巨峰 葡萄细胞分裂素响应调节因子VlRR5的克隆与表达分析.pdf

园艺学报 2021 48 8 1437 1445 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0668 http www ahs ac cn 1437 收稿日期 2021 02 23 修回日期 2021 06 07 基金项目 国家自然科学基金项目 31701893 32072517 国家重点研发计划项目 2018YFD1000105 河南省高校科技创新人才项 目 21HASTIT035 河南省高等学校青年骨干教师培养计划项目 No 81 河南省高校科技创新团队支持计划项目 21IRTSTHN021 洛 阳市科技发展计划项目 2101102A 通信作者 Author for correspondence E mail yuyihe 巨峰 葡萄细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 的克隆与表达分析 边 璐 郭大龙 于可可 韦同路 裴茂松 刘海楠 余义和 河南科技大学园艺与植物保护学院 河南洛阳 471023 摘 要 葡萄在生长发育过程中会出现 3 次落果高峰 巨峰 葡萄的落果现象更为严重 从 巨 峰 葡萄中克隆得到 1 个细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 该基因有 1 个磷酸受体结构域 REC 和 1 个 MYB 样 DNA 结合结构域 cDNA 全长 2 597 bp 编码 693 个氨基酸 定位在 4 号染色体上 亚细胞定位 在细胞核中 酵母转化试验中 转入 pGBKT7 VlRR5 的酵母菌可以在 SD Trp Ade His X Gal 缺陷型 培养基上正常生长且显蓝色 证明 VlRR5 具有转录激活活性 荧光定量 PCR 分析显示 VlRR5 的表达具 有组织特异性 在叶和茎中表达量较高 在幼果发育阶段呈现先升高后降低的趋势 并且在外源细胞分 裂素 CPPU 处理后表达量上升 在细胞分裂素合成抑制剂洛伐他汀处理后表达量下降 这些结果表明 VlRR5 可以响应外源细胞分裂素处理 在细胞分裂素介导葡萄坐果过程中发挥重要作用 关键词 葡萄 细胞分裂素 CPPU 细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 中图分类号 S 663 1 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2021 08 1437 09 Cloning and Expression Analysis of the Cytokinin Response Regulator VlRR5 in Kyoho Grapevine BIAN Lu GUO Dalong YU Keke WEI Tonglu PEI Maosong LIU Hainan and YU Yihe College of Horticulture and Plant Protection Henan University of Science and Technology Luoyang Henan 471023 China Abstract There are three fruit dropping peaks in grape growth and development Grape fruit dropping phenomenon is more serious in Kyoho grapevine In this study a cytokinin response regulator VlRR5 was cloned from Kyoho grapevine which has a phosphoric acid receptor domain REC and a MYB like DNA binding domain Sequence analysis revealed that cDNA of VlRR5 was 2 597 bp in length encoding 693 amino acids and located on chromosome 4 of grape Subcellular localization assay showed that VlRR5 was localized in the nucleus The yeast transed into pGBKT7 VlRR5 could grow normally and turn blue on SD Trp Ade His X Gal deficient medium which proved that VlRR5 was a transcription factor with transcriptional activation activity By quantitative real time PCR analysis VlRR5 was characterized by tissue specific expression and showed high expression level in leaf and stem which was Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1438 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 increased and then decreased in the development stage of young fruit The expression level increased after treatment with exogenous cytokinin and decreased after treatment with the cytokinin synthesis inhibitor lovastatin These results indicated that VlRR5 can respond to cytokinin and plays an important role in participating in cytokinin to improve the fruiting rate of grape Keywords grapevine cytokinin CPPU cytokinin response regulators VlRR5 葡萄 Vitis vinifera L 作为世界性第二大水果被广泛地种植和加工利用 为人类创造了明显的 经济 生态和社会效益 Yu et al 2019a 鲜食葡萄中以巨峰系葡萄栽培面积最为广泛 巨峰系葡 萄品种存在较严重的落花落果现象 尤其是盛花后 8 9 d 为第 1 次生理落果期 有些植株落果率高 达 50 CPPU N 2 chloro 4 pyridyl N phenylurea 是一种细胞分裂素类的植物生长调节剂 具有显 著促进植物根 茎 叶生长的作用 CPPU 不仅能促进葡萄等果实膨大 提高其产量 也有促进坐 果的作用 并且可以促进果实早熟 樊彪和赵江哲 2017 植物体内细胞分裂素主要是通过一种类似于细菌中双元组分系统的途径将信号传递至下游元 件的 梁朋 等 2002 主要分为 3 个部分 首先是细胞分裂素受体组氨酸激酶 histidine kinase HK 与细胞分裂素结合后自磷酸化 并将磷酸基团由激酶区的组氨酸转移至信号接收区的天冬氨酸 接着天冬氨酸上的磷酸基团被传递到胞质中的磷酸转运蛋白 histidine phosphotransfer protein HP 上 磷酸化的 HP 进入细胞核并将磷酸基团转移到 A 型和 B 型反应调节因子 response regulator RR 上 进而调节下游的细胞分裂素 Sheen 2002 Schaller et al 2011 Ramireddy et al 2013 RR 是细胞分裂素信号传导途径中能够参与磷酸基团的转移进而调节下游细胞分裂素反应基因表达 的关键基因 RR 在参与植物生长发育 昼夜节律等发挥重要作用 在拟南芥中 A 型 ARR7 和 ARR15 与生长素信号相互作用 在干细胞特化过程中起重要作用 Hua et al 2012 ARR4 参与调节拟南 芥的昼夜节律 直接调节 phyB 的活性状态 正向调节红光信号 Salom et al 2005 最近有研究 表明 拟南芥中 ARR16 通过抑制细胞分裂素信号来控制雌蕊的生长 Reyes Olalde et al 2017 在 水稻中 独脚金内酯突变体中细胞分裂素含量明显升高 编码细胞分裂素氧化酶基因 OsCKX9 的表 达会促进细胞分裂素降解 通过 1 个 A 型细胞分裂素响应因子 OsRR5 调控幼苗的分蘖 株高和穗 大小 Duan et al 2019 除此之外 RR 在植物非生物胁迫中也起重要作用 在拟南芥中 EIN3 通 过直接与启动子中的特异区域来负调控冷相关基因 CBF 和 A 型 ARR5 ARR7 ARR15 过表达这些 ARR 基因会增强植物的耐寒性 这些结果说明乙烯对冷信号的负调控至少部分是通过 EIN3 对冷调 控的 CBF 和 A 型 ARR 基因的直接转录调控实现的 Huang et al 2018 前期对 巨峰 葡萄花序进行 CPPU 处理 在果实发育的不同时期采样然后进行转录组测序 通过转录组分析发现不同时期处理与对照之间的差异基因中包括很多被注释为双元信号感受器 two component response regulator 的基因 本研究中 克隆了该家族中的 1 个成员 VlRR5 VIT 04s0008g05900 t01 通过荧光定量测定该基因在 巨峰 葡萄不同组织 不同发育时期幼果的表达 情况 通过亚细胞定位和酵母单杂交试验明确 VlRR5 是否是 1 个具有转录激活活性的转录因子 初 步分析 VlRR5 的表达特异性和参与响应细胞分裂素调控葡萄幼果发育的作用 这些研究一方面可为 研究细胞分裂素影响葡萄坐果的分子机制打下基础 也为其他果实坐果分子机制提供理论参考 另 一方面为生产中合理使用 CPPU 提供理论依据 边 璐 郭大龙 于可可 韦同路 裴茂松 刘海楠 余义和 巨峰 葡萄细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 的克隆与表达分析 园艺学报 2021 48 8 1437 1445 1439 1 材料与方法 1 1 植物材料及其处理 以河南省洛阳市偃师市葡萄栽培基地 东经 112 79 北纬 34 73 海拔 135 m 的 巨峰 葡 萄作为试验材料 分别用 10 mg L 1 CPPU 加 Silwet 77 表面活性剂 终浓度 0 03 体积比 和 40 mmol L 1 细胞分裂素合成抑制剂洛伐他汀 Lov 做浸蘸花序处理 以清水加 Silwet 77 表面活 性剂 终浓度 0 03 处理为对照 处理时间为盛花后 5 d 2018 年 5 月 25 日 浸蘸 10 s 于 2018 年 5 月 25 26 27 29 日和 6 月 2 日采样 并于 2018 年 5 月对葡萄不同组织 根 茎 叶 花序 卷须 进行采样 采样后迅速置于液氮速冻 后在 80 超低温冰箱保存备用 1 2 RNA 的提取和荧光定量试验 使用 RNA prep 纯植物试剂盒 天根 北京 中国 提取总 RNA 总 RNA 用 RNase free DNase 处理 TaKaRa 去除基因组的 DNA 污染 用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 合成 cDNA 第 1 链 用 SMARTer TM RACE cDNA Amplification Kit 进行反转录 使用 SYBR Premix Ex Taq TaKaRa 和基因特异引物 表 1 在 Bio Rad IQ5 Real Time PCR 检测系统 Bio Rad Laboratories Hercules CA USA 进行 qRT PCR Yu et al 2019b 1 3 基因克隆及载体构建 以 巨峰 葡萄总 RNA 反转录的 cDNA 产物为模板 用 VlRR5 特异引物 表 1 进行 PCR 将 PCR 产物在 1 的琼脂糖凝胶上进行电泳 观察条带位置正确后在特异引物上添加同源接头合成 新的引物 表 1 用新合成的引物再次进行 PCR 将 PCR 产物进行凝胶电泳 用胶回收试剂盒切 胶回收 对亚细胞定位载体 酵母单杂交载体 用限制性核酸内切酶酶切 用同源重组试剂盒把线 性化载体和胶回收产物进行同源重组 进行大肠杆菌转化 挑选阳性克隆摇菌 菌液 PCR 检测 表 1 引物列表 Table 1 List of primers 引物名称基因 Primer 碱基序列 5 3 Primer sequence QT VlRR5 F TGGGTATGCATTGCCTTTCT R GAAGAAGGAAGCTCTGCGTTT VlRR5 F ATGACAGTTGAACCGAGGGT R TTAATGGAAAAGAACTTGAT Y1H RR5 F ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGACAGTTGAACCGAGGGT R ATGCGGCCGCTGCAGGAATTCTTAATGGAAAAGAACTTGAT LS RR5 F AGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGACAGTTGAACCGAGGGT R CTTCTCCCTTACCCATGGTACCTTAATGGAAAAGAACTTGAT 1 4 VlRR5 的生物信息分析 在 Ensembl Plants 数据库中下载 VlRR5 序列 将 VlRR5 蛋白质序列在 NCBI 数据库中进行 Blast 用 ClustalX 对氨基酸序列进行比对 用 MEGA7 做系统进化树分析 用 ExPASy 网站 https web expasy org cgi bin compute pi pi tool 分析氨基酸序列 蛋白质分子量和等电点 用 ExPASy 网站上 的 PROSITE https prosite expasy org 预测保守结构域 用在线网站 PlantCARE http bioinatics psb ugent be webtools plantcare html 预测 VlRR5 的顺式作用元件 Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1440 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 1 5 亚细胞定位 将 pBI121 VlRR5 GFP 转化至大肠杆菌中 以 pBI121 GFP 作为阴性对照 挑选阳性克隆摇菌 大量抽提质粒 纯化质粒 包埋金粉 点于微粒载膜中央 用基因枪对洋葱表皮进行转化 在高渗 培养基上培养过夜 转至等渗培养基培养 24 h 在激光共聚焦显微镜下观察荧光 1 6 酵母单杂交 将 pGBKT7 空载体 阴性对照 以 pGBKT7 GAL4 阳性对照 pGBKT7 VlRR5 分别转化至 AH109 酵母菌株中 分别涂布在 SD Trp SD Trp Ade His SD Trp Ade His X Gal 缺陷型培 养基上 避光放置在 30 恒温培养箱中 2 3 d 观察酵母菌生长情况 2 结果与分析 2 1 VlRR5 的克隆及其生物信息 从 EnsmblPlants 数据库中下载 VlRR5 的序列 设计特异引物 以从 巨峰 葡萄幼果中提取的 RNA 反转录成的 cDNA 为模板 通过 PCR 扩增得到 VlRR5 全长序列 序列分析发现 VlRR5 全长 2 597 bp 编码 693 个氨基酸 蛋白质理论等电点为 5 97 保守结构域预测发现在 VlRR5 的 19 134 位具 有 1 个磷酸接收结构域 REC 在 201 260 位具有 1 个 MYB 样的 DNA 结合域 将 VlRR5 与拟 南芥 水稻 苹果等物种的 RR 转录因子氨基酸序列进行比对 图 1 进一步确定 图 1 VlRR5 和其他物种 RR 氨基酸序列比对 A 磷酸接收结构域 REC B MYB 样 DNA 结合域 Pan 糙叶山麻黄 Md 苹果 Os 水稻 At 拟南芥 Fig 1 Amino acid sequence alignment of VlRR5 and other species RRs A Phosphoric acid receptor domain REC B MYB like DNA binding domain Pan Parasponia andersonii Md Malus domestica Os Oryza sativa At Arabidopsis thaliana 对 VlRR5 启动子进行顺式作用元件分析 结果 表 2 显示 VlRR5 的启动子区含有光响应 生 长素 脱落酸 茉莉酸和水杨酸响应元件 将 VlRR5 与 Blast 得到的同源序列进行比对 利用 MEGA 制作进化树 图 2 VlRR5 与拟南 芥 ARR12 At2g25180 1 同源性为 81 与蓝果树 NsRR5 F0562 007419 1 同源性为 55 通过 STRING 分析可以发现 VlRR5 与葡萄中 10 个蛋白互作关系较高 其中 VIT 06s0080g00060 VIT 14s0030g00410 VIT 04s0008g00210 VIT 05s0020g02210 VIT 07s0104g00880 VIT 09s0002 g03520 VIT 13s0074g00740 VIT 09s0002g06960 均被 GO 注释为具有组氨酸磷酸转移激酶活性 结合组氨 边 璐 郭大龙 于可可 韦同路 裴茂松 刘海楠 余义和 巨峰 葡萄细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 的克隆与表达分析 园艺学报 2021 48 8 1437 1445 1441 酸激酶 参与细胞分裂素激活信号途径 磷酸信号转导系统 VIT 14s0030g02200 被注释为与激酶 结合 具有蛋白质异二聚活性 参与细胞对葡萄糖 脱落酸和饥饿的响应 以及对昼夜节律的响应 而 VIT 03s0091g00290 被注释为具有 DNA 结合能力和金属离子结合能力 表 2 VlRR5 启动子区域的顺式作用元件 Table 2 The cis acting elements in promoters of VlRR5 顺式作用元件 cis acting element 功能 Function 序列 Sequence 数量 Amount gGTAAAGAAA 脱落酸响应 Abscisic acid responsiveness ACGTG 1 ARE 厌氧诱导 Anaerobic induction AAACCA 3 AuxRR core 生长素响应 Auxin responsiveness GGTCCAT 1 CAT box 分生组织表达 Meristem expression GCCACT 1 CGTCA motif 茉莉酸甲酯响应 MeJA responsiveness CGTCA 2 G box 光响应 Light responsiveness TACGTG 2 MBS 参与干旱诱导的 MYB 结合位点 MYB binding site involved in drought inducibility CAACTG 9 Pc CMA2a 光响应元件的一部分 Part of a light responsive element CAGCCAATCACAG 1 TATA box 在转录开始 30 左右的核心启动子元件 Core promoter element around 30 of transcription start TATA 5 TCA element 水杨酸响应 Salicylic acid responsiveness TCAGAAGAGG 1 TGACG motif 茉莉酸甲酯响应 MeJA responsiveness TGACG 2 CAAT box 启动子和增强子区域的顺式作用元件 Common cis acting element in promoter and enhancer regions CAAAT 49 图 2 VlRR5 与其他物种 RR 蛋白质的进化树分析 St 马铃薯 Sl 番茄 Os 水稻 Tt 唐松草小银莲花 Nn 莲 At 拟南芥 Ns 蓝果树 Ac 中华猕猴桃 Cs 茶 Cm 香瓜 Cf 川黔千金榆 Pan 山黄麻 Zj 枣 Md 苹果 Pd 扁桃 Pa 欧洲甜樱桃 Fig 2 Phylogenetic tree of VlRR5 and RR proteins of other species St Solanum tuberosum Sl Solanum lycopersicum Os Oryza sativa subsp japonica Tt Thalictrum thalictroides Nn Nelumbo nucifera At Arabidopsis thaliana Ns Nyssa sinensis Ac Actinidia chinensis var chinensis Cs Camellia sinensis Cm Cucumis melo Cf Carpinus fangiana Pan Parasponia andersonii Zj Ziziphus jujuba Md Malus domestica Pd Prunus dulcis Pa Prunus avium 2 2 VlRR5 亚细胞定位和转录激活活性分析 构建 pBI121 VlRR5 GFP 亚细胞定位重组质粒 用基因枪法将其瞬时表达于洋葱表皮 在激光 共聚焦显微镜下观察 发现 VlRR5 定位在细胞核中 图 3 Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1442 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 图 3 VlRR5 的亚细胞定位 Fig 3 Analysis of the localization of the VlRR5 protein 为了解 VlRR5 在参与细胞分裂素调控葡萄坐果中是否发挥转录因子的作用 VlRR5 连接到 pGBKT7 载体转化至酵母细胞 结果 图 4 显示转入 pGBKT7 VlRR5 pGBKT7 GAL4 以及 pGBKT7 空载体的酵母菌可以在 SD Trp 培养基上生长 转入 pGBKT7 VlRR5 pGBKT7 GAL4 的酵母菌可 以在 SD Trp His Ade 缺陷型培养基上正常生长 而转入 pGBKT7 空载体的酵母菌不能在此缺陷型 培养基上生长 同样的 转入 pGBKT7 VlRR5 pGBKT7 GAL4 的酵母菌可以在 SD Trp His Ade X Gal 缺陷型培养基上生长且显蓝色 而转入 pGBKT7 空载体的酵母菌不能在 SD Trp His Ade X Gal 缺陷型培养基上生长 2 3 VlRR5 的表达特性及其对外源细胞分裂素 CPPU 的响应 荧光定量 PCR 结果 图 5 显示 VlRR5 在葡萄叶片中表达量最高 其次是茎 而在花序和果 实中的表达量较低 用 CPPU 对葡萄花序处理 从表型 图 6 A 可以明显看出对照在处理后 4 和 8 d 落果严重 而 CPPU 处理后落果较少 处理后 1 d VlRR5 的表达量与对照相比无差异 处理 后 2 和 4 d 显著高于对照 总体呈现先升高后降低的趋势 4 d 时达到峰值 图 6 B 图 4 VlRR5 的转录激活活性检测 Fig 4 Transcriptional activation assay of the VlRR5 图 5 VlRR5 的表达特异性分析 Fig 5 Diverse expression patterns of VlRR5 边 璐 郭大龙 于可可 韦同路 裴茂松 刘海楠 余义和 巨峰 葡萄细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 的克隆与表达分析 园艺学报 2021 48 8 1437 1445 1443 图 6 CPPU 处理后葡萄表型 A 及 VlRR5 表达水平 B Fig 6 Grape phenotype A and VlRR5 expression level B after CPPU treatment 0 05 为进一步确认 VlRR5 受细胞分裂素诱导影响葡萄坐果 用细胞分裂素合成抑制剂 Lov 对葡萄花 序进行处理 与对照相比在处理后 4 8 d 落果严重 果穗松散 图 7 A 在 Lov 处理后 1 2 8 d VlRR5 的表达量与对照相比无差异 处理后 4 d 显著低于对照 图 7 B 图 7 细胞分裂素合成抑制剂 Lov 处理后葡萄表型 A 及 VlRR5 的表达水平 B Fig 7 Grape phenotype A and VlRR5 expression level B after inhibitors of cytokinin synthesis Lov treatment 0 05 3 讨论 细胞分裂素响应因子是细胞分裂素信号传导途径中的关键因子 姚继芳 等 2019 虽然生产 上细胞分裂素已经广泛用于提高葡萄的坐果率 但是细胞分裂素响应因子在其中发挥的作用尚不明 确 在拟南芥中 细胞分裂素响应调节因子可以分为 3 类 A 型 ARR B 型 ARR 以及由 ARR22 和 ARR24 组成的第 3 类 B 型 ARR 除了具有信号接收结构域外 还具有 1 个长长的 C 末端 包含 1 个 MYB 样 DNA 结合结构域 GARP 结构域 A 型 ARR 具有 1 个信号接收结构域和一小段的 N Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1444 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 末端和 C 末端 缺少 DNA 结合域 Wallmeroth et al 2019 本研究中在 巨峰 葡萄中克隆得到 1 个细胞分裂素响应调节因子 VlRR5 结构域分析发现 VlRR5 具有 1 个磷酸接收结构域 REC 和 1 个 MYB 样的 DNA 结合域 这表明 VlRR5 是 1 个 B 型 RR 基因 VlRR5 定位于细胞核 且具有转录激活活性 说明 VlRR5 是 1 个转录因子 这与前人研究成果是 一致的 在拟南芥中 B 型 ARR 基因缺失或者 A 型 ARR 基因过表达的植株表现出和细胞分裂素受体 功能缺失突变体相似的表型 表明 B 型 ARRs 是一类转录因子 为细胞分裂素的正调控因子 Nguyen et al 2016 这暗示了 VlRR5 作为 1 个 B 型 RR 转录因子在响应细胞分裂素过程中起正调控作用 VlRR5 在葡萄茎中表达量较多 而在小麦中 TaARR1 主要在根和叶中表达 Yang et al 2019 PtRR 和 PtRR10 12d 在杨树根部 形成层 木质部表达量相对较高 在草莓中 B 型 FvRR8 FvRR9 FvRR10 和 FvRR13 均有组织特异性表达 并且在草莓的根 匍匐茎中表达较多 Yang et al 2016 这证明 VlRR5 与其他物种中的 RR 转录因子一样具有组织特异性 在受到外源细胞分裂素处理后 VlRR5 的表达被迅速诱导 且在处理后 2 4 d 与对照显著差异 B 型 RR 基因表现出对外源细胞分裂素的响应 如在苹果中 6 BA 处理后 B 型 MdRRB2 3 MdRRB11 MdRRB5 MdRRB10 基因的表达量受到诱导 Li et al 2017 在梨中 CPPU 处理后 B 型 PpRR3 PpRR6 PpRR7 PpRR8 的表达量均上调 并且随着时间的推移出现先上升后降低的趋势 Ni et al 2017 以上结果表明 VlRR5 同其他 B 型 RR 转录因子一样会受到细胞分裂素诱导 同时 VlRR5 的表达量在细胞分裂素合成抑制剂 Lov 处理后 4 d 显著低于对照 从侧面进一步证明了这一结果 CPPU 处理后 4 d 开始 对照组落果严重 在细胞分裂素合成抑制剂 Lov 处理后 4 d 开始 落果更为 严重 说明处理后 4 d 盛花后 9 d 是 VlRR5 响应细胞分裂素提高葡萄坐果率的关键时期 References Duan J Yu H Yu an K Liao Z Meng X Jing Y Liu G Chu J Li J 2019 Strigolactone promotes cytokinin degradation through transcriptional activation of CYTOKININ OXIDASE DEHYDROGENASE 9 in rice Proceedings of the National Academy of Sciences 116 28 14319 14324 Fan Biao Zhao Jiangzhe 2017 Research progress of cytokinin and its application in crop production Zhejiang Agricultural Sciences 58 8 1411 1414 in Chinese 樊 彪 赵江哲 2017 细胞分裂素研究进展及其在作物生产中的应用 浙江农业科学 58 8 1411 1414 Hua D Wang C He J Liao H Duan Y Zhu Z Guo Y Chen Z Gong Z 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