一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选鉴定及抑菌作用初探.pdf

引文格式 敖静 李杨 刘晓辉 等 一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选鉴定及抑菌作用初探 J 云南农业大学学报 自然科 学 2022 37 3 429 434 DOI 10 12101 j issn 1004 390X n 202109024 一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选鉴定 及抑菌作用初探 敖 静 李 杨 刘晓辉 高晓梅 孙玉禄 辽宁省微生物科学研究院 辽宁 朝阳 122000 摘要 目的 筛选黄瓜枯萎病的高效拮抗细菌并研究其抑菌作用 方法 采用平板对峙法从设施温室土壤 样品中筛选拮抗细菌 对其中抑菌率最高的菌株进行生理生化试验及16S rDNA测序分析 利用平板倒扣法 凹玻片法以及HPLC等方法对其抑菌作用进行初步研究 结果 共筛选得到8株拮抗细菌 XN 1 XN 8 其中抑菌率最高的为XN 3 在NCBI数据库的分析比对结果显示 XN 3与解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloli quefaciens 16S rDNA序列的同源相似性最高 99 XN 3能产生有抑菌作用的挥发性物质 XN 3可 使病原菌菌丝卷曲 长度变短 显微形态出现菌丝膨大 弯曲不均 分枝菌丝生长受阻 有厚垣孢子生成 其胞外物质使病原菌孢子萌发率降低89 01 HPLC色谱图显示 峰A 2中的成分有明显的抑菌作用 结论 分离得到的拮抗细菌XN 3为解淀粉芽孢杆菌 其对黄瓜枯萎病病原菌具有较强的抑菌作用 可以通 过胞外物质抑制菌丝生长及孢子萌发来实现抑菌 该结果为进一步研究其生防机制奠定了基础 关键词 黄瓜枯萎病 解淀粉芽孢杆菌 鉴定 高效液相色谱 抑菌作用 中图分类号 S436 421 13 文献标志码 A 文章编号 1004 390X 2022 03 0429 06 Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against Fusarium Wilt of Cucumber and Preliminary Study on Its Antifungal Effect AO Jing LI Yang LIU Xiaohui GAO Xiaomei SUN Yulu Microbial Research Institute of Liaoning Province Chaoyang 122000 China Abstract Purpose To screen high effective antagonistic bacteria of cucumber fusarium wilt and to study its antimicrobial activity s The antagonistic bacteria were screened from green house soil samples by plate confrontation physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing analysis were pered on the strains with the highest bacteriostatic rate the antifungal effects were studied by plate inversion hollow glass and HPLC Results A total of eight strains of antagonistic bacteria XN 1 XN 8 were screened and XN 3 had the highest inhibitory rate The results of analysis and comparison in NCBI database showed that XN 3 had the highest homo logy similarity with 16S rDNA sequence of Bacillus amyloliquefaciens 99 XN 3 could produce volatile compounds which had antifungal effect XN 3 could make the mycelia curl shorten their 云南农业大学学报 自然科学 2022 37 3 429 434 Journal of Yunnan Agricultural University Natural Science E mail ynauzkxb 收稿日期 2021 09 18 修回日期 2022 03 11 网络首发日期 2022 04 26 基金项目 辽宁省农科院院长基金项目 2020QN2413 辽宁省农科院土壤微生态学科建设项目 2019DD154522 辽宁省 兴辽英才计划 项目 XLYC2002048 作者简介 敖静 1986 女 辽宁朝阳人 硕士 助理研究员 主要从事土壤微生态研究 E mail aojing07 网络首发地址 length and the microscopic morphology of mycelia expand and bend unevenly the growth of branch ing mycelia was blocked and chlamydospore was generated its extracellular substance reduced the spore germination rate by 89 01 HPLC chromatogram showed that the components in peak A 2 had obvious antifungal effect Conclusion The isolated antagonistic bacterium XN 3 was Bacillus amyloliticus which had a strong antifungal effect on Fusarium oxysporum It could inhibit mycelial growth and spore germination by extracellular substances laying a foundation for further study on its biocontrol mechanism Keywords cucumber fusarium wilt Bacillus amyloliticus identification high perance liquid chromatography HPLC antimicrobial activity 黄瓜枯萎病是主要由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 侵染引起的土传真菌病害 可侵染多 种植物寄主 病菌通过分泌降解酶和菌毒素等 侵染作物的维管束系统 导致作物出现萎蔫和腐 烂等症状 1 2 可引起作物和花卉枯萎病 严重时 造成植株死亡 从而使作物大量减产 影响农业 发展 3 5 尖孢镰刀菌的菌丝和孢子可存留在土壤 或作物种子上越冬 在土壤和空气中能存活 10年以上 6 目前 农业生产中主要通过化学药 剂防治尖孢镰刀菌 如利用唑类 甲酯类和酰胺 类等药物对种子进行消毒 或对作物植株进行灌 根等处理以抑制病原菌生长 7 8 但长期大量施用 化学药品不仅会污染作物 土壤和水系 产生病 原菌耐药性的风险 还会直接影响人类健康 9 10 目前 生物防治是应用前景广 成本较低且绿色 无污染的技术 11 本研究以尖孢镰刀菌黄瓜转化 型为研究对象 通过从设施温室土壤中筛选出高 效拮抗菌株并研究其抑菌作用 旨在为进一步探 究拮抗菌的生防作用机制提供理论依据 1 材料与方法 1 1 材料 病原菌 尖孢镰刀菌 F oxysporum 黄瓜转 化型 由辽宁省微生物科学研究院分离 1 2 拮抗菌的筛选和鉴定 1 2 1 拮抗菌筛选 于辽宁省朝阳市喀左县六官营子乡东前沟村 N41 16 E119 68 种植黄瓜的设施温室中采集 土壤样品 将其混匀后称取1 0 g放至99 mL 无菌水中 振荡约30 min 梯度稀释至10 5倍 吸 取100 L均匀涂布于含病原菌的平皿中 28 培养24 h 将能产生抑菌圈的菌株分离纯化 即 得到初筛菌株 利用平板对峙法 12 测定抑菌率 筛选出抑菌率较高的拮抗菌株 抑菌率 对照 菌落直径 处理菌落直径 对照菌落直径 100 1 2 2 生理生化鉴定及16S rDNA序列比对 采用划线法将所得拮抗菌株接种到LB固 体培养基 13 平皿上 观察菌落形态及其显微形 态 并进行生理生化试验 16S rDNA扩增引物 序列为 F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和R 5 CTACGGCTACCTTGTTACGA 3 反 应体系总体积50 0 L 包括 上 下游引物各 1 5 L 细菌基因组1 0 L 10 Buffer 5 0 L Taq聚合酶1 0 L dNTP 1 0 L ddH2O 39 0 L 反应条件为 95 5 min 95 30 s 58 30 s 72 90 s 35个循环 72 7 min PCR 产物 经1 琼脂糖凝胶电泳后送至上海派森诺生物技 术有限公司完成测序 将16S rDNA序列与Gen Bank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析 利 用MEGA软件进行比对及构建发育进化树 1 3 抑菌作用研究 1 3 1 挥发性物质对病原菌菌丝的影响 采用平皿倒扣法 一个平皿加入PDA培养基 并于中心接种直径为5 mm的尖孢镰刀菌菌块 另 一个平皿加入LB固体培养基 将拮抗菌种混悬 液 调节密度为108 CFU mL 均匀涂布 2个平皿倒 扣用封口膜封口 并用保鲜膜密封 以空白LB 固体培养基平皿为对照 28 培养 观察处理组 病原菌生长情况 每个处理重复3次 14 1 3 2 拮抗菌对病原菌菌丝形态的影响 采用平板对峙法 将直径为5 mm的尖孢镰 刀菌菌饼接种至PDA培养基平皿中心 在距离 中心2 5 cm处接种拮抗菌菌块 挑取靠近拮抗菌 一侧的病原菌菌丝 在显微镜下观察其形态变 化 将靠近拮抗菌一侧的病原菌菌丝转接到新的 PDA培养基上 28 恒温培养 观察其是否有 430云南农业大学学报第 37 卷 再生长能力 每24 h测量菌落直径大小 以未经 对峙处理的病原菌菌丝为对照 每个处理组设置 3个重复 15 1 3 3 胞外物质对病原菌及孢子萌发的影响 将拮抗菌接种到100 mL LB液体培养基中 37 180 r min培养24 h得到种子液 将种子 液按2 的比例接到LB液体培养基中 37 180 r min培养24 h 低温5 000 r min离心10 min 弃去下沉菌体 再用0 22 m滤膜过滤 即得到 无菌发酵液 将培养5 d的病原菌菌丝用去离 子水洗脱 再用6层纱布过滤 10 000 r min离心 5 min 弃去上清液 收集孢子 用去离子水制备 孢子混悬液 调节其密度为106 个 mL 备用 将1 mL病原菌孢子混悬液与10 mL融化冷 却至约45 的PDA培养基混合摇匀后倒入平 皿中冷却 采用牛津杯法 向牛津杯中加入100 L 无菌发酵液 以LB液体培养基为空白对照 将 平皿置于 28 1 培养24 h 观察是否有抑菌 圈出现 并测量抑菌圈大小 每个处理设置3个 重复 16 精确吸取0 50 mL孢子混悬液与同体 积无菌发酵液混合 将混合液体滴于凹玻片 然 后放于平皿中 加盖保湿培养 恒温箱设置28 分别于2 4 6 8和10 h检测孢子萌发数 以 无菌水为对照 每个处理组设置3个重复 17 1 4 HPLC分析条件 采用Agilent 1260高效液相色谱分析仪和V enusil XBP C18色谱柱 4 6 mm 250 mm 5 m 进 行HPLC分析 流动相由色谱纯乙腈 A 和纯化 水 B 组成 梯度洗脱程序见表1 进样量20 L 流速1 0 mL min 波长220 nm 收集各峰成分并 进行抑菌试验 2 结果与分析 2 1 拮抗菌筛选结果 土壤样品中共分离出细菌菌株32株 其中 有8株 XN 1 XN 8 对尖孢镰刀菌有抑菌作用 由表2可知 XN 3的抑菌率最高 为71 81 故选择XN 3进行下一步试验 2 2 形态学及生理生化特征 由图1可知 XN 3单菌落呈白色 近圆 形 表面半干燥 有隆起褶皱 显微镜下菌体呈 杆状 产椭圆形芽孢 革兰氏颜色试验呈阳性 通过生理生化试验结果 表3 并结合 常见细菌 表 1 梯度洗脱程序 Tab 1 Gradient elution program 时间 min time 流动相A mobile phase A 流动相B mobile phase B 0 01 20 80 5 00 20 80 33 00 80 20 38 00 80 20 40 00 20 80 45 00 20 80 表 2 菌株XN 1 XN 8测定抑菌率结果 Tab 2 Results of XN 1 XN 8 antibacterial rate 编号 number 抑菌率 antibacterial rate 编号 number 抑菌率 antibacterial rate XN 1 51 16 0 98 c XN 5 45 28 0 40 d XN 2 46 15 0 22 d XN 6 35 77 0 51 e XN 3 71 81 1 14 a XN 7 55 48 0 74 b XN 4 26 19 0 76 f XN 8 25 23 1 07 f 注 不同字母表示差异显著 P 0 05 下同 Note Different letters indicate significant difference P 0 05 the same as below 表 3 细菌XN 3生理生化特征 Tab 3 The physiological and biochemical characteristics of XN 3 检测项目 test items 检测结果 detection result 检测项目 test items 检测结果 detection result V P反应 Voges Prokauer reaction 淀粉水解 starch hydrolysis 柠檬酸盐 citrate utilization 蔗糖水解 sucrose hydrolysis 明胶液化 hydrolysis of gelatin 脲酶水解 urea hydrolysis 蔗糖发酵 sucrose fermentation 吲哚试验 indole test 甘露醇发酵 mannitol fermentation 接触酶试验 catalase test 注 阳性反应 阴性反应 Note positive reaction negative reaction a b 图 1 XN 3在LB培养基 a 和光学 显微镜下 b 的形态特征 Fig 1 The morphological characteristics of XN 3 in LB medium a and light microscope b 第 3 期敖 静 等 一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选鉴定及抑菌作用初探431 系统鉴定手册 18 和 伯杰细菌鉴定手册 19 将XN 3鉴定为芽孢杆菌属 2 3 分子生物学鉴定 将16S rDNA序列与GenBank数据库中的核 苷酸序列进行同源性分析 结果显示菌株XN 3与解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 16S rDNA序列的同源相似性最高 为99 由图2 可知 菌株XN 3与解淀粉芽孢杆菌 位于同一分支 结合菌体形态特征及生理生 化鉴定结果 可确定XN 3为解淀粉芽孢菌 将其核酸序列上传至Genebank 获取登录号 为 OK465112 2 4 抑菌作用 2 4 1 挥发性物质对病原菌菌丝的影响 由图3可知 对照组菌丝生长状态较好 菌 丝较长 且气生菌丝生长旺盛 处理组菌丝卷 曲 长度变短 说明XN 3能够产生对病原菌菌 丝生长有抑制作用的挥发性气体 2 4 2 拮抗菌对病原菌菌丝的影响 由图4可知 对照组菌丝粗细均匀 表面光 滑 有弹性 菌丝内原生质均匀分布 有少量孢 子产生 处理组菌丝膨大 变弯变短 粗细不均 匀 菌丝分节现象明显 顶端出现不规则分支 分枝菌丝生长受阻 有厚垣孢子生成 由图5可知 在72 h内 处理组菌落直径分 别为10 06 21 00和35 00 mm 均小于对照组 说明处理组菌丝生长初期受限 但并未完全失去 生长能力 随着菌丝生长 96 h后对照组和处理 NZ CP053376 1 9815 11241 Bacillus amyloliquefaciens strain WF02 chromosome complete genome NZ CP053376 1 97405 98831 Bacillus amyloliquefaciens strain WF02 chromosome complete genome XN3 NZ LSAZ01000028 1 142 1568 Bacillus nakamurai strain NRRL B 41091 Bacillus sp B 41091 contig 34 whole genome shotgun sequence NZ PELK01000474 1 1 1255 Methylobacterium frigidaeris strain IER25 16 C23285 whole genome shotgun sequence NZ QFRW01000020 1 127 1552 Glycomyces dulcitolivorans strain SJ 25 scaffold 20 whole genome shotgun sequence NZ CP011150 1 591164 592589 Bacillus altitudinis strain W3 chromosome complete genome NZ LJJC01000004 1 78639 80066 Bacillus shackletonii strain LMG 18435 super 11 whole genome shotgun sequence NZ CP015506 1 33083 34509 Bacillus oceanisediminis 2691 chromosome complete genome NZ QXIR01000081 1 1 1384 Bacillus salacetis strain SKP7 4 whole genome shotgun sequence NZ CP031443 1 287015 288443 Bacillus mobilis strain ML A2C4 chromosome complete genome NZ RCHJ01000063 1 72 1499 Piscinibacter defluvii strain SH 1 contig 063 whole genome shotgun sequence NZ CP053376 1 2980530 2981956 Bacillus amyloliquefaciens strain WF02 chromosome complete genome NC 006270 3 3121828 3123255 Bacillus licheniis DSM 13 ATCC 14580 complete sequence100 89 97 47 49 76 76 99 0 1 图 2 XN 3的16S rDNA系统发育进化树 Fig 2 The 16S rDNA phylogenetic evolution tree of XN 3 a b 图 3 对照组 a 和处理组 b 的菌丝形态比较 Fig 3 Comparison of mycelium morphology of control group a and treatment group b a b 图 4 光学显微镜下对照组 a 和 处理组 b 的菌丝形态比较 Fig 4 Comparison of mycelium morphology of control group a and treatment group b under light microscope 0 10 20 30 40 50 60 70 80 24 48 72 96 120 144 对照组 control group 处理组 treatment group 菌落直径 mm colony diameter 时间 h time 图 5 菌丝生长情况比较 Fig 5 Comparison of mycelial growth 432云南农业大学学报第 37 卷 组菌落直径基本一致 2 4 3 胞外物质对病原菌及孢子萌发的影响 由表4可知 无菌发酵液可对病原菌产生抑 菌作用 抑菌圈直径为18 23 mm 说明XN 3胞 外物质对病原菌有抑制作用 同时 处理组孢子 萌发率明显降低 对照组孢子完全萌发时 处理 组孢子萌发率仅为10 23 说明XN 3无菌发酵 液对病原菌孢子萌发有明显的抑制作用 2 5 HPLC分析结果 由图6可知 无菌发酵液共分离出2个峰 保留时间分别为29 728 A 1 和35 858 min A 2 峰面积分别为116 444和198 887 收集出峰成分 进行平板抑菌试验 结果 图7 显示 峰A 2中 成分有抑菌圈出现 具有较明显抑菌作用 3 讨论 尖孢镰刀菌是土传病原真菌 且分布广泛 在设施农业生产中很难防治 现已成为植物病理 中的第三大土传病原真菌 6 长期以来 过度的 化学防治已造成严重的环境污染甚至影响人类健 康 因此 应用绿色生物防治技术 筛选尖孢镰 刀菌高效拮抗菌株 明显其抑菌成分 探究其作 用机理并研究其田间防治效果具有重要的理论和 实践意义 本研究以尖孢镰刀菌引起的黄瓜 枯萎病为靶标进行高效拮抗菌的筛选 得到1株 抑菌率高达71 81 的细菌菌株XN 3 经鉴定 为解淀粉芽孢杆菌 而解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰 刀菌具有明显的抑菌作用 这与张美君等 20 的研 究结论一致 此外 解淀粉芽孢杆菌是一种具有 广泛抑菌作用的生防菌 有研究发现其对橡胶树 褐根病菌 Phellinus noxius 橡胶疫霉 Phytoph thora heveae 小孢拟盘多毛 Pestalotiopsis mi crospora 和尖孢炭疽病菌 Colletotrichum acut atum 等多种病原真菌具有较好的抑菌效果 21 因此 对XN 3的研究具有更广阔的应用价值 这也是本研究的重要意义所在 本研究表明 XN 3能够产生有抑菌作用的 挥发性物质 有研究显示 解淀粉芽孢杆菌能够 产生抑制青霉菌的羟基丁酮以及2 癸酮等11种 挥发性有机物 VOCs 这些有机物都可以有效 抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长及孢子萌发 22 23 郝 象瑢等 24 利用GC MS研究解淀粉芽孢杆菌 LJ02产生的挥发性气体对多种果类致病菌的作 用 特别是对黑腐皮壳菌 Valsa mali 草莓灰霉 病菌 Botrytis cinerea 和枣浆胞病菌 Alternaria spp 有显著抑制效果 抑菌率均大于50 本研 究显示 XN 3可使病原菌菌丝卷曲 长度变 短 显微形态出现菌丝膨大和弯曲不均 分枝菌 丝生长受阻 这些病原菌菌丝形态的变化可能是 由于XN 3产生的抑菌物质破坏了病原菌菌丝细 胞 利用HPLC分析技术 通过收集分离出的各 峰组分 在峰A 2中发现对尖孢镰刀菌具有明显 表 4 XN 3无菌发酵液对病原菌孢子萌发的影响 Tab 4 Effect of XN 3 aseptic fermentation broth on spore germination of pathogenic bacteria 处理 treatments 孢子萌发率 spore germination rate平均抑菌圈直径 mm antibacterial circle diameter2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 对照组 control group 12 56 1 06 e 53 23 1 57 d 87 32 2 49 c 98 65 0 92 b 99 26 0 83 a 处理组 treatment group 3 20 0 12 e 5 36 0 14 d 7 02 0 54 c 8 35 0 15 b 10 23 0 47 a 18 23 0 36 a 注 未产生抑菌圈 Note no inhibition zone produced 2 5 0 0 10 20 30 29 728 35 858 40 保留时间 min retention time 2 5 5 0 通道电压 mV channel voltage 图 6 无菌发酵液HPLC色谱图 Fig 6 HPLC chromatogram of sterile fermentation liquid a b 图 7 峰A 1 a 与峰A 2 b 成分的抑菌作用 Fig 7 Fungicidal activity of the components of peak A 1 a and peak A 2 b 第 3 期敖 静 等 一株黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选鉴定及抑菌作用初探433 抑菌作用的成分 权春善等 25 和王军华等 26 研究 发现 解淀粉芽孢杆菌对病原菌菌丝细胞有强烈 的破坏作用 ARREBOLA等 22 研究发现 解淀 粉芽孢杆菌PPCB004对青霉属真菌的菌丝延伸 有强烈的抑制作用 能抑制其生长速度 刘超 等 27 研究发现 解淀粉芽孢杆菌BA 26发酵液组 分中的抗菌物质对灰葡萄孢 Botrytis cinerea 孢子萌发抑制作用较强 这些研究均验证了解淀 粉芽孢杆菌的广谱抑菌作用 同时也说明解淀粉 芽孢杆菌发酵产物中的抑菌成分是可被分离的 为微生物发酵生物农药的研发提供可能性 但在 本研究中XN 3抑菌物质的含量 种类及具体的 抑菌机理尚不明确 有待进一步探索和研究 本研究筛选出1株抑菌率较高的解淀粉芽孢 杆菌XN 3 可为今后植物病害绿色防治提供菌 种种质资源 通过对其抑菌作用的初探 为进一步 研究生防机制奠定基础 为针对尖孢镰刀菌引发 的植物病害研发绿色生物农药提供依据和方向 4 结论 本研究在设施农业土壤中分离筛选出8株黄 瓜枯萎病的高效拮抗菌菌株 其中 抑菌率最高 的菌株XN 3鉴定为解淀粉芽孢杆菌 B amyloliti cus XN 3能够产生有抑菌作用的挥发性物质 能够抑制病原菌菌丝生长 且胞外物质能够有效 地抑制病原菌孢子萌发 其发酵液组分A 2中有 明显抑菌作用的成分 参考文献 KING B C WAXMAN K D NENNI N V et al Arsen al of plant cell wall degrading enzymes reflects host pref erence among plant pathogenic fungi J Biotechnology for Biofuels 2011 4 4 DOI 10 1186 1754 6834 4 4 1 BANI M RISPAIL N EVIDENTE A et al Identifi cation of the main toxins isolated from Fusarium oxy sporum f sp pisi race 2 and their relation with isolates pathogenicity J Journal of Agricultural and Food Chem istry 2014 62 12 2574 DOI 10 1021 jf405530g 2 李敏慧 苑曼琳 姜子德 等 香蕉枯萎病菌致病机理研 究进展 J 果树学报 2019 36 6 803 DOI 10 13925 ki gsxb 20180523 3 梁银 张谷月 王辰等 一株拮抗放线菌的鉴定及其对 黄瓜枯萎病的生防效应研究 J 土壤学报 2013 50 4 810 DOI 10 11766 trxb201208010308 4 蔡文涌 王肖肖 方香玲 不同尖孢镰刀菌菌株对紫花 苜蓿幼苗生长的影响 J 草地学报 2020 28 5 1233 DOI 10 11733 j issn 1007 0435 2020 05 007 5 文增叶 李定华 代梦瑶 等 尖孢镰刀菌全基因组测序 及其致病相关基因分析 J 基因组学与应用生物学 2020 39 3 1106 DOI 10 13417 j gab 039 001105 6 田倍齐 龚晓丽 温芸芸 等 隆德县大田辣椒枯萎病气 7 象条件分析 J 农业科技与信息 2020 13 31 DOI 10 15979 62 1057 s 2020 13 012 王丽波 崔玥晗 岳玲 等 百合枯萎病的研究进展 J 园艺与种苗 2018 38 12 51 DOI 10 16530 ki cn21 1574 s 2018 12 018 8 何欢 王占武 胡栋 等 根系分泌物与根际微生物互作 的研究进展 J 河北农业科学 2011 3 70 DOI 10 16318 ki hbnykx 2011 03 029 9 翟争光 黄松青 栗广增 等 植物根系分泌物研究进 展 J 江西农业学报 2012 24 12 28 DOI 10 19386 ki jxnyxb 2012 12 009 10 王敏 土传黄瓜枯萎病治病生理机制及其与氮素营养 关系研究 D 南京 南京农业大学 2013 11 方中达 植病研究方法 M 北京 中国农业出版社 1998 12 杨革 微生物学实验教程 M 4版 北京 科学出版社 2010 13 祝久香 黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选 发酵及生防机 制研究 D 长沙 中南林业科技大学 2019 14 李晓红 解淀粉芽孢杆菌抑菌作用机理的探究 D 沈 阳 沈阳师范大学 2016 15 秦楠 解淀粉芽孢杆菌HRH317抗菌蛋白鉴定及抑菌 机理研究 D 晋中 山西农业大学 2015 16 NY Y 1156 1 2006 农药室内生物测定试验准则 杀菌 剂 第1部分 抑制病原真菌孢子萌发试验 凹玻片法 S 17 东秀珠 蔡妙英 常见细菌系统鉴定手册 M 北京 科 学出版社 2001 18 BUCHANAN R E GIBBONS N E 伯杰细菌鉴定手 册 M 中国科学院微生物研究所 译 8版 北京 科学 出版社 1984 19 张美君 吴庆 尹翠等 尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌拮 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