八仙花萼片有色原生质体游离及应用.pdf

中国农业科技导报 2022 24 9 50 57 JournalofAgriculturalScienceandTechnology 八仙花萼片有色原生质体游离及应用 张盖天 祁惠 杨锁宁 褚志云 袁素霞 刘春 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京100081 摘 要 为建立八仙花 Hydrangea macrophylla 有色原生质体游离体系 以八仙花萼片为试验材料 分别对材 料的预处理方式 酶液组分 酶解时间 纯化离心力等影响酶解的关键因素进行研究 结果表明 预处理方式 选择分离花萼片上下表皮法 纤维素酶和离析酶水平分别为4 和0 4 质量体积分数 甘露醇0 6mol L 1 酶解液加热冷却后加入0 1 质量体积分数 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 酶解2h 低温离心机4 1426r min 1 离心5min 为最优的八仙花萼片原生质体游离条件 利用所建的原生质体游离体系对4个不同品种的八仙花 萼片进行有色原生质体游离 200 镜下单视野内可获得13 35个有色的原生质体 对有色原生质体进行液泡 的H 流测定 发现蓝色液泡较粉色液泡H 流的外排趋势明显 说明同一八仙花品种蓝色液泡的pH高于粉色 液泡 关键词 八仙花 有色原生质体游离 液泡离子流 doi 10 13304 j nykjdb 2021 0372 中图分类号 S682 1 9 文献标志码 A 文章编号 1008 0864 2022 09 0050 08 Isolation and Application of Sepal Colored Protoplast in Hydrangea macrophylla ZHANGGaitian QIHui YANGSuoning CHUZhiyun YUANSuxia LIUChun InstituteofVegetablesandFlowers ChineseAcademyofAgriculturalSciences Beijing100081 China Abstract In order to establish isolation system of sepals colored protoplast in Hydrangea macrophylla sepals of Hydrangea macrophylla were used as experimental materials The factors influencing enzymolysis were analyzed suchastreatedsofsepals thecomponentsofenzymatichydrolysates enzymolysistime centrifugalspeeds etc Theresultsshowedthattheoptimalprocedureofenzymolysiswasfollowedwiththetoringepidermisofsepals 4 w v cellulase 0 4 w v macerozyme 0 6 mol L 1 mannitol and 0 1 w v BSA 10 mmol L 1 CaCl 2 enzymolysisfor2h and1426r min 1 centrifugeat4 Thissystemwasusedtoisolatesepalcoloredprotoplastof4 Hydrangea macrophylla cultivars and 13 35 protoplasts per microscope vision at 200 were obtained H flux measurementshowedthattheH effluxingtendencyofbluevacuoleswasmoreobviousthanthatofpinkvacuolesin thesamecultivar itindicatedthatpHinbluevacuoleswashigherthanthatinpinkvacuolesofsamecultivar Key words Hydrangea macrophylla coloredprotoplastisolation vacuoleionflux 八仙花 Hydrangea macrophylla 又名绣球花 为虎耳草科八仙花属植物 观赏部位为大部分不 孕花及其萼片组成的伞状顶生花序 1 原产于中 国 日本等国家 2 3 八仙花品种众多 花色丰富 花型繁多 在欧美地区被广泛应用于庭院绿化 切 花等 近年来 八仙花盆栽 切花和干花也受到越 来越多中国消费者的喜爱 八仙花具有特殊的栽培学特性 即在合适的 土壤pH条件下 部分品种施铝处理后花萼片颜色 会由原本的粉色变为蓝色 4 因此 八仙花花色变 收稿日期 2021 05 06 接受日期 2021 09 22 基金项目 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 IVF BRF2020021 中国农业科学院科技创新工程项目 CAAS ASTIP 2020 IVFCAAS 联系方式 张盖天E mail gaitianzhang 通信作者袁素霞E mail yuansuxia 刘春E mail liuchun 9期 张盖天等 八仙花萼片有色原生质体游离及应用 化机理逐渐成为研究热点 八仙花萼片有色细胞 主要集中于花萼片上表皮下部和叶肉细胞上部的 组织中 5 为方便对有色细胞独有的生理与分子 特性进行深入研究 揭示花器官有色细胞中特有 的膜结构 蛋白结构及功能 6 10 需将组织中的有 色细胞与无色细胞有效分离 因此 必需建立八仙 花萼片有色原生质体游离体系 原生质体是细胞 除去细胞壁后所得的由膜包裹的结构 包括膜结 构 液泡 细胞核 质体及线粒体等 其中 液泡是 植物储藏色素类物质的器官 成熟细胞的液泡体 积约占细胞体积的90 11 即在显微镜下观察到 的有色细胞液泡内含有色素类物质 而无色细胞 液泡内不含色素类物质 原生质体用途广泛 主要用于瞬时表达 如亚 细胞定位 12 原生质体融合 13 等 其游离受诸多因素 影响 主要包括植物组织材料类型 14 预处理方 式 12 酶浓度及配比 15 渗透压 16 酶解时间 17 和离心 力 18 等 目前 在拟南芥 Arabidopsisthaliana 19 和水 稻 Oryza sativa 20 中已建立了成熟的原生质体游离 体系 而关于八仙花有色原生质体游离体系的研 究尚未见报道 极大地限制了八仙花花色形成机理 的相关研究 因此 本研究拟建立高效的八仙花有 色细胞原生质体游离体系 并应用于不同品种八仙 花萼片的原生质体游离 以期为后续八仙花有色细 胞瞬时转化相关研究 细胞水平上的生理生化研究 以及单细胞测序奠定基础 1 材料与方法 1 1 供试材料 本研究选用种植于中国农业科学院试验基地 的4个八仙花 Hydrangea macrophylla 品种 Bailmer BabyBlue Bela 和 Duro 进行研究 所有材料均 选用盛花期萼片 其中 Bailmer BabyBlue 和 Bela 在不施铝栽培条件下花萼片呈粉色 施铝栽 培条件下花萼片呈蓝色 Duro 在施铝和不施铝栽 培条件下萼片颜色变化较小 基本均呈品红色 1 2 试剂和仪器 试 剂 纤 维 素 酶 cellulase 离 析 酶 macerozymeR 10 甘露醇 D mannitol 吗啉乙 磺酸 morpholineethylsulfonicacid MES 三羟甲 基氨基甲烷 Tris 牛血清蛋白 bovine serum albumin BSA KCl NaCl MgSO 4 7H 2 O 乙二醇双 2 氨基乙基醚 四乙酸 ethyleneglycoltetraacetic acid EGTA 和甘油 glycerol 购自于北京拜尔迪 生物技术有限公司 聚 L 赖氨酸 poly L lysine 购 自于西格玛奥德里奇贸易有限公司 CaCl2购自 于国药集团化学试剂有限公司 仪器 电子天平 BSM 220 4 上海卓精电子科 技有限公司 恒温震荡仪 MQT 60R 上海旻泉仪 器有限公司 离心机 BY 80C 北京白洋医疗器 械有限公司 低温离心机 1 14K Sigma 倒置显 微镜 DMIL LED Leica 非损伤微测仪 NMT YG 100 Younger 1 3 原生质体游离 取盛花期萼片0 8 1 0g 经预处理后 立即移 至含有10mL酶解液的离心管中 之后 将离心管 放置在恒温震荡仪 28 40r min 1 内进行酶解 待酶解后 将混合液置于200目筛网过滤残渣 所 得滤液倒入烧杯中 将所得滤液移至10mL离心管 中 并用改良后的W5洗液 19 154mmol L 1 NaCl 125mmol L 1 CaCl 2 5mmol L 1 KCl和4mmol L 1 MES TrispH6 3 灭菌 4 保存 轻柔冲洗滤网上 的残渣及烧杯 冲洗后的液体移入离心管中 2000r min 1 离心5min 弃上清 沉淀由W5洗液重 悬后移至1 5mL离心管中 低温 4 离心5min 弃上清 最后 用200 L储存液 5 将离心管中的沉 淀悬浮 4 保存 酶解液配制方法 将纤维素酶 离析酶 甘露醇和20mmol L 1 pH6 3的MES Tris 混匀后于55 水浴10min 待冷凉至室温后加入 0 1 质量体积比 BSA和10mol L 1 CaCl 2 储存液 配制方法 甘露醇 2mmol L 1 MgSO 4 10mmol L 1 KCl 20mmol L 1 MES Tris 5mmol L 1 EGTA pH 6 0 和2 质量体积分数 甘油 灭菌 4 保存 采用单因素试验设计 分别设置不同预处理方 式 酶浓度 酶解时间 甘露醇浓度 离心力 添加 BSA和CaCl 2 对原生质体游离体系和方法进行 优化 1 4 单因素实验 1 4 1 试验材料预处理方式 对试验材料采用 2种不同的预处理方式进行处理 分别为 花萼片 切丝法 花萼片上下表皮分离法 原生质体游离 所用的纤维素酶和离析酶浓度分别为4 和0 4 质量体积分数 甘露醇浓度为0 6mol L 1 酶解 时间2h 4 条件下1426r min 1 离心 储存液甘 51 中国农业科技导报 24卷 露醇浓度为0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 2 酶浓度 设置纤维素酶质量体积分数分别 为2 4 6 和8 离析酶的质量体积分数分别 为0 2 0 4 0 6 和0 8 试验材料预处理方式 采用花萼片上下表皮分离法 甘露醇0 6mol L 1 酶 解时间2h 4 条件下1426r min 1 离心5min 储存 液甘露醇0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 3 酶解时间 酶解时间设4个水平 分别为 1 2 3和4h 试验材料预处理方式采用花萼片上 下表皮分离法 纤维素酶与离析酶浓度质量体积 比分数分别为4 和0 4 甘露醇0 6mol L 1 4 条件下1426r min 1 离心5min 储存液甘露 醇0 6mol L 1 其余同1 3 1 4 4 甘露醇 对酶解液与储存液中的甘露醇分 别设0 4 0 6和0 8mol L 1 3个梯度 试验材料预处 理方式为花萼片上下表皮分离法 纤维素酶与离析 酶质量体积分数分别为4 和0 4 酶解时间2h 4 条件下1426r min 1 离心5min 其余同1 3 1 4 5 添加BSA和CaCl 2 酶与甘露醇融于含 20mmol L 1 MES Tris pH6 3 的溶液并水浴后 加入 0 1 质量体积分数 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 以不加BSA和CaCl 2 的酶解液为对照 试 验材料预处理方式均为花萼片上下表皮分离法 纤维素酶与离析酶质量体积分数分别为4 和 0 4 甘露醇0 6mol L 1 酶解时间2h 4 条件 下1426r min 1 离心5min 其余同1 3 1 4 6 离心力 在4 条件下 分别用1164 1426 1646和1841r min 1 离心5min 试验材 料预处理方式为花萼片上下表皮分离法 纤维素 酶与离析酶质量体积分数分别为4 和0 4 甘 露醇0 6mol L 1 酶解时间2h 其余同1 3 1 5 游离原生质体计数 使原生质体均匀悬浮后 分别制片3张 每张 滴30 L悬浮液后覆24mm 50mm盖玻片 镜检 拍照 分别从3张制片中选取9张镜检图并统计有 色原生质体数量 SPSS软件进行数据分析 Origin 2018软件进行绘图 1 6 液泡H 流测定 将牙签尖头部用少量脱脂棉包裹成拖把状 蘸取0 008 质量体积分数 聚 L 赖氨酸 21 涂抹 在一次性培养皿中 置于冰箱冷藏层晾干备用 使用特定检测H 流的离子交换液及质子选 择性微电极制作探针 液泡H 流测试液绘制H 流 测定标线 吸取部分原生质体悬浮液移至培养皿中 加 入特定液泡H 流测试液 避光条件下静置 使原 生质体在重力作用下下沉 根据阴阳离子互作原 理 聚 L 赖氨酸涂层吸附住原生质体 保证非损 伤微测仪质子选择性微电极在运行过程中不 移动 分别随机选取 BabyBlue 粉色 蓝色原生质 体各7个 将探针置于靠近液泡的位置 对其液泡 H Na 流进行测定并绘制相应测定曲线 导出曲 线相应读数 SPSS软件进行数据分析 Origin2018 软件进行绘图 2 结果与分析 2 1 单因素对有色原生质体酶解的影响 2 1 1 材料预处理方式对有色原生质体游离效率 的影响 对 Bailmer 和 BabyBlue 的粉色和蓝 色花萼片分别采用切丝和上下表皮分离法进行处 理 结果表明 相较于切丝法 萼片上下表皮分离 法更能高效地游离4种花萼片的有色原生质体 图1A 每个视野分别获得有色原生质体11 14 个 Bailmer 和17 22个 BabyBlue 2 1 2 不同酶含量对有色原生质体游离效率的影 响 由图1B可知 当纤维素酶与离析酶质量体积 分数分别为4 和0 4 时 4份材料所获得的有 色原生质体数量 每个视野 均显著高于其他含量 组合 因此 4 和0 4 为纤维素酶与离析酶最 佳酶解含量 2 1 3 不同酶解时间对有色原生质体游离效率的 影响 不同的酶解时长的结果 图1C 表明 对 Bailmer 蓝色和粉色萼片来说 酶解2h获得有 色原生质体的数量均显著高于酶解1 3和4h 而 对于 BabyBlue 蓝色和粉色萼片 酶解1和2h 所得有色原生质体的数量无明显差异 但均显著 高于酶解3和4h 综合考虑 2h为最适酶解 时长 2 1 4 不同甘露醇浓度对有色原生质体游离效率 的影响 对酶解液与储存液中甘露醇的不同浓度 进行比较 结果 图1D 表明 当甘露醇浓度为 0 6mol L 1 时 其渗透压最适合有色原生质体的 解离与储存 52 9期 张盖天等 八仙花萼片有色原生质体游离及应用 2 1 5 添加BSA和CaCl 2 对有色原生质体游离效 率的影响 由于前4组酶解离条件筛选试验中 同一八仙花品种不同颜色萼片的有色原生质体游 离结果表现趋势一致 故本试验只选用了 Bailmer 蓝色萼片和 BabyBlue 粉色萼片为试 验材料 结果 图1E 显示 在酶解液中添加 0 1 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 后 Bailmer 蓝色 萼片所得有色原生质体的数量与对照差异不显 著 但 BabyBlue 粉色萼片在添加0 1 BSA和 10mmol L 1 CaCl 2 后 酶解液中所得有色原生质 体的数量显著高于对照 综合考虑 在酶解液中 添加0 1 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 效果较好 2 1 6 不同离心力对有色原生质体游离效率的影 响 以 Bailmer 蓝色萼片和 BabyBlue 粉色萼 A 预处理方式 B 酶水平 C 酶解时长 D 甘露醇浓度 E 酶液组分 F 离心速率 不同小写字母表示不同处理间差异在P 0 05水平显 著 A Material handling B Enzymes concentration C Hydrolysis time D Mannitol concentration E Enzyme solution component F Centrifugalspeed differentlowercaselettersindicatesignificantdifferencesbetweendifferenttreatmentsat P 0 05level 图1 单因素对有色原生质体酶解的影响 Fig 1 Effectofsinglefoctoronenzymatichydrolysis 53 中国农业科技导报 24卷 片为材料 分析不同离心力下获得有色原生质 体数量的差异 结果 图1F 显示 4 条件下 1426r min 1 离心时获得有色原生质体的数量显 著高于其他3种离心速率 离心速率过低 不能 有效地沉淀有色原生质体 而离心速率过高会破 损有色原生质体 降低产量 上述研究表明 采用花萼片上下表皮分离 法 纤维素酶和离析酶的质量体积分数分别为 4 和 0 4 加入0 1 质量体积分数 BSA和 10 mmol L 1 CaCl 2 酶解时间2 h 4 条件下 1426r min 1 离心5min 甘露醇0 6mol L 1 为八 仙花萼片有色原生质体游离的最佳条件 2 2 八仙花萼片有色细胞原生质体酶解体系 应用 2 2 1 不同品种中酶解体系的应用 按上述最优 酶解体系对4个八仙花品种在施铝处理 Al 3 和 未施铝处理 CK 条件下的花萼片进行有色原生 质体游离 将原生质体悬浮均匀后制片 200 镜 下单视野内可获得13 35个有色的原生质 体 图2 图2 不同品种八仙花花器官及原生质体游离示意图 Bar 50 m Fig 2 Schematicdiagramoffloralorgansandprotoplastdissociationofdifferentspeciesof Hydrangea Bar 50 m 54 9期 张盖天等 八仙花萼片有色原生质体游离及应用 2 2 2 液泡H 离子流分析 使用非损伤微测技 术对八仙花品种 Babyblue 粉色 蓝色液泡的 H Na 流进行测定 结果 图3 表明 从H 流平均 值来看 蓝色液泡H 流外排趋势较粉色液泡更加 明显 由此推断 蓝色液泡的pH高于粉色液泡 从 Na 流平均值来看 蓝色液泡Na 流吸收趋势更为 明显 由此推断 H 在外流后 液泡吸收Na 来维 持液泡内部原有溶质含量 3 讨论 八仙花萼片酶解游离出的原生质体分为有色 原生质体与无色原生质体两种 其中 有色原生质 体是研究花色形成的重要研究对象 原生质体游 离的基础是酶解细胞壁释放原生质体 1960年 Cocking 22 首次利用从疣孢菌中获得的纤维素酶 以番茄根系为材料游离出了原生质体 这也是酶 解法游离原生质体在植物上的首次应用 随后从 木霉素中提取出纤维素酶 这也是后续大量原生 质体游离试验中使用频率最高的酶 23 酶解游离 原生质体越来越广泛地应用于不同物种 本研究发现 八仙花萼片原生质体游离的数量 少于其他植物叶片 嫩茎和愈伤组织产生的原生质 体数量 这可能是由组织材料的差异造成 酶解液 更容易浸入疏松的组织 充分与细胞壁接触 断开 纤维链并消解果胶 Yoo等 19 对拟南芥叶片原生质 体游离时发现 酶解材料切丝时应避免挤压损伤 因为挤压会造成原生质体在细胞壁构筑的小室内 破裂 然而 八仙花萼片组织质密 韧性强 如果对 萼片采用切丝的预处理方法 会在创口处留下明显 的挤压损伤 导致其原生质体游离的难度增大 本 研究发现 采用分离上下表皮对八仙花萼片进行预 处理 能增加酶液与材料的接触面积 有利于打破 组织质密造成的酶解障碍 显著增加原生质体游离 的数量 在对不同品种八仙花萼片原生质体进行 游离时还发现 花萼片大且厚时 其上下表皮更易 分离 更有利于原生质体游离 为了高效地游离原生质体 必需配比合适比 例的酶 若酶用量过低 则酶消解细胞壁的能力 不足以支撑原生质体游离工作的完成 若酶用量 过高 则会造成原生质体失活 Yoshida等 5 在游 离八仙花萼片有色细胞原生质体时 采用的纤维 素酶与离析酶质量体积分数分别为2 和0 2 但本研究发现 纤维素酶与离析酶含量分别为4 和0 4 质量体积分数 时 酶解产生的有色原生 质体数量显著高于2 和0 2 纤维素酶与离析 酶水平 另外 BSA能够有效维持酶活 保障酶 解过程中酶功能的持续性 24 而Ca 2 能与磷脂类 注 正值为外排 负值为吸收 Note Positivuesareeffluxandnegativuesareinflux 图3 Babyblue 离子流 Fig 3 Babyblue ionflux 55 中国农业科技导报 24卷 物质上的负电荷结合维持细胞膜的稳定性 在一 定程度上保障原生质体的活性 因此 在酶液中加 入0 1 质量体积分数 BSA和10mmol L 1 CaCl 2 能获得更多的原生质体 25 此外 若酶解时间较 短 酶液无法与细胞壁充分反应 若酶解时间过 长 会拉长试验周期 原生质体会失活 因此 2h 为最优酶解时长 甘露醇浓度需匹配细胞渗透 压 细胞渗透压过小或过大均会造成原生质体活 性降低 甚至失活 前人研究 18 26 27 中甘露醇浓度 为0 4 1mol L 1 本研究结果表明 甘露醇浓度 为0 6mol L 1 时 八仙花有色原生质体游离效果 最佳 由于解离花萼片产生的原生质体数量较少 故 需在离心过程中获得尽可能多的原生质体 纯化 原生质体的方法主要有离心沉降法 18 与密度梯度 自然沉降法 28 离心速率较小或自然沉淀时 部分 原生质体会重悬于上清中 若离心速率过大 原生 质体会因受机械损伤而失活 甚至破裂 本研究表 明 4 条件下 最佳离心速率为1426r min 1 原生质体游离能有效地分离花萼中有色细胞 和无色细胞 以便于研究有色细胞的生理生化特 性 Yoshida等 5 使用质子选择微电极测得八仙花 蓝色液泡pH约为4 1 红色液泡约为3 2 本研究 中 Babyblue 蓝色原生质体液泡H 流外排 液 泡内H 积累减少 pH相对较高 粉色原生质体液 泡H 流吸收 液泡内H 积累增多 pH相对较低 与前人的研究结果一致 因此 本研究建立的有 色原生质体游离体系为后续八仙花花色形成机理 研究奠定了基础 参 考 文 献 1 GALOPIN G CODARIN S VIEMONT J D et al Architectural development of inflorescence in Hydrangea macrophylla cv Hermann Dienemann J Hortscience 2008 43 2 361 365 2 中国科学院中国植物志编辑委员会 中国植物志 第35卷第 1分册 M 北京 科学出版社 1995 35 226 3 ITO T AOKI D FUKUSHIMA K et al Direct mapping of hydrangea blue complex in sepal tissues of Hydrangea macrophylla J OL Sci Rep 2019 9 1 5450 2021 03 20 https doi org 10 1038 s41598 019 41968 7 4 SCHREIBERHD Curiouschemistryguides Hydrangeacolors J Am Sci 2014 102 6 444 450 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exchanger1participates in tobacco disease defence against Phytophthora parasitica var nicotianaebyaffectingvacuolarpHandprimingtheantioxidative system J J Exp Bot 2014 65 20 6107 6122 22 COCKINGEC Afortheisolationofplantprotoplasts andvacuoles J Nature 1960 187 962 963 23 COCKING E C Plant cell protoplasts isolation and development J Annu Rev PlantPhysiol 1972 23 29 50 24 王新明 王联结 于猛 牛血清蛋白对纤维素酶水解小麦秸秆 的影响 J 食品工业科技 2012 33 19 194 196 200 WANG X M WANG L J YU M Effect of bovine serum albumin on cellulase in hydrolysis of wheat straw J Sci Technol FoodInd 2012 33 19 194 196 200 25 张涛 仇运广 罗启超 等 钙离子和镁离子浓度变化对磷脂 酰乙醇胺 磷脂酰甘油双分子层膜的影响 J 物理化学学报 2019 35 8 840 849 ZHANGT QIUYG LUOQC etal Concentrationdependent effects of Ca 2 and Mg 2 on the phosphatidylethanolamine phosphatidylglycerolbilayer J ActaPhys Chim Sin 2019 35 8 840 849 26 ROBERTS ZOUHARJ CARTERC etal Isolationofintact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf derived protoplasts J Nat Protocols 2007 2 2 259 62 27 宋爱华 张文斌 孙姝兰 等 非洲菊原生质体游离及瞬时转 化系统的建立 J 植物学报 2017 52 4 511 519 SONG A H ZHANG W B SUN S L et al Preparation of protoplastandestablishmentoftransientexpressionsystemin Gerbera hybrid J Bull Bot 2017 52 4 511 519 28 段炼 钱君 郭小雨 等 一种快速高效的水稻原生质体制备 和转化方法的建立 J 植物生理学报 2014 50 3 351 357 DUAN L QIAN J GUO X Y et al A Rapid and efficient for isolation and transation of rice protoplast J PlantPhysiol Commun 2014 50 3 351 357 责任编辑 张冬玲 57