甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析.pdf

引文格式 张敏 罗宁 陈爱昌 等 甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析 J 云南农业大学学报 自然科学 2022 37 6 940 948 DOI 10 12101 j issn 1004 390X n 202203015 甘肃省定西市芹菜根腐病发生及 病原优势种类分析 张 敏1 罗 宁1 陈爱昌2 李焕宇3 刘永刚4 李惠霞1 石明明1 韩 变1 1 甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室 甘肃 兰州 730070 2 定西市植保植检站 甘肃 定西 743000 3 甘肃农业大学 植物保护学院 甘肃 兰州 730070 4 甘肃省农业科学院 植物保护研究所 甘肃 兰州 730070 摘要 目的 明确甘肃省定西市芹菜根腐病的发生情况和病原菌种类 为田间防治提供理论依据 方法 在 定西市8个乡镇进行调查 采集根腐病样 经组织和单孢分离获得纯化菌株 采用形态学结合rDNA ITS与 TEF 1 基因序列鉴定病原 按照柯赫氏法则测定其致病性 结果 定西市芹菜根腐病病田率为63 54 病 株率为24 45 其田间症状包括茎基部缢缩腐烂以及主根下部腐烂或维管束变色2种类型 分离纯化得到 78株镰孢菌 Fusarium spp 包括尖孢镰孢菌 F oxysporum 62株 锐顶镰孢菌 F acuminatum 11株和茄病 镰孢菌 F solani 5株 其分离频率分别为79 49 14 10 和6 41 经致病性测定 尖孢镰孢菌 茄病镰 孢菌与锐顶镰孢菌的病情指数分别为78 33 24 44和11 11 结论 尖孢镰孢菌是定西市芹菜根腐病的优势 病原菌 且致病性最强 茄病镰孢菌与锐顶镰孢菌的致病性较弱 其中 锐顶镰孢菌引起芹菜根腐病为国内 首次报道 关键词 尖孢镰孢菌 茄病镰孢菌 锐顶镰孢菌 致病性 定西市 中图分类号 S436 36 文献标志码 A 文章编号 1004 390X 2022 06 0940 09 Occurrence and Pathogen Dominant Species of Celery Root Rot in Dingxi City Gansu Province ZHANG Min1 LUO Ning1 CHEN Aichang2 LI Huanyu3 LIU Yonggang4 LI Huixia1 SHI Mingming1 HAN Bian1 1 Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Disease and Pest of Gansu Province Lanzhou 730070 China 2 Dingxi Station of Plant Protection and Quarantine Dingxi 743000 China 3 College of Plant Protection Gansu Agricultural University Lanzhou 730070 China 4 Institute of Plant Protection Gansu Academy of Agricultural Sciences Lanzhou 730070 China Abstract Purpose To define the occurrence and identify the pathogens of celery root rot in Dingxi City Gansu Province providing theoretical basis for field control s A survey and collection of samples were conducted in eight villages in Dingxi City Pathogens of celery root rot were isolated by tissue separation and purified by single spore and identified by morphological char acteristic and molecular s including sequence alignment of rDNA ITS and the translation 云南农业大学学报 自然科学 2022 37 6 940 948 Journal of Yunnan Agricultural University Natural Science E mail ynauzkxb 收稿日期 2022 03 09 修回日期 2022 08 16 网络首发日期 2022 11 17 基金项目 国家重点研发计划子课题 2018YFC1706301 5 甘肃省中药材产业技术体系 GARS ZYC 4 作者简介 张敏 1997 女 云南昭通人 在读硕士研究生 主要从事植物病原菌真菌学研究 E mail 626130949 通信作者 Corresponding author 李惠霞 1972 女 甘肃秦安人 博士 教授 主要从事植物病原线虫 学研究 E mail lihx 网络首发地址 elongation factor 1 gene TEF 1 The pathogenicity of isolates was tested according to Koch s pos tulates Results The rate of diseased fields and occurrence of celery root rot in Dingxi were 63 54 and 24 45 respectively Two symptoms of celery root rot disease were observed including basal stem rot with constriction and lower taproot rot or vascular discoloration A total of 78 strains of genus Fusarium spp were obtained including 62 strains of F oxysporum 11 strains of F acumina tum and five strains of F solani and the isolation frequencies of them were 79 49 14 10 and 6 41 respectively As measured by pathogenicity the disease inds of F oxysporum F solani and F acuminatum were 78 33 24 44 and 11 11 respectively Conclusion F oxysporum is the dominant pathogen with highest virulence of celery root rot in Dingxi City F solani and F acumin atum are weaker and this is the first report that F acuminatum can infect celery root rot in China Keywords Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium acuminatum pathogenicity Dingxi City 芹菜 Apium graveolens L 为伞形科 Umbel liferae 芹属 Apium 植物 在中国种植历史悠 久 种植范围广泛 是一种药食同源的植物 由 于其富含蛋白质 B族维生素 胡萝卜素和碳水 化合物等 1 在临床应用和保健类食品开发方面 有广阔的应用前景 2 芹菜是甘肃外销的主要高 原夏菜种类之一 种植面积逐年扩大 2020年 定西市芹菜种植面积达1 5万hm2 每667 m2产 量达7 9 t 经济效益显著 3 根腐病在苗期可导致芹菜大面积死苗 在生 长期造成根部腐烂死亡 在内蒙古 芹菜根腐病 一般种植田发病轻时造成20 30 的产量损 失 发病重时损失可达60 80 甚至绝收 4 芹菜根腐由多种病原菌引起 5 不同地区病原种 类和优势致病菌均有差异 其主要病原之一的镰 孢菌 Fusarium spp 是一种世界性分布的真菌 可侵染瓜果 蔬菜 6 中药 7 粮食作物 8 和牧 草 9 等多种植物 引起根腐 茎基腐和花穗腐 等多种病害 镰孢菌有多种专化型 不同专化型 引起的症状也不尽相同 在培养过程中存在多型 性和易变性 是真菌界最难准确鉴定的病原菌 之一 10 甘肃省定西市作为中国高原夏菜主产地之 一 芹菜根腐病一般田块发病率为10 30 严重地块高达90 以上 可造成不同程度的产量 损失 重度田块甚至绝收 11 近年来 随着市场 需求量增加 芹菜种植面积不断扩大 连作现象 普遍发生 导致芹菜根腐病愈加严重 目前 关 于甘肃省芹菜根腐病研究较少 引起芹菜根腐病 发生的病原菌种类尚不清楚 为明确该地区芹菜 根腐病病原种类 本研究对定西市芹菜根腐病进 行调查 鉴定病原菌种类 以明确防治靶标 为 该地区芹菜根腐病的有效防控提供理论依据 1 材料与方法 1 1 材料 供试材料 2020 2021年 在甘肃省定西市 安定区和陇西县采集芹菜根腐病样 致病性测定 的供试芹菜品种为凯尔文 由甘肃省定西市植保 植检站提供 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDA 水琼脂培养基 WA 和康乃馨叶片水琼 脂培养基 CLA PDA由马铃薯200 g 葡萄糖 20 g 琼脂15 g和蒸馏水1 L制备而成 WA由 琼脂15 g和蒸馏水1 L制备而成 CLA的制备 先加入10 15片灭菌的康乃馨叶片 3 4 mm2 再加入琼脂15 g和蒸馏水1 L 供试试剂 植物基因组DNA提取试剂盒 琼脂糖 Marker ddH2O PCR mastermix 无水 乙醇 葡萄糖 核酸染料和琼脂粉均购自北京擎 科生物技术有限公司 1 2 试验方法 1 2 1 芹菜根腐病发生情况调查 2021年4 8月 于定西市安定区凤翔镇 内官镇 符川镇 团结镇 巉口镇 鲁家沟镇和 西巩驿镇以及陇西县马河镇共8个镇的芹菜种植 地进行随机取样 统计病田率和病株率 采集病 样 带回实验室进行分离鉴定 第 6 期张 敏 等 甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析941 1 2 2 芹菜根腐病病原菌的分离纯化 采用组织分离法 12 分离芹菜根腐病病原物 从根部和茎基部病健交界处剪取长约0 5 cm的 根 用75 乙醇浸泡30 s 无菌水冲洗3次后在 灭菌滤纸上吸干 置于PDA平板上 于 25 1 培养箱中培养 3 4 d后 将病样组织上长出的 菌丝转接到另一个PDA平板上 采用改良的单 孢分离法 13 纯化病原菌 将孢子悬浮液稀释后 用无菌针头转移至WA培养基上 置于 25 1 培养箱中培养 12 h后 用无菌针头将萌发孢子 挑出 进一步纯化培养 7 d后 将病原菌转至 1 8 mL冻存管 存放于4 冰箱 备用 1 2 3 芹菜根腐病病原菌的形态学鉴定 将纯化后的病原菌接种于PDA培养基上 置于 25 1 下暗培养 培4 d时测量菌落直 径 7 d后观察其在PDA培养基上的菌丝形状和 色素产生情况等特征 并拍照记录 将纯化的菌 株接种至CLA培养基上 诱导产生分生孢子 15 d后于显微镜下观察分生孢子形态 参考LES LIE等 14 和王拱辰等 15 的方法进行形态学鉴定 1 2 4 芹菜根腐病病原菌的分子生物学鉴定 1 病原菌DNA提取 采用植物真菌基因组DNA试剂盒提取病原 菌DNA 试验步骤参照试剂盒说明书 根据形 态学鉴定结果 每种菌选取3株代表菌株活化培 养 7 d后提取菌株DNA 提取的DNA模板于 20 保存 备用 2 PCR引物的选择 利用rDNA ITS序列引物ITS1和ITS4以及 翻译延长因子TEF 1 序列引物EF 1H和EF 2T 表1 进行PCR扩增 引物委托擎科生物技术有 限公司 西安 合成 3 目的基因的扩增及系统发育分析 扩增体系25 L 包括 PCR Taq Mix 13 L ddH2O 6 L 上 下游引物各2 L DNA 2 L 扩增条件 94 预变性3 min 94 变性30 s 52 退火30 s 72 延伸30 s 共35个循环 72 延伸10 min 4 保存 以ddH2O为阴性对 照 扩增产物在1 0 琼脂糖凝胶上电泳30 min 于凝胶成像系统中确认目的片段后 将PCR产物 送至擎科生物技术有限公司 西安 进行基因测 序 测序结果在NCBI GenBank https blast ncbi nlm nih gov 数据库中进行同源性检索 下载与 目标序列相似度99 以上的序列 使用BioEdit 7 0 5进行比对分析 使用MEGA 6 06构建系统 发育树 1 2 5 病原菌致病性的测定 于2021年7月 在智能人工气候箱内进行 致病性测定 试验采用根部刺伤接种法接种 于 PDA培养7 d后 加无菌水洗脱孢子 制成孢子 密度为1 106 mL 1的悬浮液 16 待芹菜长至4 5叶时 用无菌针头刺伤芹菜主根 每株芹菜注 入孢子悬浮液10 mL 以等量无菌水作为对照 2周后观察发病情况 分离发病植株病原物 提 取病原菌DNA 扩增后测序进行鉴定 1 3 数据分析 试验数据采用Excel 2007与SPSS 19 0软件 进行统计分析 应用Duncan氏新复极差法进行 差异显著性检验 2 结果与分析 2 1 芹菜根腐病田间症状及发病情况 2 1 1 田间症状 根腐病致使芹菜长势不良 图1a 达不到商 用标准 或导致根部腐烂 植株大面积死亡 引起 田间缺苗断垄 图1b 调查发现芹菜根腐病有 2种症状 1 植株茎基部出现褐色水渍状病斑 茎基部缢缩 病斑由外向内侵入维管束 图1c 2 发病始于根尖 病斑自下而上延伸 整个主 根腐烂坏死 病原菌继续向上侵染新叶与茎秆 表 1 芹菜根腐病鉴定所用引物序列 Tab 1 Primer sequence for identification of celery root rot 基因 gene 引物 primer 序列 5 3 sequence 目的片段长度 bp target fragment length rDNA ITS ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 750 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC TEF 1 EF 1H ATGGGTAAGGAGGACAAGAC 700 EF 2T GGAAGTACCAGTGATCATGTT 942云南农业大学学报第 37 卷 直至死亡 或芹菜主根部分腐烂 未腐烂处增生 大量须根 但长势较矮小或下部叶片偏黄 部分 芹菜出现维管束变色 空心 图1d f 2 1 2 发病情况 共调查139个芹菜种植地 除陇西县马河镇 陇海线旁1个田块未发病外 其余调查地块均有 根腐病发生 平均病田率为63 54 但各地发病 率存在差异 由表2可知 田块病株率在0 67 50 之间 平均每个地块病株率为24 45 马河镇化家川的病株率最高 为67 50 发病最 普遍 西巩驿南河仅次于马河镇化家川 病株率 为48 75 内官镇万崖村与团结镇马家寺村的病 株率最低 表 2 定西市芹菜产区根腐病发生情况调查 Tab 2 Investigation of root rot disease in celery of Dingxi City 采样地 sampling site 病田率 diseased field rate 病株率 diseased plant rate 团结镇 Tuanjie Town 马家寺村 Majiasi Village 25 00 25 00 bc 8 25 8 25 bc 唐家堡 Tangjiabu 45 83 20 84 bc 23 45 8 84 bc 东坡村 Dongpo Village 25 00 25 00 bc 17 50 17 50 bc 马河镇 Mahe Town 陇海线 Longhaixian 0 00 0 00 c 0 00 0 00 c 化家川 Huajiachuan 100 00 0 00 a 67 50 11 09 a 巉口镇 Chankou Town 东川村 Dongchuan Village 100 00 0 00 a 27 29 4 69 abc 赵家卜村 Zhaojiabo Village 100 00 0 00 a 35 00 8 66 abc 西巩驿镇 Xigongyi Town 营房村 Yingfang Village 100 00 0 00 a 21 25 9 66 bc 南河 Nanhe 100 00 0 00 a 48 75 21 83 ab 鲁家沟镇 Lujiagou Town小岔口村 Xiaochakou Village 100 00 0 00 a 30 00 15 68 abc 凤翔镇 Fengxiang Town 红土坡 Hongtupo 75 00 25 00 ab 22 5 10 30 bc 苏家湾村 Sujiawan Village 53 80 15 11 ab 12 00 3 67 bc 内官镇 Neiguan Town万崖村 Wanya Village 25 00 25 00 bc 8 33 8 33 bc 符川镇 Fuchuan Town高阳村 Gaoyang Village 39 98 20 19 bc 34 50 22 59 abc 注 表中数据为 平均值 标准误 不同小写字母表示在0 05水平差异显著 Note Data used by mean SE different lowercase letters indicate significant difference at 0 05 level a 1 2 3 4 c d e f b 注 a 发病芹菜 1 2 3 与健康 4 芹菜 b 田间症状 c 茎基部缢缩腐烂 d 下部主根腐烂 e 和f 茎基部维管束变色 Note a diseased 1 2 3 and healthy 4 celery b field symptoms c stem base rot with constriction d lower taproot rot e and f vascular bundle of stem discolor 图 1 定西市芹菜根腐病田间症状 Fig 1 Field symptoms of celery root rot in Dingxi City 第 6 期张 敏 等 甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析943 2 2 芹菜根腐病真菌的分离和形态观察 经组织分离和纯化 从定西市芹菜主要种植 区采集的病样中获得78株镰孢菌 Fusarium spp 菌株 根据菌落形态 菌丝生长状态 色素颜色 和孢子形态 将78株镰孢菌初步分为19组 每 组类型选取1株代表菌株 用于形态学与分子生 物学鉴定 2 2 1 芹菜根腐病原菌形态学鉴定 代表菌株C33的形态特征见图2 菌株在 PDA上培养时易发生突变 部分菌株不产生气生 菌丝 产生 湿 状菌丝体 中心呈浅紫色 边缘 白色 培养4 d后 菌落直径为45 00 48 00 mm 背面中间为浅紫色 边缘为白色 基物不变色 气生菌丝呈棉絮状 颜色为淡紫色到白色 大分 生孢子数量少 月牙形稍弯 多数3隔 向两端 逐渐均匀变尖 大小为11 18 27 60 m 3 83 3 96 m 小分生孢子数量多 圆形或卵圆形 假 头状着生在分生孢子梗上 大小为6 14 10 42 m 2 35 3 58 m 厚垣孢子易产生 单生对生或串 生 球形 一般位于气生菌丝末端或中间 依据 上述形态特征 将编号为C33 B4 B16 C8 C16 C29 B1和D4的菌株归为一种 初步鉴 定为尖孢镰孢菌 F oxysporum 代表菌株A11的形态特征见图3 在PDA 平板上培养4 d后 菌落直径为43 50 56 50 mm 分布均匀 菌丝茂密且致密 气生菌丝白色棉絮 状 菌落背面白色 基物不变色 菌丝光滑有隔膜 分枝 大分生孢子为无色镰刀型 较宽 粗壮 直 10 m e f b c d a 10 m 10 m 10 m 10 m 注 a 培养菌株正面 左 和背面 右 的形态 下同 b 大分生孢子 c 小分生孢子 d 和e 厚垣孢子 f 大分生孢子产孢结构 Note a frontage left and backside right morphology of cultured strain the same as below b macroconidium c microconidium d and e chlamy dospores f conidiogenous cell of macroconidium 图 2 尖孢镰孢菌培养性状与形态特征 Fig 2 Culture and morphological characteristics of Fusarium oxysporum 5 m 10 m 10 m 20 m 10 m 10 m b a e f g c d 注 b 小分生孢子 c 大分生孢子 d 分生孢子座 e 厚垣孢子 f 和g 小 大分生孢子产孢结构 Note b microconidium c macroconidium d sporodochidium e chlamydospores f and g conidiogenous cell of micro conidium macroconidium 图 3 茄病镰孢菌培养性状与形态特征 Fig 3 Culture and morphological characteristics of F solani 944云南农业大学学报第 37 卷 或弯曲 0 4隔膜 多数3个隔膜 顶端细胞钝圆 形 有的基胞有足跟 有的几乎圆柱形 大分生孢 子通过分生孢子座产生 大小为24 93 35 56 m 3 72 4 63 m 单瓶梗产孢 小分生孢子卵圆形 椭圆形或肾形 有隔或无隔 大小为6 45 9 34 m 2 42 3 56 m 厚垣孢子单生或串生 多在菌丝中 间或短的侧枝上形成 无色 壁厚 依据上述形 态特征 将编号为A11 D16 D17和A7的菌株 归为一种 初步鉴定为茄病镰孢菌 F solani 代表菌株D8的形态特征见图4 在PDA上 培养4 d后 菌落直径为29 50 30 00 mm 初期 菌落边缘白色 气生菌丝棉絮状桃红色 生长后 期菌落从中间开始变黄 菌落中间有明显的黄色 同心轮纹 从菌落边缘到中间桃红色逐渐加深 PDA上未观察到大分生孢子 CLA上大分生孢 子弯曲呈纺锤状 顶胞渐细 基胞足跟明显 1 4 个隔膜 大小为12 43 19 85 m 2 62 4 33 m 单瓶梗产孢 小分生孢子椭圆形或卵圆形 0 1 个隔膜 大小为8 09 14 03 m 2 23 3 11 m 厚垣孢子球形单生 对生或串生 依据上述形态 特征 将标号为A1 A2 A5 A6 A9 A12和 D8的菌株归为一种 初步鉴定为锐顶镰孢菌 F acuminatum 2 2 2 芹菜根腐病原菌代表菌株的分子生物学鉴定 1 rDNA ITS序列分析 采用通用引物ITS1 ITS4扩增后 获得大小 约为700 bp的片段 经NCBI比对和MEGA系 统发育树 图5 分析可知 19个株菌聚为3类 第 I类包括菌株B1 B4 B16 C8 C16 C29 C33 和D4 与尖孢镰孢菌的遗传距离为0 置信度 为99 与形态鉴定结果一致 将其鉴定为尖孢 镰孢菌 第II类包括菌株A7 A11 D17和D16 该类与茄病镰孢菌遗传距离为0 置信度为99 与形态鉴定结果一致 将其鉴定为茄病镰孢菌 第III类包括菌株A1 A2 A5 A6 A9 A12 和D8 该类与锐顶镰孢菌遗传距离为0 置信度 为99 与形态鉴定结果一致 将其鉴定锐顶镰 孢菌 2 EF 1 序列分析 基于EF 1 序列的系统发育树 图6 与rDNA ITS序列分析结果相似 将病原菌聚为3类 第 1类包括菌株C8 C16 C29和C33等 这些代 表菌株与尖孢镰孢菌聚为1个分支 与形态鉴定 结果一致 将其鉴定为尖孢镰孢菌 第2类包括 菌株D8 A2 A6和A9等 与锐顶镰孢菌聚在 一起 与初步形态鉴定结果相符 将其鉴定为锐 顶镰孢菌 第3类包括菌株D16 D17和A11 等 该类与茄病镰孢菌聚为1个分支 与形态鉴 定结果一致 将其鉴定为茄病镰孢菌 结合形态学和分子生物学鉴定 分离纯化得 到的78株镰孢菌中 有尖孢镰孢菌62株 锐顶 10 m b c a d e 10 m 10 m 20 m 注 b 和d 厚垣孢子 c 大分生孢子 e 小分生孢子产孢结构 Note b and d chlamydospores c macroconidium e conidiogenous cell of conidium 图 4 锐顶镰孢菌培养性状与形态特征 Fig 4 Culture and morphological characteristics of F acuminatum 第 6 期张 敏 等 甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析945 镰孢菌11株和茄病镰孢菌5株 分离频率分别 为79 49 14 10 和6 41 2 3 芹菜根腐病分离物的致病性测定 分别将尖孢镰孢菌 锐顶镰孢菌和茄病镰孢 菌3种病原菌代表菌株接种至健康芹菜植株上 7 d 后尖孢镰孢菌最先从茎基部发病 其他菌株14 d 后才出现病症 从发病植株部位分离到病原菌 纯化培养后 经形态鉴定与分子鉴定确定该病原 菌与接种病原菌一致 表明这3种菌均为定西市 田间芹菜根腐病致病菌 尖孢镰孢菌致病性最强 发病情况最严重 发病率为91 66 病情指数为78 33 茄病镰孢 菌发病率为77 78 病情指数为24 44 症状表 现为茎基部腐烂或主根下部腐烂 植株萎蔫 锐 顶镰孢菌发病率为22 22 病情指数为11 11 多表现为茎基部维管束中间出现病斑 植株矮 小 须根增多 尖孢镰孢菌在田间能引起芹菜根 与茎基部腐烂 盆栽中芹菜也出现该症状 植株 枯死 盆栽试验与大田症状相符 锐顶镰孢菌在 田间引起芹菜根部腐烂 盆栽试验与田间症状相 比发病较轻 茄病镰孢菌在田间能引起根与芹菜 茎基部发病 盆栽试验发病与田间症状相符 图7 试验结果表明 尖孢镰孢菌致病性最强 是甘肃 省定西市芹菜种植地优势病原菌 3 讨论 镰孢菌类根腐病是一类重要的真菌性病害 可危害马铃薯 17 苜蓿 9 青稞 18 缸豆 19 棉 花 20 和芹菜 5 等作物 由镰孢菌引起的根腐病在 芹菜苗期与生长期均可发生 是全周期型病害 本研究利用形态学方法与分子生物学方法 将引 起甘肃省定西市芹菜根腐病的病原菌鉴定为尖孢 镰孢菌 茄病镰孢菌和锐顶镰孢菌 明确了甘肃 省芹菜根腐病病原种类 并首次发现锐顶镰孢菌 能引起芹菜根腐病 尖孢镰孢菌从茎基部 根和 茎基部维管束分离得到 茄病镰孢菌主要分离自 茎基部和根 锐顶镰孢菌在根 茎基部与茎秆处 均可分离到 尖孢镰孢菌分离频率最高 盆栽试 验发病也最严重 表明尖孢镰孢菌是定西市芹菜 根腐病的优势病原 不同地区芹菜根腐病原菌有差异 王玲娜 21 报道内蒙古芹菜根腐致病菌包括接骨木镰孢菌 F sambucinum 链格孢 Alternaria alternata 尖孢镰刀萎蔫专化型 F oxysporum f sp Vasin fectum 芬芳镰孢菌 F redolen 黄瓜萎蔫病菌 Plectosphaerella cucumerina 和尖孢镰孢菌 F oxysporum 扈顺等 4 在内蒙古商都的西芹根腐病 A2 A5Fusarium acuminatum MT525360 Fusarium acuminatum MT974003 A12 Fusarium acuminatum KF887088 A1 D8Fusarium acuminatum MF523230 A9A6 Fusarium acuminatum LC543657 B4Fusarium oxysporum MN856370 B16Fusarium oxysporum MT529295 D4B1 C16C29 C33C8 D16 Fusarium solani MK367751 A11 Fusarium solani MN013857 D17 Fusarium solani JF311928 A7 Plectosphaerella cucumerina EU594566 99 99 67 99 0 050 图 5 基于rDNA ITS序列构建3种病原菌与 相关菌株的系统发育树 Fig 5 Phylogenetic tree of three pathogens and other re lated strains based on the rDNA ITS sequence C8 Fusarium oxysporum JQ965439 C33 C29 Fusarium oxysporum MN417192 C16 D4 B1 B4 B16 Fusarium oxysporum MW362041 Fusarium oxysporum JF740855 Fusarium oxysporum MK968952 A1 Fusarium acuminatum MH025841 A2 Fusarium acuminatum MG826892 A5 A6 A9 Fusarium acuminatum JX397865 Fusarium acuminatum MG826875 A12 D8 Fusarium acuminatum KY365617 Fusarium acuminatum KY081594 A11 D16 D17 A7Fusarium solani KX094911 Fusicolla aquaeductuum KM231406 73 99 96 95 57 91 0 2 Fusarium solani MN977917 图 6 基于EF 1 序列构建3种病原菌与 相关菌株的系统发育树 Fig 6 Phylogenetic tree of three pathogens and other re lated strains based on the EF 1 sequence 946云南农业大学学报第 37 卷 样分离出茄病镰孢菌 F solani 郝永娟等 22 发现 天津芹菜的主要致病菌为茄病镰孢菌 石延霞等 23 和晋知文 24 调查发现 北京地区芹菜根腐病主要 病原是茄病镰孢菌 侧雄腐霉菌 Pythium paroe candrum 核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 胡 萝卜软腐果胶杆菌 Pectobacterium carotovorum 王国荣等 25 报道引起浙江省芹菜茎基腐病的病原 菌为尖孢镰刀菌 各地病原菌的差异可能与作物 品种和种植环境有关 镰孢菌的形态复杂 在生长过程中形态变异 较大 形态鉴定很难准确地将其鉴定到种 26 研 究发现 ITS mtSSU 微管蛋白和TEF 1 能 准确鉴定镰孢菌 19 ITS被广泛运用于真菌鉴 定 但对于镰孢菌亲缘关系较近的种或复合种 ITS单一基因片段区分度不高 很难准确鉴定 因此 需挖掘更多的基因片段或多基因联合才能 准确地鉴定 26 TEF 1 基因因其位点核苷酸的替 换率高 对亲缘关系较近的镰孢菌有较高分辨 力 常作为镰孢菌属真菌鉴定的有效方法 27 如 张祥丽等 28 通过ITS与TEF 1 基因鉴定出 铁皮石斛镰刀菌根腐病病原菌为变红 木贼镰刀 菌复合种群 F incarnatum equiseti species com plex 李雪萍等 10 利用TEF 1 基因鉴定青稞根 腐病病菌为尖孢镰孢菌 木贼镰孢菌 F equiseti 与锐顶镰孢菌 本研究在形态学观察的基础上 通过分子生物学手段选择特异基因片段ITS与 TEF 1 序列对芹菜根腐病病原菌进行鉴定 结果 更加准确 可靠 从茎基部发病的芹菜植株在短时间内死亡 从主根发病的芹菜 植株须根化严重 芹菜勉强 生长 须根少的植株遇高温后出现萎蔫 发病后 期新长出的须根也会腐烂 最终导致芹菜心叶和 茎秆发病 须根化严重的芹菜没有主根或主根腐 烂 推测是芹菜须根充当主根为芹菜提供营养物 质 这可能是一种补偿作用 29 同一病株可分离 出多种病原菌 说明田间存在多种病原复合侵染 的现象 王家和等 30 发现 3种镰刀菌混合接种 可加重蚕豆枯萎病 姚天明等 31 证实尖孢镰刀菌 及欧文氏杆菌复合侵染可引起半夏腐烂 张德珍 等 32 研究表明 镰孢菌与多种病原菌复合侵染共 同导致小麦根腐病 由此推测 芹菜根腐病田间 可能存在复合侵染 从而加重发病 对于复合侵 染病菌的种类和侵染程度还需进一步开展研究 4 结论 定西市芹菜根腐病病田率为63 54 病株率 为24 45 田间发病有2种症状 分别是芹菜主 根腐烂和茎基部缢缩腐烂 分离纯化得到78株 镰孢菌 其中尖孢镰孢菌 F oxysporum 锐顶 镰孢菌 F acuminatum 和茄病镰孢菌 F solani 的分离频率分别为79 49 14 10 和6 41 尖 孢镰孢菌的致病性最强 是定西市芹菜根腐病的 优势病原菌 锐顶镰孢菌引起芹菜根腐病为国内 首次报道 参考文献 刘雄 马腾 高建德 等 芹菜药用价值研究进展 J 甘 1 CK 尖孢镰孢菌 F oxysporum 茄病镰孢菌 F solani 锐顶镰孢菌 F acuminatum 图 7 3种镰孢菌对芹菜幼苗的致病性测定 Fig 7 Pathogenicity test of three kinds of Fusarium spp on celery seedling 第 6 期张 敏 等 甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析947 肃中医学院学报 2015 32 2 74 CHEEPTHAM N TOWERS G H N Light mediated activities of some Thai medicinal plant teas J Fitoter apia 2002 73 7 8 651 DOI 10 1016 S0367 326X 02 00224 1 2 杨海兴 张晶 李强 等 兰州高原夏菜芹菜标准化栽培 技术 J 中国蔬菜 2019 1 92 3 扈顺 高婧 王勇 等 西芹根腐病病原菌的分离与鉴 定 J 北方农业学报 2019 47 5 65 DOI 10 3969 j issn 2096 1197 2019 05 12 4 张悦丽 张博 马立国 等 芹菜根茎腐病病原鉴定 J 植物保护学报 2017 44 2 347 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2017 2016144 5 耿丽华 宫国义 宋顺华 等 西瓜种传枯萎病病原菌鉴 定及其防控方法 J 植物保护学报 2019 46 2 330 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2019 2017215 6 曹雪梅 李生兵 张惠玲 等 甘草根腐病病原菌鉴 定 J 植物病理学报 2014 44 2 213 DOI 10 3969 j issn 1672 6820 2017 02 002 7 BIENAPFL J C MALVICK D K PERCICH J A J P D Fir