之 分 别 为48 45 43 3 结论 本研究对云南省蓝莓主产区采集的蓝莓根癌病样 品 进 行 病 原 菌 的 分 离 培 养 通 过 致 病 性 测 定 和 多 种 分 类 鉴 定 方 法 证 实 云 南 发 生 的 蓝 莓 根 癌 病 是 由 根 癌 土 壤 杆 菌 所 致 并 筛 选 出 对 蓝 莓 根 癌 病 有 较 好 防 治 效 果 的 药 剂1 5 噻 霉 酮 水 乳 剂 为 进 一 步 开 展 有 关 该 病 发 病规律及防治技术的系统研究提供科学依据 4 讨论 根 癌 病 菌 可 侵 染93 科331 属643 种 植 物 包 括 多 种 果 树 林 木 花 卉 甚 至 瓜 类 造 成 严 重 的 经 济 损 失 15 根 癌 病 病 原 菌 较 多 包 括 土 壤 杆 菌 属 异 根 瘤 菌 属 和 根 瘤 菌 属 的 多 个 种 2 土 壤 杆 菌 属 和 根 瘤 菌 属 的 关 系 一 直 存 在 争 议 有 学 者 提 出 按 照16SrDNA 序 列 分 析 可 将 土 壤 杆 菌 属 Agrobacterium 和 异 根 瘤 菌 属 Allorhizobium 归 为 根 瘤 菌 属 Rhizobium 16 但 也 有 学 者 发 现 根 瘤 菌 属 Rhizobium 中 个 别 种 与 土 壤 杆 菌 属 的 关 系 不 是 很 密 切 不 能 笼 统 地 说 土 壤 杆 菌 和 根 瘤 菌 的 关 系 较 近 而 应 该 深 入 研 究 土 壤 杆 菌 与 根 瘤 菌 的 种 间 关 系 17 土 壤 杆 菌 属 与 根 瘤 菌 属 的 鉴 别 标 准 之 一 是 病 菌 引 起 致 病 症 状 还 是 引 起 根 瘤 18 本 研 究 分 离 得 到 的 注 表中数据含有相同字母者表示差异不显著 P 0 05 新复极差检验 表 6 蓝莓根癌病田间药剂试验防治结果 处理 1 2 3 4 5 6 7 8 9 药剂 50 氯溴异氰尿酸粉剂 1 5 噻霉酮水乳剂 1 申嗪霉素悬浮剂 叶斑宁水剂 WR13 6 13 6 C3 枯草芽孢杆菌 CK 坐果率 53 21ab 54 63a 52 58ab 48 35b 50 13ab 48 25b 51 37ab 49 96ab 42 58c 发病率 51 28g 45 85i 55 23f 69 56c 68 33d 73 87b 48 33h 66 67e 85 53a 病情指数 39 64f 33 7i 36 17h 49 88b 40 24e 46 53d 38 64g 47 28c 69 88a 防效 43cd 52a 48b 29f 42d 33e 45c 32e 菌 株P2 2 L 3 L 11 L 5 都 会 引 起 蓝 莓 根 部 肿 瘤 说 明 这4 株菌归类至土壤杆菌属 根 癌 病 菌 通 过 伤 口 侵 染 植 物 T DNA 在 寄 主 植 物 中表达 编码生长素和细胞分裂素的生物合成 使植物 细 胞 增 殖 失 控 导 致 肿 瘤 的 形 成 19 化 学 农 药 防 治 效 果 并 不 显 著 持 效 性 差 20 1 5 噻 霉 酮 水 乳 剂 防 治 效 果 较 好 但 相 对 防 效 也 仅 为52 目 前 生 物 防 治 研 究 发 展 较 快 R rhizogenesK84 商 品 名 根 癌 宁 可 有 效 防 治 桃 根 癌 病 21 K84 是Kerr 于1972 年 发 现 的 一 株 无 致 瘤 性 的 发 根 根 瘤 菌 22 主 要 作 用 方 式 是 接 合 质 粒pAgK84 编 码 产 生 土 壤 杆 菌 素84 进 而 杀 灭 细 菌 23 另 外 放 射 土 壤 杆 菌M I 15 也 能 有 效 抑 制 葡 萄 根 癌 菌 的 生 长 和 致 瘤 24 还 有 无 致 病 性 的 葡 萄 土 壤 杆 菌E26 菌 株 对 葡 萄 根 癌 病 具 有 良 好 防 效 25 目 前 生 产 上 可 在 施 用 药 剂 的同时 采用植物检疫 苗木 砧木消毒 及时清除田间 病株 选育抗病品种 改进嫁接方式等手段进行综合治 理 控制蓝莓根癌病的发生 以实现蓝莓产业的可持续 发展 参考文献 1 常 福 兰 郑 婉 霞 汉 翠 蓝 莓 的 生 物 学 特 性 和 保 健 作 用 及 市 场 前 景 J 黑龙江农业科学 2013 2 160 161 2 杨 燕 林 和 志 娇 王 朝 文 等 云 南 蓝 莓 病 虫 害 调 查 及 防 治 方 法 J 植物保护 2014 40 4 153 156 197 3 Kuzmanovi Nemanja Pu awska Joanna Evolutionary Relatedness and Classification of Tumor Inducing and Opine Catabolic Plasmids in Three Rhizobium rhizogenes Strains Isolated from the Same Crown Gall Tumor J Genome Biology and Evolution 2019 11 6 4 崔 进 国 郑 广 存 果 树 根 癌 病 的 发 生 与 防 治 J 烟 台 果 树 2006 3 41 42 5 Alippi A M Lopez A C Balatti PA First Report of Agrobacterium rubi and A rhizogenes Causing Crown and Root Gall and Hairy RootonBlueberryinArgentina J PlantDisease 2010 94 8 张 荣 琴 等 云 南 蓝 莓 根 癌 病 病 原 鉴 定 及 其 防 控 药 剂 的 筛 选 125中国农学通报 6 傅 俊 范 彭 超 严 雪 瑞 等 蓝 莓 根 癌 病 发 生 调 查 及 病 原 鉴 定 J 吉 林农业大学学报 2011 33 3 283 286 292 7 赵 小 兰 赵 梁 军 月 季 根 癌 病 病 原 菌 分 离 及 抗 病 资 源 初 步 筛 选 J 植物保护 2006 6 54 58 8 陈 晓 英 相 望 年 我 国 啤 酒 花 根 癌 土 壤 杆 菌 的 初 步 研 究 J 微 生 物 学报 1987 27 1 10 16 9 尹 向 田 魏 彦 锋 徐 亮 等 葡 萄 根 癌 病 病 原 菌 的 筛 选 及 鉴 定 J 农 学学报 2019 9 2 24 30 1