大花蕙兰'黄金小神童'胚性愈伤组织诱导及植株再生研究.pdf

Guihaia Apr 2022 42 4 682 690 http www guihaia DOI 10 11931 guihaia gxzw202007025 席银凯 杨武德 大花蕙兰 黄金小神童 胚性愈伤组织诱导及植株再生研究 J 广西植物 2022 42 4 682 690 XI YK YANG WD Embryogenic callus induction and plant regeneration of Cymbidium Golden Elf Sundust J Guihaia 2022 42 4 682 690 大花蕙兰 黄金小神童 胚性愈伤组织诱导及植株再生研究 席银凯 杨武德 贵州中医药大学化学教研室 贵阳550000 摘 要 为解决大花蕙兰园艺品种 黄金小神童 Cymbidium Golden Elf Sundust 人工繁育周期长 系数 低等问题 该研究以其侧芽茎尖为外植体 在1 2MS 1 0 mg L 1 NAA 50 g L 1香蕉泥 15 g L 1蔗糖 中培养60 d后 以获得的愈伤组织与原球茎混合物为材料 通过L9 3 4正交与完全组合实验研究不同因素 及组合对 黄金小神童 胚性愈伤组织和原球茎发生及增殖的影响 进而建立 黄金小神童 高效 稳定的丛 芽增殖和植株再生体系 结果表明 1 在MS 2 0 mg L 1 6 BA 150 mL L 1椰汁 20 g L 1蔗糖中 培 养70 d后增殖系数达8 13 同时可获得桑葚状原球茎团 2 原球茎团在MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA中培养70 d后 原球茎发育为幼芽 丛芽发生系数可达5 36 此时 将由原球茎诱导得到的簇 状丛芽转接至MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA中 以 芽繁芽 方式增殖 其增殖系数也达到 4 28 此时可建立起稳定的增殖体系 3 无菌苗生根则在MS 1 0 mg L 1 NAA 150 g L 1香蕉泥中进 行 培养60 d可得到具4 7片真叶 高度为8 10 cm的健壮生根苗 生根率达96 5 再生苗经露苗后移栽 到松树皮和山基土体积比为3 2的基质中 成活率在85 以上 通过愈伤组织与原球茎 胚性愈伤组织与 原球茎 原球茎 丛芽 再生植株途径最终建立了 黄金小神童 高效 稳定的丛芽快速繁殖体系 该研究结 果为进一步开展其人工繁育和遗传转化提供了实验依据 也为兰科其他物种的无性快速繁殖提供了参考 关键词 黄金小神童 胚性愈伤组织 原球茎 丛芽 侧芽茎尖 中图分类号 Q943 1 文献标识码 A 文章编号 1000 3142 2022 04 0682 09 Embryogenic callus induction and plant regeneration of Cymbidium Golden Elf Sundust XI Yinkai YANG Wude Chemistry Department Guizhou University of Traditional Chinese Medicine Guiyang 550000 China Abstract In order to solve the obstacle of a long artificial breeding cycle and low coefficient of Cymbidium Golden Elf Sundust the stem tip of the lateral bud was used as the explant for the initial culture in 1 2MS with 1 0 mg L 1 NAA 50 g L 1 banana puree and 15 g L 1 sucrose After 60 d culture the mixture of callus and protocorm was used as the materials for investigating the effects of different factors and combinations on the embryonic callus and protocorm occurrence proliferation via L9 3 4 orthogonal and complete combination experiments Finally an efficient and stable proliferation system of Cymbidium Golden Elf Sundust was established in the present study The results were as follows 1 Proliferation coefficient was 8 13 and the protocorm masses similar to mulberry could be obtained on the MS medium containing 2 0 mg L 1 6 BA 150 mL L 1 coconut juice and 20 g L 1 sucrose for 70 d 2 The protocorm 收稿日期 2020 09 10 基金项目 国家自然科学基金 81660647 一流中药学专业建设项目 黔高教发 2017 158号 Supported by National Natural Science Foundation of China 81660647 Construction of First Class Traditional Chinese Medicine Specialty 2017 158 第一作者 席银凯 1993 硕士研究生 主要从事药用植物化学成分研究 E mail xyk xyt 通信作者 杨武德 教授 主要从事药用植物化学成分研究 E mail ywd 680708 was cultured in MS medium containing 1 0 mg L 1 6 BA and 1 0 mg L 1 NAA for 70 d the protocorm developed into shoots with a 5 36 bud proliferation coefficient At this time cluster buds induced from protocorm were transferred into MS medium with 1 0 mg L 1 6 BA and 1 0 mg L 1 NAA to proliferate via the proliferation mode of bud to bud and the proliferation coefficient reached 4 28 and the stable proliferation system could be established 3 The rooting rate was up to 96 5 in MS medium equipped with 1 0 mg L 1 NAA and 150 g L 1 banana puree and the healthy seedlings with 4 7 true leaves and a height of 8 10 cm could be obtained after 60 d culture The survival rate of seedlings was more than 85 when they were transplanted into polyethylene basin with a volume ratio of pine bark to mountain soil of 3 2 In this study the efficient and rapid propagation system of cluster bud of Cymbidium Golden Elf Sundust was established by the pathway of callus and protocorm to embryonic callus and protocorm to protocorm to cluster bud to regeneration plant which provides an experimental basis for further artificial breeding and genetic transformation Meanwhile this protocol also provides the reference for asexual rapid propagation of other Orchidaceae species Key words Cymbidium Golden Elf Sundust embryonic callus protocorm cluster bud the stem tip of the lateral bud 兰科是世界上最庞大的植物科之一 多达 20 000 30 000种 大多具有极高观赏价值 Chugh et al 2009 黄金小神童 Cymbidium Golden Elf Sundust 为小花型品种 叶片尖挺 总状花 序 着花十余朵 该品种一年四季均能开花 在珠三 角地区多夏秋季开放 可人为控制花期 在花开之 季 不仅能看到金光灿灿的花朵 还能闻到阵阵幽 香 朱根发和徐晔春 2011 朱根发 2012 但 黄 金小神童 归属何种存在较大的争议 据文献报道 由于其开花物候和性状更接近于建兰 C ensifolium 的生长特性 故把其归于建兰品种 王济 红等 2014 但也有文献报道 黄金小神童 为10 多年前由我国台湾地区虎头兰和四季兰杂交 C hybridium C ensifolium 而得 余洪 2005 因此一 些研究者将 黄金小神童 归于大花蕙兰品种 韩明 等 2012 姚婧等 2015 综合考虑前人的看法 该 研究将 黄金小神童 归为大花蕙兰品种 大花蕙兰 C hybridium 因其株型 花型大 花 多 花期长且每年春节期间开放 故在中国兰花市 场上独领风骚 其又名虎头兰 东亚兰和西姆比 兰 为兰科 Orchidaceae 兰属 Cymbidium 多年生 草本 是兰属部分附生性种类的杂交种 因与蕙兰 C faberi 较相似且花朵硕大 故称大花蕙兰 刘 园和王四清 2005 大花蕙兰传统繁殖方式为分 株繁殖和种子繁殖 分株繁殖尽管能够保持母本 性状 但效率低 增殖倍数只有1 3倍 且周期较 长 难以满足工厂化生产的需要 刘园和王四清 2005 而大花蕙兰种子细小 缺乏胚乳且胚发育 不完全 萌发率极低 即使萌发成功 生长速度也 非常缓慢 从种子萌发成苗到能进行性状鉴定的 开花植株一般需要4 5 a 甚至更久 且无法准确 判断其品种特性保持与否 陈箐瑛和蓝贺胜 2004 现代大花蕙兰繁殖方式多为组织培养 可 对优良材料进行快速繁殖 比常规方法快数万到 数十万倍 并能克服远缘杂交不亲和以及杂种胚 发育不良的问题 不受地区 季节和气候限制 曹 孜义和刘国民 2002 自Morel 1960 用大花蕙兰的茎尖在含有细胞 分裂素的KC培养基上培养 首次获得了兰花无病 毒植株后 兰花的组织培养逐渐兴起 目前 我国 兰科植物的组培研究主要集中在兜兰属 Paphiopedilum 龙波和龙春林 2006 杜鹃兰属 Cremastra 张明生等 2005 独蒜兰属 Pleione 李招文和陈文光 1988 石斛属 Dendrobium 吴 志刚等 2005 和白及属 Bletilla 张爱丽等 2018 等 不同学者对兰花组织培养的途径以及影响因 素进行了大量研究 利用不同外植体再结合适宜的 植物生长调节剂 人为创造适合兰花生长发育的小 环境 可以实现不同品种兰花的植株再生 从而达 到保护濒危兰花 保持杂交兰种性以及使一部分品 种商品化的目的 黄金小神童 为杂交种 花色艳 丽且气幽香 极具观赏价值 为了推广新品种 达到 工厂化生产的目的 很有必要对其进行组织培养研 究 因此 该研究以 黄金小神童 侧芽茎尖为外植 体 试图诱导愈伤组织 再诱导具有胚性而直接产 生原球茎 进而通过原球茎萌发成苗 最终建立 黄 金小神童 高效 稳定的丛芽快速繁殖体系 为进一 步开展其人工繁育和遗传转化提供实验依据 同时 也可为兰科其他物种的无性快速繁殖提供参考 1 材料与方法 1 1材料和消毒 5盆 黄金小神童 植株由云南春之兰花卉有 限公司赠送 植株经云南文山学院丁长春博士鉴 定为Cymbidium Golden Elf Sundust 选取形态 3864期席银凯等 大花蕙兰 黄金小神童 胚性愈伤组织诱导及植株再生研究 健康无病害植株的侧芽茎尖 轻轻刷去表皮污渍 后 先用10 的洗衣粉溶液 质量比 浸泡10 min 再用流水冲洗30 min 然后置于超净工作台中 用 75 的乙醇 体积比 表面消毒5 min 再用0 1 的HgCl2 质量比 消毒10 min 最后用无菌水漂洗 6次 每次不少于3 min 植物生长调节剂6 苄氨 基嘌呤 6 BA 1 萘乙酸 NAA 蔗糖和琼脂均为 分析纯 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司 活性炭 AC 购自天津市风船化学试剂科技有 限公司 天然附加物椰子和香蕉购自农贸市场 1 2方法 1 2 1培养基 基本培养基为1 2MS和MS 附加 琼脂4 7 g L 1 蔗糖除起始培养和正交试验培养 基外 其他均为30 g L 1 pH值5 4 5 8 培养基 在122 灭菌25 min备用 1 起始培养基 根据 课题组对兰科的研究经验 采用1 2MS 1 0 mg L 1 NAA 50 g L 1香蕉泥 15 g L 1蔗糖作 为愈伤组织诱导培养基 未发表资料 2 胚性 愈伤组织和原球茎的发生与增殖同步培养基 MS 为基本培养基 添加不同质量和体积浓度的6 BA 0 1 1 0 2 0 mg L 1 椰汁 50 100 150 mL L 1 和蔗糖 20 30 40 g L 1 采用L9 3 4正交试 验 表1 培养70 d后 记录各组生长情况并统 计增殖系数 3 丛芽发生培养基 在MS中添加 不同质量浓度的6 BA 0 1 1 0 2 0 mg L 1 和 NAA 0 1 0 5 1 0 mg L 1 进行完全组合实验 探 究不同激素组合对丛芽发生的影响 70 d后 记 录各组生长情况并统计丛芽发生系数与增殖系 数 4 丛芽增殖与复壮培养基 根据上一步丛芽 发生的情况 采用与之相同的培养基 以 芽繁芽 方式进行丛芽增殖与复壮培养 培养3代后计算 芽的平均增殖系数 5 生根培养基 在MS中添 加不同质量的NAA 0 1 0 5 1 0 mg L 1 和香蕉 泥 50 100 150 g L 1 进行完全组合实验 附加 0 5 g L 1AC 培养60 d后 记录各组生长情况并 统计生根率 1 2 2培养条件与接种方法 培养条件 培养室温 度控制在 22 1 光照强度1 500 2 000 lx 光照时间10 h d 1 接种方法 起始培养时将消 毒处理好的侧芽茎尖接于培养基中 每瓶1个材 料 胚性愈伤组织和原球茎的发生与增殖培养 将 愈伤组织和少量原球茎混合物切割为0 5 cm 0 5 cm大小转接入各正交组中 每组20瓶 每瓶 15个材料 丛芽发生培养 将原球茎团块分割成1 cm 1 cm大小接入完全组合实验组中 每组20 瓶 每瓶15个材料 丛芽增殖与复壮培养 2 4 表1 胚性愈伤组织和原球茎的发生与 增殖同步L9 3 4正交设计 Table 1 L9 3 4 orthogonal design for occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm 水平 Level 因素Factor A 6 BA mg L 1 B 椰汁 Coconut juice mL L 1 C 蔗糖 Sucrose g L 1 1 0 1 50 20 2 1 0 100 30 3 2 0 150 40 棵幼苗为一丛 剪去叶片的2 3再接入新鲜培养 基中 每瓶12丛 共30瓶 生根培养 选取生长健 壮的单苗 剪去2 3叶片接入培养基 每组20瓶 每瓶12个材料 以上各实验组均重复3次 如出 现污染则重新取材补足各组接种瓶数 1 2 3炼苗移栽 待生根苗长至8 10 cm 根长2 4 cm时 将生根瓶置于室外适应环境3 d 小心取 出生根苗 洗净根部残余的培养基 用质量比为 0 1 的多菌灵溶液浸泡5 min 取出晾至根部微微 发白 移栽至经高锰酸钾消毒的碎松树皮与山基 土 体积比为3 2 中保温 20 25 保湿 75 95 60 d后统计成活率以及生长情况 1 2 4统计指标 所得数据采用Excel软件和SPSS 19 0 软件处理分析 增殖系数 有效转接瓶数 原始接种瓶数 丛芽增殖系数 有效转接瓶数 原 始接种瓶数 生根率 产生不定根的单苗 数 接种材料总数 100 成活率 成活苗 数 移栽总苗数 100 2 结果与分析 2 1起始培养 将 黄金小神童 的侧芽茎尖接种于起始培养 基上 7 d后与培养基接触部位开始膨大 图1 A 培养30 d后 可以看到茎尖被愈伤组织与原 球茎所包围 图1 B 培养60 d后 在体视显微 镜下可观察到愈伤组织与原球茎的混合培养物 图1 C 2 2胚性愈伤组织和原球茎的发生与增殖同步培养 将培养60 d后的愈伤组织和少量原球茎混合 物切割为0 5 cm 0 5 cm大小转接入胚性愈伤组 织和原球茎发生与增殖同步培养基中 培养结果 见表2 表3与表4 由表2正交试验结果表明 各 486广 西 植 物42卷 A 培养7 d后 膨大的侧芽茎尖 B 培养30 d后 愈伤组织与原球茎发生 C 培养60 d后 体视镜下的愈伤组织与原球茎的混合物 A After 7 d culture swollen stem tip of lateral bud B After 30 d culture callus and protocorm occurred C After 60 d culture the mixture of the callus and the protocorm under stereoscope 图1 起始培养 Fig 1 Initial culture 因数间极差按降序的方式排列为R6 BA 1 554 R椰汁 0 326 R蔗糖 0 260 RError 0 194 这3种 因素的R值均大于空白列 表明3种因素对胚性 愈伤组织和原球茎发生与增殖的效应均是可靠 的 由方差分析结果可知 表3 6 BA对胚性愈 伤组织和原球茎发生与增殖有统计学意义 P0 05 对 6 BA的3个水平进行Duncan检验 表4 可知 6 BA的水平3 2 0 mg L 1 对胚性愈伤组织和原 球茎发生与增殖的效果较其他两个水平 0 1 mg L 1与1 0 mg L 1 显著 通过平均值分析 黄金 小神童 胚性愈伤组织和原球茎的发生与增殖同 步培养的最佳培养基为A3B3C1 2 0 mg L 1 6 BA 150 mL L 1椰汁 20 g L 1蔗糖 在此培养基 中 培养70 d后增殖系数达到8 13 在此培养基中 培养15 d后 胚性愈伤组织与 原球茎混合物的颜色由嫩绿逐渐转变为深绿 图 2 A B 培养45 d后 肉眼可见其体积逐渐增大 从体视镜下观察到其质地紧密 形成由原球茎组 成的桑葚状团块 图2 C 培养70 d后 培养基表 面基本被原球茎覆盖 图2 D 此时在进行下一 阶段的转接中发现 原球茎下面还存在少量的胚 性愈伤组织 为了保证丛芽发生的一致性 在下一 阶段转接过程中 只转接表面的原球茎团块 尽量 舍弃下面的胚性愈伤组织 故此阶段计算的增殖 系数为原球茎增殖系数 2 3丛芽发生培养 在胚性愈伤组织和原球茎发生与增殖的培养 中 仅少数原球茎可以直接发育为幼苗 效果并不 理想 因此 将原球茎团块进行丛芽发生培养 培 养结果见表5 表5完全组合实验结果表明 在NAA浓度一 定的情况下 丛芽发生系数和增殖系数与6 BA呈 正相关 当6 BA为1 0 mg L 1时 达到最大值 当 6 BA浓度超过1 5 mg L 1时呈负相关 在此阶 段的各实验组中 虽然原球茎团块均能发育成幼 芽 但丛芽发生系数与增殖系数上存在显著差异 其中 8号的丛芽长势相对较好 丛芽发生系数与 增殖系数最高 分别为12 34和5 36 在其他组中 幼芽的生长较慢 且丛芽发生系数与增殖系数均 低于8号培养基 因此 最佳的丛芽发生与增殖 培养基为8号 即MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA 在此培养基中 将1 cm 1 cm大 小原球茎团块转入8号培养基培养15 d后 原球 茎团块表面有白色芽点出现 图3 A 培养25 d 后 从体视镜下观察到原球茎顶端第一片真叶形 成 图3 B 培养35 d后 伴随原球茎团块增大 的同时在体视镜下观察到锥形丛芽形成 图3 C 培养50 d后原球茎团块增殖速度逐渐减慢 大量丛芽发生 图3 D 从 黄金小神童 的实际情况来看 培养至此阶 段 发生的丛芽纤细且瘦弱 若直接进行生根培养 移栽成活率较低 故将生长60 d的幼苗再接入8 号培养基中进行复壮培养 图4 A C 连续培养3 代后 不仅可以解决苗纤细 瘦弱 成活率低的问 题 而且每代培养均可保持良好的增殖系数 5864期席银凯等 大花蕙兰 黄金小神童 胚性愈伤组织诱导及植株再生研究 A 刚接入的胚性愈伤组织与原球茎混合物 B 培养15 d后的胚性愈伤组织与原球茎混合物 C 桑葚胚 D 培养70 d后大量 的原球茎 A Mixture of embryonic callus and protocorm just cultured B Mixture of embryonic callus and protocorm cultured for 15 d C Morula D A large number of procorms cultured for 70 d 图2 胚性愈伤组织和原球茎的发生与增殖 Fig 2 Occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm A 布满白色芽点的原球茎团块 B 原球茎顶部的第一片真叶形成 C 锥形丛芽 D 簇状丛芽 A Protocorm mass were dotted with white bud points B The first true leaf at the top of the protocorm formed C Conical cluster buds D Cluster buds 图3 丛芽发生培养 Fig 3 Cluster bud occurrence culture 2 4生根和移栽 NAA和香蕉泥对 黄金小神童 生根影响如表 6所示 对于 黄金小神童 生根诱导来说 在0 5和 1 5 mg L 1 NAA时 同一浓度各组间生根率无显著 性差异 而随香蕉泥浓度的增大 生根率有所升高 当NAA为1 0 mg L 1 香蕉泥为150 g L 1时 与 其他两组有显著性差异 苗的整体生根率较其他处 理组好 因此 本研究认为8号为 黄金小神童 的 最佳生根培养基 培养60 d后生根率达96 5 单 苗转入此培养基15 d后 新芽原基开始出现 图5 A B 培养30 d后 生根瓶可见白色根尖 图5 C D 培养45 d后 可以明显看到其茎增粗 根伸长 图5 E F 培养65 d后根系发达 图5 G 将试 管苗炼苗后移栽至消毒的碎松树皮和山基土 3 2 中 图5 H 60 d后 成活率在85 以上 3 讨论与结论 3 1 黄金小神童 人工快繁中的增殖途径 兰科植物由于自身的生物学特性 自然繁殖 系数极低 利用组织培养技术是获得大量种苗的 有效途径 Arditti 2009 原球茎的诱导与增殖 则是兰科植物人工快繁的关键 也是这一特殊植 物类群从有性生殖向无性生殖特征转变的必要步 骤 Chen Chang 2001 兰科植物通过原球茎 繁殖有3种途径 1 外植体 原球茎 丛芽 生 根 2 外植体 原球茎 次生原球茎 丛芽 生根 3 外植体 愈伤组织 原球茎 丛芽 生根 Mahendran Bai 2012 Zeng et al 2013 在 这3种方式中 大多按 1 和 2 形成特有的原球 686广 西 植 物42卷 A 刚接入培养基的幼苗 B 培养15 d后的幼苗 C 培养30 d后的幼苗 A Seedlings just cultured in the medium B Seedlings cultured for 15 d C Seedlings cultured for 30 d 图4 复壮培养 Fig 4 Rejuvenation culture A B 培养15 d后新芽原基出现 C D 培养30 d后根尖出现 E F 生根培养45 d G 生根培养65 d H 移栽苗 A B New bud primordium appeared after 15 d culture C D Root tip appeared after 30 d culture E F Rooting cultured for 45 d G Rooting cultured for 65 d H Transplanting plantlets 图5 瓶内苗生根培养及移栽 Fig 5 Rooting culture and transplanting of test tube plantlets 茎 类原球茎或肉质根状茎 极少产生愈伤组织或 胚性愈伤组织 陈继敏等 2008 丁兰等 2014 Sajise Sagawa 1991 报道了蝴蝶兰胚性愈伤组 织的形成 但没有详细描述愈伤组织诱导的方法 此外 Kobayashi等 1993 利用愈伤组织作为原生 质体的来源 成功地从兰科植物原生质体中获得 植株再生 但关于愈伤组织形成的详细信息尚不 清楚 而 黄金小神童 侧芽茎尖一旦诱导出愈伤 组织 随即出现原球茎 愈伤组织增殖并不十分明 显 随着原球茎的增殖 其结构上的两极性逐渐 显现 顶端形成的叶原基处分化形成芽 基部拟根 状结构发育为根 最后形成幼苗 由于原球茎数量 较多 培养物在形态上呈现出丛芽的状态 这可能 是因为培养基的不同所致 从这一现象来看 黄 金小神童 原球茎繁殖介于上述 2 和 3 之间 在兜兰 Paphiopedilum maudiae 中也有过类似现 7864期席银凯等 大花蕙兰 黄金小神童 胚性愈伤组织诱导及植株再生研究 表2 不同处理对胚性愈伤组织和 原球茎的发生与增殖的影响 Table 2 Effects of different treatments on occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm 处理 Treatment 因素 Factor A 6 BA mg L 1 B 椰汁 Coconut juice mL L 1 C 蔗糖 Sucrose g L 1 D 误差 Error 增殖系数 Proliferation coefficient 1 0 1 50 20 1 6 28 2 0 1 100 30 2 6 12 3 0 1 150 40 3 6 30 4 1 0 50 30 3 7 03 5 1 0 100 40 1 7 15 6 1 0 150 20 2 7 36 7 2 0 50 40 2 7 38 8 2 0 100 20 3 7 97 9 2 0 150 30 1 8 01 K1 6 233 6 897 7 203 7 147 K2 7 180 7 080 7 053 6 953 K3 7 787 7 223 6 943 7 100 R 1 554 0 326 0 260 0 194 表3 胚性愈伤组织和原球茎的发生与 增殖的方差分析结果 Table 3 Analysis of variance of occurrence and proliferation of embryonic callus and protocorm 源 Source 型 平方和 Sum of square 自由度 df 均方 Mean square F值 F value 显著性 Significance A 6 BA 3 677 2 1 839 34 033 P0 05 C蔗糖 Sucrose 0 102 2 0 051 0 079 P 0 05 D误差 Error 0 061 2 0 031 0 046 P 0 05 象的报道 周慧君 2016 黄金小神童 原球茎 发育为幼苗后 其基部愈伤组织和原球茎混合物 的生长明显受到抑制 推测为自身产生的生长素 与外源激素产生拮抗作用 导致愈伤组织增殖受 阻 而转变为以 芽繁芽 即形成丛生芽的方式来 进行增殖 本研究结果表明 在 黄金小神童 人 工快繁早期 应以愈伤组织和原球茎混合物为主 要增殖对象 该混合物亦是人工快繁和遗传转化 的最佳材料 原球茎大量发育为幼苗时 则以 芽 繁芽 方式为主 因此可以达到最有效的增殖目的 表4 6 BA 3水平Duncan检验 Table 4 Duncan s test in three levels of 6 BA 水平Level均值Mean 0 05水平0 05 level 3 2 0 mg L 1 7 787 a 2 1 0 mg L 1 7 180 b 1 0 1 mg L 1 6 233 c 注 同列不同小写字母表示差异性显著 P 0 05 下同 Note Different lowercase letters in the same column indicate significant differences P 0 05 The same below 表5 不同植物激素配比对丛芽发生与增殖的影响 Table 5 Effects of different plant hormone ratios on cluster bud occurrence and proliferation 处理 Treatment 6 BA mg L 1 NAA mg L 1 丛芽发生 系数 Cluster bud occurrence coefficient 丛芽增殖 系数 Cluster bud proliferation coefficient CK 0 0 6 69 0 15e 4 40 0 11e 1 0 5 0 1 10 62 0 09cd 4 95 0 23bcd 2 1 0 0 1 11 27 0 14b 5 16 0 15ab 3 1 5 0 1 11 26 0 10b 5 10 0 17bc 4 0 5 0 5 10 62 0 17cd 4 77 0 18d 5 1 0 0 5 11 29 0 20b 5 18 0 25ab 6 1 5 0 5 10 54 0 08b 4 99 0 09bcd 7 0 5 1 0 10 72 0 13c 4 92 0 16cd 8 1 0 1 0 12 34 0 16a 5 36 0 12a 9 1 5 1 0 11 26 0 19b 5 18 0 20ab 注 丛芽增殖系数为增殖复壮培养中3代的平均增殖系数 Note Cluster bud proliferation coefficient is the average proliferation coefficient of three generations in the cluster bud proliferation and rejuvenation culture 3 2外源性因素对 黄金小神童 体外快繁的影响 外源激素种类及浓度在 黄金小神童 体外快 繁中起着重要作用 在胚性愈伤组织和原球茎发 生与增殖过程中 6 BA起主要作用 对胚性愈伤组 织和原球茎发生与增殖具有促进作用 在丛芽发 生与增殖复壮过程中 6 BA单独使用效果明显优 于空白对照 而远不如与NAA组合使用的效果 推测 黄金小神童 在上述培养过程中强烈依赖于 6 BA 而NAA对6 BA则有明显的协同作用 NAA 和6 BA这种需求的差异可能反映了植物生长时 内源性物质含量的差异 王育选等 2016 研究了 886广 西 植 物42卷 表6 不同质量浓度的NAA和香蕉泥对生根培养的影响 Table 6 Effects of NAA and banana puree at different concentrations on rooting culture 处理 Treatment NAA mg L 1 香蕉泥 Banana puree g L 1 生根率 Rooting rate CK 0 0 46 3 0 1f 1 0 5 50 94 5 0 2d 2 1 0 50 95 4 0 1bc 3 1 5 50 92 6 0 1e 4 0 5 100 94 7 0 2d 5 1 0 100 95 9 0 1b 6 1 5 100 92 9 0 2e 7 0 5 150 95 0 0 1cd 8 1 0 150 96 5 0 2a 9 1 5 150 93 1 0 2e 不同激素与NAA的组合 最后认为6 BA与NAA 组合 可实现大花蕙兰丛芽的高效增殖 Rodrigues等 2015 证明了生长素与细胞分裂素的 比值对桑葚胚的体外繁殖有一定影响 在不添加 或添加NAA的情况下 培养基中只要存在6 BA 都可促使桑葚胚发育成芽 而在 黄金小神童 的 预生根培养实验中 本课题组曾添加较低浓度的 6 BA与NAA组合使用 结果显示试管苗发育的根 长度较短甚至出现生根困难现象 导致移栽苗很 难成活 推测可能是由于在胚性愈伤组织和原球 茎发生 增殖与丛芽发生与增殖过程中 长时间培 养于存在6 BA的培养基中 导致大量细胞分裂素 积累 与外源6 BA产生拮抗作用 因此 在 黄金 小神童 的生根培养中 由于其具较高水平内源性 细胞分裂素 所以单独使用外源生长素即可获得 较好的生根效果 这与低浓度的NAA有利于大 花蕙兰生根的观点一致 胡琳 2013 此外 糖类和AC在 黄金小神童 体外快繁中 也具有不可忽视的作用 据现有报道 有些植物 在启动培养中 通过调节蔗糖代谢酶可以提高产 量 Kaur et al 2005 该实验蔗糖的加入可能打 破胚性愈伤组织与原球茎发生过程中各种糖类代 谢的平衡 从而促进了胚性愈伤组织与原球茎的 发生与增殖 在生根培养中 还加入了AC AC有 较强的吸附作用 可吸附培养基中的酚 醌等有害 物质 根茎具有避光生长的特性 使用AC可创造 根系生长所需的环境 此外 AC的存在可能提高 了培养物体内可溶性蛋白和总糖的含量 从而促 进根的发育 孙占育等 2010 3 3天然附加产物在 黄金小神童 体外快繁中的作用 近几十年来 在植物组织培养中经常加入天然 附加产物 它们大多含有糖 氨基酸 酶 植物激素 维生素等物质 对细胞和组织的增殖有明显的促进 作用 在兰科植物的人工快繁中 不同天然附加产 物对诱导 增殖和分化 生根和壮苗等不同培养阶 段有十分积极的作用 Arditti 2009 Arditti 1966